03 - Técnicas para Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida

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Técnicas para Diagnóstico Precoce
das Infecções por Leveduras
do Gênero Candida
3
Claudete Rodrigues Paula • Luciana da Silva Ruiz
As peculiaridades apresentadas por dife-
rentes espécies de Candida spp., do ponto de
vista epidemiológico, justificam a necessidade
de identificarem-se as leveduras ao nível de
espécie quando tais micro-organismos estão
associados a doenças sistêmicas. A identifica-
ção de leveduras é etapa fundamental para a
monitorização das taxas de infecção hospita-
lar, bem como para a identificação precoce de
surtos de infecções por Candida.
Além disso, certas espécies são comum ente
associadas a resistência antifúngica. Resistên-
cia a anfotericina B tem sido demonstrada em
C. lusitaniae e em outras espécies de Candida
tais como C.guilliermondii, C. inconspicua, C.
kefyr e C. rugosa. Adicionalmente, resistência
a azóis (como por exemplo o fluconazol) tem
sido demonstrada repetidamente em C. gla-
brata e C. krusei, bem como uma resistência
adquirida em C. dubliniensis. Uma suscetibi-
lidade reduzida aos novos antifúngicos (como
por exemplo as equinocandinas) também
tem sido observada em espécies tais como C.
guilliermondii e C. parapsilosis. Assim, para
assegurar uma terapia rápida e adequada,
bem como a descrição e notificação de novos
patógenos emergentes, é imperativo que as le-
veduras sejam identificadas acuradamente ao
nível de espécie. Infecções por Candida spp.
estão associadas a altos níveis de morbidade e
mortalidade; assim, uma identificação preco-
ce pode contribuir para o sucesso terapêutico,
resolução da infecção e subsequente redução
de possíveis surtos.
MÉTODOS CONVENCIONAIS PARA
IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS DO
GÊNERO CANDIDA
o diagnóstico convencional das infecções por
leveduras do gênero Candida é baseado clas-
sicamente na microscopia direta de elementos
fúngicos no material biológico, seguida pelo
isolamento em cultura, permitindo a realiza-
ção da análise micromorfológica (microculti-
vo em lâmina), pesquisa de tubo germinativo
Técnicas para Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida
(efeito de Reynolds-Braude) e testes bioquí-
micos.
A microscopia direta em material biológico
é utilizada para a observação de elementos
fúngicos como blastoconídios e pseudo-hifas,
onde esfregaços do material analisado são
corados pelo método de Gram, permitindo se-
parar as leveduras das bactérias e de outros
micro-organismos (Fig. 3.1). Estruturas fún-
gicas mostram-se Gram-positivas. Quando a
pesquisa de fungos é realizada em material
de pelo, pele, unha ou secreção respiratória,
prefere-se a utilização de reagente digestor e
clarificante (potassa) (Fig. 3.2).
No entanto, o exame direto não permite a
identificação do gênero e espécie da levedura.
Fig. 3.1 Candidíase. Coloração pelo Gram.
Fig. 3.2 Candidíase. Pseudofilamentação. KOH.
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Dessa forma, todo material biológico deve ser
processado para o isolamento do micro-orga-
nismo em cultura, que possui maior sensibili-
dade, além de permitir identificação ao nível
de espécie a partir de técnicas adequadas.
Para o isolamento de leveduras de material
biológico, pode-se utilizar o ágar Sabouraud-
dextrose com cloranfenicol (Fig. 3.3) (ampla-
mente empregado), o Brain Heart Infusion
(BHI), e em casos de suspeita de contamina-
ção por mais de uma levedura é recomendado
o plaqueamento em meio cromogênico especí-
fico (CHROMagar Candida'").
O microcultivo em lâmina é empregado
para o conhecimento da micromorfologia da
levedura. As características do pseudomicélio,
pseudo-hifa, hifa verdadeira, forma e dispo-
sição dos blastoconídios, presença ou não de
clamidoconídios, permitem, quando associa-
dos ao comportamento fisiológico, a diferen-
ciação das espécies (Fig. 3.4). A produção de
tubos germinativos após duas a três horas de
incubação, a 37°C, em soro, plasma ou clara de
ovo,é um método eficiente na identificação rá-
pida de C. albicans e C.dubliniensis (Fig. 3.5).
A prova de termotolerância a 42°C e 45°C é
empregada para separar as duas espécies. C.
albicans cresce a essas temperaturas, porém
o mesmo não ocorre para C. dubliniensis.
Nos testes bioquímicos para caracterização
do perfil metabólico dos isolados fúngicos, são
Fig. 3.3 Candidíase. Cultura - ágar Sabouraud-dextrose.
Aspecto macroscópico.
18 Técnicaspara Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida
observadas a utilização de compostos de car-
bono por fermentação (zimograma) e a assi-
milação de fontes de carbono e do nitrogênio
(auxanograma). A fermentação de açúcares
indica a produção de gás, uma vez que no final
desse processo metabólico as leveduras pro-
duzem álcool e CO2. Essas provas são padro-
nizadas pelo uso de tubos coletores (tubos de
Durham) de gases (Fig. 3.6). Na assimilação
é observado o aumento de células leveduri-
formes em meio completo que contenha um
determinado composto como única fonte de
carbono ou nitrogênio (Fig. 3.7).
Fig. 3.4 Candidíase. Microcultivo. Candida a/bicans.
Fig. 3.5 Candida a/bicans. Tubo germinativo: levedura +
soro fetal bovino (2 horas - 37°C).
Ressalta-se que é de extrema importância
realizar o controle de qualidade do próprio la-
boratório por meio de intercâmbios com cen-
tros de referência e empregar cepas padrões
em todos os ensaios laboratoriais para ga-
rantir a eficiência da metodologia empregada
(Fig.3.8).
TUBO DE
DURHAM
++
Fig. 3.6 Candida spp. Zimograma - fermentação de açú-
cares.
Fig. 3.7 Candida spp. Auxanograma - prova de assimi-
lação.
Técnicas para Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida 19
Fluxograma de
Identificação de Candida albicans
Tubo germinativo
Soro fetal bovino
2 horas - 3JOC
Microcultivo
Ágar-fubá
Clamidosporo
Auxonograma
Assimilação C + N
Fermentação
de açúcares
Fig. 3.8 Candida a/bicans. Fluxograma de identificação.
MÉTODOS COMERCIAIS, MEIOS
CROMOGÊNICOS E PESQUISA DE
ANTíGENOS
Os métodos clássicos citados anteriormente
para identificação de patógenos levedurifor-
mes fazem uso de metodologias complexas e
que consomem tempo. O aumento na incidên-
cia de infecções leveduriformes tem estimula-
do o desenvolvimento de sistemas comerciais
automatizados e manuais acurados, facilitan-
do a rotina laboratorial. Há inúmeros siste-
mas comerciais disponíveis para identificação
de leveduras, tais como Auxacolor (Fig. 3.9),
Mycotube, Candifast, Microring YT (MYT;
Medical Wire & Equipment Co., Victory
Gardens, NJ), o ID 32C (BioMérieux, Marcy
l'Etoile, França) (Fig. 3.10), mais comumente
utilizado em países da Europa, e o API 20C
(BioMérieux Vitek, Inc., Hazelwood, Mo.)
(Fig. 3.11), um sistema de identificação de le-
vedura comumente utilizado nos EUA. Esses
produtos devem possuir as seguintes caracte-
rísticas: (i) identificação rápida e precisa de
leveduras isoladas de todos os tipos de espéci-
mes clínicos; (ii) facilidade na manipulação e
inoculação, permitindo o processamento rápi-
do de mais de um isolado; e (iii) habilidade na
identificação de isolados que são menos comu-
mente recuperados de espécimes clínicos.
Na maioria desses sistemas, o resultado é
liberado após 12 a 72 horas de processamento.
Podem ser completamente manuais ou semi-
automatizados. Os sistemas manuais utilizam
baterias de testes bioquímicos, acondiciona-
Fig. 3.9 Auxacolor'" (Sanofi Diagnostics-Pasteur) para
identificação de leveduras.
20 Técnicaspara Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida
Fig. 3.10 AutoMicrobic (BioMérieux-Vitek) - sistema
automatizado de identificação de leveduras.
Fig. 3.11 Sistema API20C AUX® (BioMérieux) para identi-
ficação de leveduras.
das em pequenas galerias, onde alíquotas do
inóculo padrão são dispensadas manualmen-
te, seguindo-se a incubação e a leitura. Os sis-
temas automatizados permitem a incubação e
a leitura automatizada dos testes, oferecendo
um relatório padrão com a leitura final dos
testes. De uma maneira geral, apresentam-se
efetivos na identificação de leveduras de in-
teresse médico, particularmente espécies de
Candida; no entanto, suaaplicação é algumas
vezes mais limitada na identificação acurada
de espécies mais raras.
A importância de uma rápida identifica-
ção de patógenos, principalmente no contex-
to hospitalar, possivelmente tem contribuído
para o desenvolvimento de meios diferenciais
para a identificação presuntiva de levedu-
raso Esses meios baseiam-se na formação de
diversas colorações coloniais com diferentes
morfologias, as quais resultam da clivagem de .
substratos cromogênicos por enzimas espécie-
específicas. Diferentes meios cromogênicos
para isolamento e identificação de espécies
de Candida estão disponíveis, tais como Albi-
cans ID (França), Albicans ID2 (BioMérieux),
Candida diagnostic agar (PPR Diagnostics
Ltd., Londres, RU), CandiSelect (Sanofi Diag-
nostic-Pasteur, Marnes-la-Coquette, França),
Chromoalbicans (Biolife Italiana Srl, Milão,
Itália) e CHROMagar Candida (CHROMagar
Microbiology, Paris, França).
O meio de cultura CHROMagar Candida
tem sido utilizado, com resultados bem-suce-
didos, para isolar e identificar presuntivamen-
te C.albicans (colônias verde-claras), C.hrusei
(colônias rosas), C. tropicalis (colônias cinza-
azuladas) (Fig. 3.12). Esse meio baseia-se na
utilização do substrato ~-glicosaminidase e
diferencia as leveduras de acordo com a mor-
fologia e a cor das colônias. A utilização desse
meio facilita a detecção e a identificação des-
sas leveduras e, também, fornece resultados
presuntivos em menor tempo que os obtidos
pelos métodos convencionais. Atualmente,
Fig. 3.12 CHROMagar Candida'": C. a/bicans (verde) e
C. tropicalis (azul).
Técnicas para Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida
o meio cromogênico CHROMagar Candida
também tem sido utilizado por vários pesqui-
sadores na Europa e EUA para investigar a
colonização oral por C. dubliniensis, uma vez
que a coloração verde-escura de colônias so-
bre esse meio foi descrita comoum marcador
fenotípico dessa espécie.
Além da utilização na identificação presun-
tiva de espécies de Candida, os meios de culti-
vo diferenciais também podem ser utilizados
para a pureza e separação de diferentes espé-
cies de um mesmo material biológico,porém
nunca para uma identificação definitiva.
No entanto, o diagnóstico laboratorial de
infecções por leveduras, utilizando metodo-
logias convencionais, comerciais ou presunti-
vas, nem sempre fornece resultados positivos,
quer pela falta de sensibilidade dos métodos
empregados, por falhas técnicas ou devido a
longos períodos exigidos para obtenção dos
resultados. Nesses casos, as técnicas soroló-
gicas, que detectam anticorpos específicos ou
antígenos circulantes são de grande auxílio
no diagnóstico dessas patologias, bem como
no acompanhamento de pacientes sob trata-
mento antifúngico. No entanto, os resultados
apresentados pela sorologia devem ser cui-
dadosamente avaliados, pois a positividade
nem sempre confirma a infecção, e resultados
negativos não descartam a possibilidade de
infecção pelo fungo.
Os testes sorológicos que detectam anti-
corpos mostram um valor preditivo relativa-
mente baixo, devido principalmente a falta de
sensibilidade; valor diagnóstico limitado em
pacientes com comprometimento da imunida-
de humoral; além disso, esses testes não são
capazes de diferenciar pacientes com a doen-
ça sistêmica de pacientes colonizados ou com
candidemia transitória. Algumas técnicas
empregadas para a detecção de anticorpos
específicos são imunodifusão dupla, contrai-
munoeletroforese e aglutinação de partículas
de látex.
Nos últimos anos, vários estudos vêm sen-
do realizados com o objetivo de desenvolver
técnicas para a detecção de antígenos de
Candida spp. Os antígenos detectados são a
21
manana, glicoproteínas e antígenos citoplas-
máticos.
A pesquisa de ~-1,3-glucana é a mais re-
comendada para leveduras do gênero Candi-
da. A ~-1,3-glucana é constituinte da parede
celular de muitos gêneros de fungos, podendo
sua presença ser detectada no soro de pacien-
tes infectados. O procedimento de detecção é
realizado através de sistemas comerciais pro-
duzidos nos EUA (Glucatell'") e Japão (Fungi-
tec-G Test Mk®).
Estudos de validação clínica do uso dessa
ferramenta diagnóstica ainda são poucos,mas
os resultados iniciais mostram-se pertinen-
tes; no entanto, mais estudos são necessários
para se determinar a relevância desses testes
na clínica, e estudos devem ser continuados
no sentido de se melhorar os seus níveis de
especificidade.
TÉCNICAS MOlECULARES NO
DIAGNÓSTICO DAS INFECÇÕES POR
lEVEDURAS
São várias as deficiências na habilidade de
diagnóstico precoce e correto das infecções
causadas por leveduras do gênero Candida.
Uma caracterização mais acurada dessas le-
veduras torna-se fundamental para que se
possam estabelecer possíveis elos entre as
fontes de infecções,via de transmissão e gêne-
se dos processos recorrentes, além de permtir
a escolha da terapia adequada, uma vez que
novos agentes antifúngicos com diferentes
atividades junto a várias espécies de Candida
vêm sendo desenvolvidos.
Osmétodos clássicosde identificação basea-
dos em propriedades fenotípicas têm resolu-
ção limitada, pois muitos grupos de leveduras
revelam poucas variações morfológicas; além
disso, consomem um certo tempo desde o iso-
lamento até o diagnóstico definitivo. O adven-
to da biologia molecular tem fornecido novos
instrumentos para os taxonomistas, ajudan-
do-os a solucionar complexos agrupamentos
taxonômicos. Métodos moleculares sensíveis
e específicos são ferramentas laboratoriais
22 Técnicaspara Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida
desejáveis não apenas para o diagnóstico pre-
coce de infecções fúngicas mas também para a
monitorização da resposta terapêutica.
Vários métodos moleculares têm sido de-
senvolvidos para a identificação de Candi-
da spp., destacando-se o RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) (Fig. 3.13) e
métodos baseados na PCR (polimerase chain
reaction) como RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) (Fig. 3.14), já detalhados
no capítulo anterior (Importância das Leve-
duras nas Infecções Nosocomiais). Entre eles,
aqueles baseados na técnica de PCR emergi-
ram como uma tecnologia promissora devido
a sua simplicidade, especificidade e sensibili-
dade, bem como a sua habilidade para iden-
tificar espécies de Candida diretamente em
amostra biológica ou cultura.
Fig. 3.13 Gel de eletroforese - RFLP,técnica molecular uti-
lizada para a identificação de leveduras.
Fig. 3.14 Gel de eletroforese - RAPD, técnica molecular
utilizada para a identificação de leveduras.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é
uma técnica altamente sensível por meio da
qual diminutas quantidades de sequências de
DNA ou RNA específicas podem ser enzimati-
camente amplificadas a uma extensão tal que
uma quantidade suficiente de material fica
disponível para alcançar o limiar do "sinal"
para detecção. A técnica pode ser utilizada
para detectar quantidades muito pequenas
de ácido nucleico específico em amostras bio-
lógicas nas quais se considera que micro-
organismos têm função de agentes causado-
res. A base fundamental dessa tecnologia é
que cada agente de uma doença infecciosa
possui sequência característica própria, em
sua composição de DNA ou RNA, pela qual
pode ser identificado.
O sucesso da PCR depende da qualidade do
DNA fúngico extraído, que deve ser obtido de
uma cultura pura. Na detecção do micro-orga-
nismo diretamente no material clínico, sem
cultura prévia, deve haver uma maior sofis-
ticação na extração do DNA para que possam
ser removidos os inibi dores de PCR que estão
presentes nos tecidos e fluidos corpóreos.
Embora a teoria básica da PCR e da am-
plificação gênica seja relativamente simples,
numerosos problemas técnicos impedem seu
uso na rotina de laboratórios clínicos. Um dos
principais problemas é a reação falso-positiva
causada pela introdução de ácidos nucleicos
contaminantes durante o processamento da
técnica. Essa contaminação pode ser origina-
da por "contaminação cruzada" em uma única
amostra contendo um grande númerode mo-
léculas-alvo; por contaminação de reagentes;
por DNA derivado de amostras previamente
analisadas e por acúmulo, no laboratório, de
produtos de PCR devido a repetida amplifi-
cação do mesmo alvo. Poucos são os laborató-
rios que utilizam essa técnica, excetuando-se
os seletos laboratórios de pesquisa, equipados
com os aparelhos necessários para amplifica-
ção por PCR, devido ao custo elevado e à ne-
cessidade de espaço e de pessoal especializado
para o manuseio. Além disso, para ser usada
rotineiramente, a tecnologia de PCR ainda re-
quer uma melhor padronização inter- e intra-
Técnicas para Diagnóstico Precoce das Infecções por Leveduras do Gênero Candida
laboratorial. É preciso que sejam redigidos,
adotados e colocados em prática padrões na-
cionais para a realização d~ testes, provas de
proficiência e controles de qualidade e segu-
rança, antes que a técnica de PCR possa ser
realmente implantada em grande escala nos
laboratórios clínicos.
No diagnóstico de candidíase invasiva, há
grande variação de desempenho desses testes,
dependendo da metodologia utilizada, alvo de
amplificação para a reação de PCR, população
de pacientes estudada e, sobretudo, critérios
estabelecidos para o diagnóstico dessa mico-
se. De forma geral, a sensibilidade nos casos
de candidíase varia de 60% a 100%.
Enquanto os métodos moleculares ainda
necessitam ser otimizados antes de seu uso
rotineiro em laboratórios clínicos, no presente
eles já demonstram benefícios no auxílio da
terapia de pacientes e detecção de micro-orga-
nismos responsáveis por surtos hospitalares.
As ferramentas moleculares são utilizadas
com eficiência na diferenciação entre C. du-
bliniensis e C. albicans, bem como na identi-
ficação de leveduras em infecções da corrente
sanguínea.
Embora C. dubliniensis possua caracte-
rísticas morfológicas e bioquímicas similares
a C. albicans, o que torna difícil a distinção
fenotípica entre ambas, amostras de C. dubli-
niensis diferenciam-se por serem altamente
resistentes ao fluconazol, e os isolados sensí-
veis têm a capacidade de desenvolver resis-
tência à droga in vitro. Como resultado, uma
identificação rápida dessa espécie pode au-
xiliar na definição de uma terapia mais ade-
quada. Nesse contexto, técnicas moleculares,
principalmente aquelas baseadas na PCR,
vêm sendo úteis na identificação de isolados
fazendo o diagnóstico diferencial de infecções
por C. albicans.
A identificação de leveduras em culturas
positivas de sangue pelo uso de métodos feno-
típicos convencionais requer de um a vários
dias após o isolamento. Métodos moleculares
fornecem um grande potencial de redução no
tempo do resultado e uma sensibilidade de
até 96,9%.
23
Uma identificação rápida e correta de le-
veduras patogênicas é de fundamental im-
portância no fornecimento de um diagnóstico
precoce e eficiência terapêutica, principalmen-
te se o isolado estiver relacionado a infecção
hospitalar. Tendo em vista as limitações dos
métodos fenotípicos em fornecer uma identifi-
cação rápida, técnicas moleculares passam a
constituir uma ferramenta diagnóstica mais
eficaz.
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