Introdução à Cromatografia

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Valmir F. Juliano 
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS 
CROMATOGRÁFICOS 
Princípios e Tipos de Cromatografia 
Histórico 
Cromatografia 
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), 
botânico russo: Separação de misturas de pigmentos 
vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e 
solventes variados. éter de 
petróleo 
CaCO3 
mistura de 
pigmentos 
pigmentos 
separados 
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego) 
Definição - Princípio Básico 
 
Cromatografia é um método físico-químico de 
separação de misturas, identificação e 
quantificação de seus componentes. 
• A separação depende da interação dos componentes da 
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. 
• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases 
é influenciada por diferentes forças intermoleculares, 
incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de 
afinidade e solubilidade. 
• A identificação se dá mediante a comparação da 
interação de padrões com as fases estacionárias. 
• A quantificação é feita também pela comparação com 
padrões de concentrações conhecidas, através de 
curvas analíticas. 
Cromatografia 
Componentes principais de um 
sistema cromatográfico: 
1) Fase Móvel (F.M.): é a fase que 
flui através da coluna e faz os 
componentes da amostra se 
moverem em direção ao final da 
coluna. É a fase que se desloca 
através da coluna. 
Componentes principais de 
um sistema cromatográfico: 
2) Fase estacionária (F.E.): é a fase 
fixa que reveste o interior da coluna 
ou está ligado a ela, é a fase que 
sempre permanece no sistema. 
Componentes principais de 
um sistema cromatográfico: 
3) Suporte: é componente no qual a fase 
estacionária está revestida ou ligada. 
Essa combinação de fase estacionária, 
fase móvel e suporte, e um 
equipamento associado compõe um 
dispositivo conhecido como 
cromatógrafo. 
Classificação das técnicas cromatográficas 
 
•1) De acordo com o sistema cromatográfico 
 
• Em Coluna 
• Cromatografia Líquida 
• Cromatografia Gasosa 
• Cromatografia Supercrítica 
 
• Planar 
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
• Cromatografia em Papel (CP) 
Cromatografia 
Classificação das técnicas cromatográficas 
 
• 2)De acordo com a fase móvel 
 
• Utilização de Gás 
• Cromatografia Gasosa (CG) 
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) 
 
• Utilização de Líquido 
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC) 
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
 
• Utilização de Gás Pressurizado 
• Cromatografia Supercrítica (CSC) 
Cromatografia 
Classificação das técnicas cromatográficas 
 
•3) De acordo com a Fase Estacionária 
 
• Líquida 
• Sólida 
• Quimicamente Ligadas 
 
• 4) De acordo com o modo de separação 
 
• Por Adsorção 
• Por Partição 
• Por Troca Iônica 
• Por Afinidade 
• Por Exclusão 
 
Cromatografia 
Classificação das técnicas cromatográficas 
Cromatografia 
Técnica Planar Coluna 
FM 
FE 
Líquido 
Líq Sól 
Gás Líquido 
Líq Sól 
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE 
Exclusão Fase 
Ligada 
Troca 
Iônica 
Sól Líq Afinidade 
Tipo de 
cromato-
grafia 
Cromatografia 
Princípio Básico 
Separação de misturas por interação diferencial dos seus 
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou 
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). 
Cromatografia em papel - CP 
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! 
Fase estacionária líquida suportada na celulose. 
Fase móvel 
Separação 
Cromatografia 
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos 
(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom 
exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível 
verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela. 
Cromatografia em papel - CP 
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! 
Cromatografia 
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem 
simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na 
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis. 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser 
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está 
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases 
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
Termos e parâmetros técnicos 
Cromatografia 
solvente
mancha
f ΔS
ΔS
R 
s
a
R
af

s
b
R
bf

s
c
R
cf

c 
b 
a 
s 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
FASES ESTACIONÁRIAS 
Sílica (SiO2) 
Alumina (Al2O3) 
Celulose 
Poliamida 
Ativação de 30 a 60 min 
de 105 a 110 oC 
Ativação de 10 min 
a 105 oC 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
ANÁLISE QUALITATIVA 
- Comparação com valores de Rf tabelados 
 
- Comparação com padrão eluído em conjunto 
 
- Extração e aplicação de métodos instrumentais 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
A B Após 
 Eluição 
Amostra não contém a espécie B 
Amostra pode conter a espécie A 
Para se certificar da presença, 
eluir em outros solventes 
Conclusões: 
Amostra 
Cromatografia 
Cromatografia de Camada Delgada - CCD 
Solvente 1 Solvente 2 
Cromatografia 
Bi-dimensional 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO 
Exclusão 
 
 
 
Adsorção 
 
 
Partição 
 
 
 
Troca Iônica 
 
Afinidade 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
ADSORÇÃO 
- Fase Móvel Líq. ou Gás 
- Fase Estacionária Sólida 
Processos de 
Adsorção/Dessorção 
Ligações de hidrogênio; 
Forças de Van der Waals 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
ADSORÇÃO 
Fase Estacionária Sólida: 
Polar 
Aumento da Atividade 
-CO2H > -OH > -NH2 > 
-SH > -CHO > -C=O > 
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH- 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < 
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < 
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < 
Acetato de Etila < Acetona < Etanol < 
Metanol < Ácido Acético 
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente 
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção 
tem sentido amplo: 
a) Função solvente 
• Solubilizar os componentes 
• Ter baixo ponto de ebulição 
b) Função eluente 
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna 
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE) 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Usos: 
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar 
reagentes e materiais obtidos em síntese. 
b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa 
e analítica. 
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de 
esteróides de urina ou de sangue, etc. 
ADSORÇÃO 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
PARTIÇÃO 
Fase Móvel Gasosa 
Fase Estacionária Líquida 
Processos de Solubilidade 
O processo de partição é 
intrafacial e a volta de cada 
componente para a fase móvel 
depende da sua volatilidade. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
PARTIÇÃO 
Fase Móvel Líquida 
Fase Estacionária Líquida 
Processos de Solubilidade 
O processo de partição é 
intrafacial e a volta de cada 
componente para a fase móvel 
depende da sua solubilidade. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
TROCA IÔNICAFase Móvel Líquida 
Fase Estacionária Sólida 
Processos de Troca Iônica 
Adsorção reversível e 
diferencial dos íons da fase 
móvel pelo grupo trocador 
da matriz 
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica 
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de 
extraordinário valor em processos analíticos. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Maior Interação 
• Íons de alta carga 
• Íons de menor tamanho 
TROCA IÔNICA 
Resinas Catiônicas 
e Aniônicas 
FE altamente carregada 
F
lu
x
o 
d
a 
F
M
 
A diferença de afinidade entre 
os íons da FM pode ser 
controlada por pH e força iônica 
• Ânions como - SO3
- ou cátions como - 
N(CH3)3
+ estão ligados covalentemente à 
fase estacionária sólida, geralmente uma 
resina neste tipo de cromatografia. Os íons 
de carga oposta do soluto são atraídos para 
a fase estacionária pela força eletrostática. 
A fase móvel é um líquido. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
TROCA IÔNICA 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
Fase Móvel Líquida 
Fase Estacionária em Gel 
Enquanto as partículas menores penetram nas 
cavidades, as maiores vão sendo eluídas 
contornando as estruturas moleculares da FE. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, 
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de 
cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado 
constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, 
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. 
- Separação de tamanhos específicos 
- Separação de polímeros e proteínas 
- Determinação de Massa Molar 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
• Esta técnica separa as moléculas por tamanho, com 
os maiores solutos passando por ela com maior 
velocidade. Não há interações atrativas entre a fase 
estacionária e o soluto no caso real de exclusão 
molecular. A fase móvel líquida passa pelo gel poroso. 
Os poros são pequenos o suficiente para excluírem as 
moléculas grandes do soluto , mas não as pequenas. 
O fluxo de moléculas grandes passa sem entrar nos 
poros. As moléculas pequenas levam mais tempo 
para passar pela coluna porque elas entram no gel e 
portanto devem passar por um volume maior antes de 
sair da coluna. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
Características 
desejáveis para os Géis 
-Inércia Química: 
Não pode haver uma interação 
química entre a matriz e o soluto. 
-Estabilidade: 
O gel deve suportar uso contínuo 
quanto mantido em condições 
brandas de temperatura e pH. 
-Baixo teor de íons: 
Grupos carregados interferem no 
processo de separação. 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
EXCLUSÃO 
Tipos de Géis 
Dextrano (Sephadex) 
Poliacrilamida 
Ágar e Agarose 
F
lu
x
o 
d
a 
F
M
 
Cromatografia 
Cromatografia em Coluna 
Fase Móvel Líquida 
Fase Estacionária Sólida 
Propriedades 
Biológicas e 
Funcionais 
AFINIDADE 
Cromatografia em Coluna 
AFINIDADE 
• Este tipo de cromatografia é mais 
seletivo de pois emprega interações 
específicas entre um tipo de molécula 
do soluto e uma segunda molécula que 
está ligada covalentemente 
(imobilizada) à fase estacionária. 
Cromatografia em Coluna 
AFINIDADE 
A molécula imobilizada pode ser um anticorpo 
para uma determinada proteína. Quando se 
passa pela coluna uma mistura contendo 
milhares de proteínas, somente a proteína 
que reage com o anticorpo se liga à coluna. 
Após a lavagem de todas as outras 
substâncias dissolvidas da coluna, a proteína 
desejada é expulsa através de mudança de 
pH ou da força iônica.