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Aula de Bioquímica Avançada Tema: Função de Proteínas: Mioglobina e Hemoglobina Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular – DQFM Instituto de Química de São Carlos – IQSC Universidade de São Paulo – USP E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br Proteínas Funções Transporte e Estoque; Catálise enzimática; Movimento; Suporte mecânico; Proteção imune; Sinalização intra e extracelular; etc. Variedade Funcional Diferentes Estruturas Tridimensionais Estrutura 3D Estrutura Estável em função do tempo Estabilidade versus flexibilidade Função versus Conformação. Como as Proteínas Funcionam Grande maioria → interação com outras moléculas Interações reversíveis → ligante (qualquer tipo de molécula, inclusive proteína); ***Natureza transitória das interações proteína-ligante*** ↓ VIDA ↓ RESPOSTA RÁPIDA E REVERSÍVEL A MUDANÇAS AMBIENTAIS E CONDIÇÕES METABÓLICAS SÍTIO DE LIGAÇÃO → Interação específica → Acoplada a uma mudança conformacional → ENCAIXE INDUZIDO *ENZIMAS: Substratos; Sítio catalítico ou Sítio ativo. Introdução Organismos aeróbicos Necessitam de suprimento de O2 constante Organismos multicelulares vertebrados - Desenvolvimento de sistema circulatório - Desenvolveram proteínas de transporte de O2 1 – Mioglobina músculo - mantém suprimento local de O2 2 – Hemoglobina sangue hemácias - Transporta O2 dos pulmões para os tecidos - Transporta CO2 e H3O+ dos tecidos para os pulmões Mioglobina versus Hemoglobina - São similares na Estrutura Primária, Secundária e Terciária - Ligam O2 de maneira muito similar - Em condições similares aos tecidos, a Hemoglobina está 7% saturada com O2 enquanto que a Mioglobina apenas 90% saturada - Hemoglobina liga O2 de maneira cooperativa e é uma proteína alostérica - Ambas são importantes proteínas-modelo de estudo Bioquímico Grupo Prostético = Heme A ligação O2 pelas globinas depende do grupo Heme Grupo Heme Protoporfirina + Fe2+ = responsável pela cor vermelha do sangue - Protoporfirina 4 anéis pirrólicos (anel tetrapirrólico) - 8 Cadeias Laterais = 4 metilas, 2 vinilas e 2 Ácidos Caboxílicos - Ferro é coordenado no centro pelos átomos de Nitrogênio dos 4 grupos Pirróis. Porfirina Heme Fe2+ Coordenação Hexagonal Holomioglobina Grupo heme está ligado à apoproteína: 1) pelo ocupação do Quinto ponto de coordenação do Fe2+ pela His proximal 2) Interações Hidrofóbicas do anel tetrapirrólico - Sexto ponto de coordenação do Fe2+ é ocupado pelo O2 - Na forma deoxi, a His Proximal retira o Fe2+ do plano central da porfirina Holomioglobina Grupo heme permite monitoramento: Holomioglobina 1º Proteína a ter a sua estrutura 3D resolvida - Estrutura em Hélices Alfa - Possui 153 resíduos de AA - Total de 8 hélices anfipáticas – nomeadas de A a H Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F - Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8) - Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7) Holomioglobina Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F - Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8) - Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7) A ligação O2–Fe2+ gera a transferência parcial de 1 elétron do Fe2+ para o O2 forma o íon superóxido O2- A His E7 estabiliza o O2 ligado ao Fe2+ por uma ligação de H; Evita a formação do íon superóxido; - O componente protéico estabiliza a reatividade do O2 Interação Proteína-Ligante pode ser quantificada Proteínas são capazes de interagir especificamente com ligantes A interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica Questões apresentadas 1) Qual é o máximo número de moles de ligante por proteína? 2) Qual é a constante de equilíbrio deste ligante por cada um dos sítios de ligação? 3) A constante de equilíbrio do L por cada um dos sítios é independente da ocupação dos demais? 4) A constante de equilíbrio do L é modificada pela presença de um segundo ligante? P + L PL k1 k2 Interação Proteína-Ligante pode ser quantificada A interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica k1 e k2 são as constantes de velocidade de associação e dissociação KA e KD são as constantes de equilíbrio no sentido de associação e dissociação KA é dado em (mol/L)-1 (M-1) Quanto maior o valor de KA maior a afinidade da interação PL KD é dado em mol/L (M) Quanto menor o valor de KD maior a afinidade da interação PL Quando a [L] é >>> [P] podemos considerar que a formação do PL não altera a [L] A fração de Sítios de ligação na P frente ao L pode ser descrita pela seguinte equação P + L PL k1 k2 A DAeq K K LP PL k kKK 1 ]][[ ][ 2 1 =∴=== ][][ ][ sDisponívei Sítios de Total Ocupados Sítios PPL PL + ==θ Interação Proteína-Ligante pode ser quantificada Θ pode ser monitorado e seu valor em função da [L] resulta numa hiperbólica retangular ][][ ][ PPL PL + =θ ]][[][ ]][[ ][ LPKPL LP PLK AA =∴= D A A A A A KL L K L L LK LK PLPK LPK + = + = + = + = ][ ][ 1][ ][ 1][ ][ ][]][[ ]][[θ Dividindo ambos os por [P] Dividindo ambos por KA D A K K = 1 Quando [L] = KD [L] onde metade dos sítios de ligação estão ocupados pelo Ligante Para 90% de saturação [L] = 9 x KD Substituindo [PL] Equilíbrio múltiplo Considerações gerais -n > 1 n n Aeq LP PL k kKK ]][[ ][ 2 1 === ∑ ∑ = == n i i n i i Ak Aik θ 0 1 1 1 ][ ][ Equação de Adair Se n = 1 Equilíbrio múltiplo Sítios equivalentes e independentes - Todos os ligantes interagem com a os seus sítios de ligação com a mesma afinidade. Uma das vias possíveis para a saturação de todos os sítios possíveis Equilíbrio múltiplo Sítios não-equivalentes - Sítios diferentes que ligam com diferentes afinidades K1 # K2 Curvas de saturação A: K1 = K2 = 1e6 M-1 B: K1 = K2 = 1e5 M-1 C: K1 = 1e6 M-1 e K2 = 1e5 M-1 D: K1 = 1e6 M-1 e K2 = 1e3 M-1 1][ ][ 1][ ][ 2 22 1 11 + + + ≅ LK LKn LK LKnθ Interação Mioglobina-O2 A interação entre a mioglobina e O2 segue as leis da termodinâmica mesmo considerando o Oxigênio como gás - Adequação experimental e matemática é necessária DKO O θ + = ][ ][ 2 2 Se P50 = [O2] na qual metade dos sítios estão ocupados Quando pO2 for equivalente à metade do sinal máximo temos KD e assim podemos definir P50 DKpO pO θ + = 2 2 O2 liga fortemente à mioglobina com um P50 de 0,26 kPa - Condição na qual metade dos sítios estão ocupados A [O2] em solução depende diretamente da pressão de O2 na atmosfera que pode ser controlada. 502 2 PpO pO θ + = DKP =50 Estrutura da Hemoglobina A Hemoglobina é um heterotetrâmero - Duas cadeias Alfa (141 resíduos) e duas cadeias Beta (146 resíduos) - Possui estrutura em hélice alfa Hemoglobina A (HbA) = par de dímeros α1β1 e α2β2 - A interface α1β1 e α2β2 apresenta ~30 contatos - A interface α1β2 e α2β1 apresenta ~19 contatos Maioria hidrofóbicos e alguns hidrofílicos Importantes para regulação - Grupos Heme estão bem separados (24-40 Å) Estrutura da Hemoglobina Cadeia Alfa e Beta da HbA apresentam ~25% de identidade com a Mioglobina Alta identidade estrutural - Apesar da baixa identidade sequencial - Identidade estrutural é mais conservada Mesma forma de ligar grupo Heme -Possui His Proximal e Distal Estrutura da Hemoglobina A HbA liga O2 de maneira cooperativa – curva Sigmoidal A ligação de O2 em uma cadeia da HbA aumenta a ligação de O2 nas demais cadeias A dissociação de O2 em uma cadeia da HbA facilita a dissociação de O2 nas demais cadeias Estrutura da Hemoglobina A ligação de O2 com HbA é >10 x mais fraca do que com a Mioglobina A baixa afinidade da HbA por O2 está relacionada com a função desta proteína - Captar O2 nos pulmões (“alta” pO2) e liberar nos tecidos (“baixa” pO2) A alta afinidade da Mioglobina por O2 está relacionada com a função: Armazenar O2 Cooperatividade A Alosteria – “outra forma” – está envolvida na cooperatividade Sistema de variação de afinidade/atividade frente à modulação. Envolve a participação de um Modulador - Modulador Ativador ou inibidor - Modulação homotrópica: Ligante e modulador iguais - Modulação heterotrópica: Ligante e modulador diferentes Uma curva de ligação sigmoidal é um sinal de ligação cooperativa. Cooperatividade A ligação cooperativa de O2 na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910) P + nL PLn k1 k2 n n Aeq LP PL k kKK ]][[ ][ 2 1 === D n K L θn θ ][ = − D KnLn θn θ log]log[log −= − Equação de Hill 1][ ][ + = n An n An LK LKnθ 1) Reorganizando 2) Dividindo ambos por KA 3) Substituindo por KD Curva de Hill log [θ/(1-θ)] versus log[L] onde a inclinação = n = nH Aplicando Log Cooperatividade A ligação cooperativa de O2 na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910) ( ) ( )502 log0loglog Pnpnθn θ −= − nH não representa o número de sítios de ligação, mas o grau de interação entre eles: o grau de cooperatividade nH representa a cooperatividade entre os sítios de ligação nH < n Equilíbrio múltiplo Sítios cooperativos - nH = 1 interação não cooperativa - nH > 1 cooperatividade positiva - nH < 1 cooperatividade negativa Ligação de O2 na Hemoglobina Em exercício, o sangue arterial, após uma passagem pelo pulmão, apresenta ~98% de saturação da HbA com O2 Após passar pelos tecidos, o sangue venoso apresenta ~32% de saturação de O2 - Portanto, ~66% dos pontos de ligação contribuíram para o transporte de O2 A ação cooperativa da HbA favorece a DESCARGA adequada de O2 - Nestas condições, a Mioglobina permaneceria com 91% de saturação 7% de transporte A HbA transporta ~10 x mais O2 do que a Mioglobina O2 A cooperatividade da HbA A ligação de O2 na HbA resulta em mudanças conformacionais na tetrâmero de HbA-O2 - Um dímero Alfa-Beta sofre rotação de 15º em relação ao outro A HbA existe em duas conformações principais: 1) T (Tenso) Estado deoxigenado 2) R (Relaxado) Estado Oxigenado - O Estado R apresenta maior afinidade por O2 do que o estado T - Na presença de O2, o estado R é mais estável A cooperatividade da HbA Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α1β2 e α2β1 A ligação de O2 altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos - Mudanças no ambiente do grupo Heme são transmitidas para as outras cadeias do oligômero A cooperatividade da HbA Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α1β2 e α2β1 A ligação de O2 altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos A cooperatividade da HbA Modelos de cooperatividade Modelo Combinado Modelo Sequencial A cooperatividade da HbA Modelos de cooperatividade Modelo Sequencial, em concerto ou simultâneo Modelo Combinado ou Coordenado A cooperatividade da HbA A HbA pura no estado T é muito instável - Liga avidamente O2 em baixas [O2] e libera apenas 8% de O2 em condições fisiológicas A transição T R adequada depende de um ligante – o 2,3-Bisfosfoglierato – 2,3-BPG A [2,3-BPG] nas hemácias é aumentada na altitude. - Adaptação em ~ 24 horas - Permite menor afinidade entre HbA-O2 - A HbA liga menos O2, MAS descarga de O2 nos tecidos é MAIOR apesar da menor pO2 atmosférica A cooperatividade da HbA Efeito do 2,3-Bisfosfoglierato – 2,3-BPG na p50 A cooperatividade da HbA O 2,3-BPG é sintetizado a partir de intermediários da via glicolítica: A cooperatividade da HbA O 2,3-BPG: 1) Liga-se no centro do Tetrâmero da HbA; 2) É liberado após transição T R; 3) Age mantendo HbA no Estado T; 4) É um Efetor Alostérico. A cooperatividade da HbA A transição T R expulsa o BPG do sítio de ligação Estado REstado T A Hemoglobina Fetal - A Hb fetal contem duas cadeia Alfa e duas cadeias Gama A cadeia Gama é 72% idêntica à cadeia Beta na seqüência de aminoácidos - A modificação Beta-His143 Gama-Ser143 - Modifica o sítio de interação do 2,3-BPG com a Hb Consequências: - Redução da afinidade da Hb Fetal por 2,3- BGP - Aumento da afinidade da Hb Fetal por O2 Permite que a Hb Fetal receba eficientemente o O2 transportado pela HbA maternal - O feto não “experimenta” pO2 atmosférica Outros genes Existem outras 3 cadeias de hemoglobina expressas em diferentes estágios do desenvolvimento Existem ainda: Neuroglobina e citoglobina (+ similares à mioglobina) Integração das trocas gasosas O CO2 é transportado como HCO3- (maior parte) A Hidratação do CO2 gera H+ A HbA transporta H+ e CO2 dos tecidos para o pulmão A HbA é sensível aos níveis de H+ e CO2 nos tecidos - H+ e CO2 são efetores alostéricos da HbA aumentam a liberação de O2 para os tecidos O estado T é estabilizado pela redução do pH - Resultado: descarga de O2 nos tecidos É chamado de Efeito Bohr (Christian Bohr, pai de Niels Bohr) O CO2 é hidratado pela enzima Anidrase Carbônica nas hemácias A afinidade da HbA por O2 diminui com a redução do pH A HbA liga H+ e CO2 A HbA transporta H+ dos tecidos para o pulmão No capilar sanguíneo (tecidos) A Hidratação do CO2 é catalisada pela Anidrase carbônica O próton liberado pela hidratação do CO2 liga-se à cadeia alfa e beta da HbA estabilizando uma ponte salina estabilização do estado T Permite o transporte de próton para os pulmões - 80% do transporte Ponte salina na interface α2β1 A HbA liga H+ e CO2 A HbA transporta CO2 dos tecidos para o pulmão O CO2 liga-se à aminas terminais - ~15-20% do transporte ligado à HbA - Restante é transportado na forma de HCO3- solúvel Forma grupos carbamato carga negativa Estabiliza estado T por favorecer interações eletrostáticas na interface cadeia Alfa-Beta da HbA Descarga de O2 pela HbA 66% 77% 88% Fatores influentes na HbA Efeitos na curva de saturação Mutações na HbA Os genes da Hb sofrem mutações que alteram a cadeia protéica - Podem prejudicar a afinidade da Hb pelo O2 - Originam as Hemoglobinopatias – são as anemias hereditárias - ~ 500 tipos de mutações identificadas na população humana - Muitas mutações são inócuas - O Surgimento da anemia depende se o indivíduo é heterozigoto ou homozigoto Anemia falciforme - devido à mutação D6V na cadeia Beta - Forma a Hemoglobina S - Forma um contato hidrofóbico com a F85 e V88 entre as cadeias beta inter-tetrâmeros Mutações na HbA As pontes hidrofóbicas inter-cadeias propicia a fibrilação Mutações na HbA As pontes hidrofóbicas inter-cadeias precipitam a HbS não liga O2 Mutações na HbA A HbS forma fibras que deformam a estrutura das hemácias HbS aumenta resistência à malária parasita vive dentro das hemácias -possível fator seletivo positivo da HbS por isto foi “selecionada” e persiste presente Número do slide 1 Número do slide 2 Número do slide 3 Número do slide 4 Número do slide 5 Número do slide 6 Número do slide 7 Número do slide 8 Número do slide 9 Número do slide 10 Número do slide 11 Número do slide 12 Númerodo slide 13 Número do slide 14 Número do slide 15 Número do slide 16 Número do slide 17 Número do slide 18 Número do slide 19 Número do slide 20 Número do slide 21 Número do slide 22 Número do slide 23 Número do slide 24 Número do slide 25 Número do slide 26 Número do slide 27 Número do slide 28 Número do slide 29 Número do slide 30 Número do slide 31 Número do slide 32 Número do slide 33 Número do slide 34 Número do slide 35 Número do slide 36 Número do slide 37 Número do slide 38 Número do slide 39 Número do slide 40 Número do slide 41 Número do slide 42 Número do slide 43 Número do slide 44 Número do slide 45
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