Protocolo_Eletroforese DNA

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Biologia Celular/Biologia Celular e Molecular Faculdade de Farmácia 
1º/1º Semestre Universidade de Coimbra 
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Prática Laboratorial nº 3 
 
Separação de Fragmentos de DNA por Eletroforese em Gel de Agarose 
 
 
1. Introdução 
A eletroforese é uma técnica separativa. O gel utilizado como suporte consiste de agarose 
polimerizada, um polissacarídeo que funciona como um crivo molecular. Dado que as moléculas de 
DNA têm carga net negativa, migram no sentido do polo positivo quando se aplica um campo elétrico 
entre as duas extremidades do gel. Assim, os diferentes fragmentos são separados no gel em função 
do seu tamanho/peso molecular. 
As enzimas de restrição são endonucleases que catalisam a reação de clivagem da ligação 
fosfodiéster entre nucleótidos sucessivos no DNA. Clivam ambas as cadeias de DNA, gerando 
extremidades 3’ e 5’ no ponto de clivagem. A clivagem ocorre em sequências específicas, que são 
frequentemente palindrómicas. Estas enzimas são produzidas por bactérias e têm o nome do 
organismo de onde são isoladas (primeira letra do género e 2 primeiras letras da espécie). Segue-se a 
estirpe (quando se aplica) e um numeral romano caso a mesma espécie/estirpe produza mais que uma 
enzima de restrição. 
Enzima de Restrição Género Espécie Estirpe Sequência de Reconhecimento 
Ava I Anabaena variablis n/a C^YCGUG 
Bgi I Bacillus globigii n/a GCCNNNN^NGGC 
EcoRI Escherichia coli RY 13 G^AATTC 
Hae III Haemophilus aegyptius n/a GG^CC 
HindIII Haemophilus influenzae Rd A^AGCTT 
Sac I Steptomyces arhromogenes n/a GAGCT^C 
N – A, T, C ou G; Y – pirimidina (T ou C); R – purina (A ou G) 
 
A enzima utilizada neste trabalho é a EcoRI, que produz extremidades coesivas: 
 
 
 
Outras enzimas de restrição, como a Hae III, clivam no meio da sequência e produzem 
extremidades rombas: 
 
 
 
5’ – GAATTC – 3’ 
3’ – CTTAAG – 5’ 
5’ – G AATTC – 3’ 
3’ – CTTAA G – 5’ 
5’ – GGCC – 3’ 
3’ – CAGG – 5’ 
5’ – GG CC – 3’ 
3’ – CC GG – 5’ 
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O DNA do bacteriófago lambda é uma DNA dupla cadeia com 48502 pb e um peso molecular de 
31.5 x 106 Da. Contém 5 sequências de reconhecimento para a Eco RI e 7 para a HindIII. 
 
2. Objetivos: 
• Compreender os princípios de uma eletroforese de ácidos nucleicos e uso de enzimas 
de restrição. 
• Aquisição de competências técnicas laboratoriais: pipetar utilizando micropipetas 
automáticas; preparação de amostras de pequeno volume; cálculos de concentração e 
diluição; segurança no laboratório. 
 
3. Soluções, Reagentes e Materiais 
 
Soluções e Reagentes 
Tampão TAE 1x (pH 8.0 – 8.5) 
(TRIS-Acetate-EDTA buffer) 
 
40 mM Tris 
20 mM Ácido Acético Glacial 
1 mM EDTA 
Solução de Agarose 
 
0.7 % em TAE 1x 
1x SYBR safe 
Amostra de DNA Lambda DNA, 0.3 µg µL-1 
Enzima de Restrição 
 
Eco RI 
Tampão de Enzima 10x 
Loading Buffer 6x 
 
10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 
0.03 % bromophenol blue (d~300bp) 
0.03 % xylene cyanol FF (d~4000bp) 
60 % glicerol 
60 mM EDTA 
Marcador de Tamanho Lambda DNA Hind III Digest (0.1 µg µL-1) 
 
• Tina, suporte para gel de agarose e Fonte de Eletroforese 
• Transiluminador 
• Banho de água (37ºC) 
• Placa de aquecimento ou microondas 
 
 
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4. Procedimento 
4.1. Preparação do gel de agarose 
O gel de agarose pode ser preparado em diferentes concentrações, em função do tamanho de 
fragmento de DNA que se pretende separar: 
 Concentração 
(%) 
Resolução (bp) 
0.5 1000 – 25000 
0.75 800 – 12000 
1 500 – 10000 
1.5 200 – 3000 
2 50 - 1500 
 
• Para esta prática laboratorial, preparar uma solução de agarose 0.7 % em TAE, para um 
volume final de 40 mL. 
m(agarose) = . 
 
• Aquecer a solução até a fervura para dissolver a agarose. Deixar arrefecer e adicionar o 
marcador de DNA SYBR safe. O mesmo encontra-se numa solução stock em DMSO, 
concentrado 10000. 
v(SYBR) = . 
 
• Encher o suporte de gel com a solução ainda quente. Colocar o pente e deixar solidificar 
(~ 20min). 
 
4.2. Preparação de amostras 
• Para os efeitos da presente prática laboratorial, iremos digerir o DNA do fago lambda 
utilizando a enzima de restrição Eco RI. As amostras, enzimas e DNA devem permanecer 
dentro de gelo. 
• Preparar as amostras para microtubos de 1.5 mL de acordo com as instruções da tabela I. 
 
Tabela 1 
Reagente Reação Controlo 
Tampão Eco RI 10x 2 µL 2 µL 
Eco RI 1 µL - 
DNA fago lambda 1 µL 1 µL 
H2O (vf = 20 µL) 16 µL 17 µL 
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• Colocar os tubos num flutuador no banho a 37ºC, por 15-30 min. 
• Após digestão, transferir novamente os tubos para o gelo. 
• Adicionar 4 µL de Loading Buffer 6x 
• Preparar o marcador de tamanho: 
o 10 µL Lambda DNA Hind III digest 
o 2 µL Loading Buffer 6x 
• Utilizando uma centrífuga de bancada, fazer o spin down das amostras e marcador. 
 
4.3. Eletroforese: 
• Transferir o gel de agarose para a tina na orientação correta 
• Adicionar 12 µL do marcador de tamanho no primeiro poço 
• Adicionar em cada um dos poços sucessivos 24 µL de amostra 
• Colocar a tampa na tina e conectar à fonte. Ajustar a voltagem para 120 V (4-10 V 
cm-1) 
• Correr eletroforese até que a frente do marcador tenha percorrido 75-80% da 
totalidade do gel 
 
4.4. Visualização do Gel 
• Transferir o gel para o Transiluminador. 
• Ligar lâmpada UV para visualizar DNA marcado com SYBR safe. 
 
4.5. Material de apoio: 
Marcador de tamanho de 
fragmento 
 (Lambda Hind III digest) 
 
Mapas de restrição do λDNA 
 
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Espectro Electromagnetico: 
O SYBR® safe é um corante de cianina utilizado para marcar 
DNA. O complexo formado absorve luz azul (λmax = 509 nm) e 
emite luz verde (λmax = 524 nm).