Técnicas da Biologia Molecular

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Universidade Nove de Julho Maria Lívia
Técnicas da Biologia 
Molecular 
Diagnóico Molecular: 
Aplicações: 
✓ Diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas; 
✓ Detecção de agentes patogênicos e mutações; 
✓ Determinação do sexo a partir do sangue materno; 
✓ Medicina forense; 
✓ Verificação de polimorfismos; 
✓ Verificação de mutações; 
✓ Análise de expressão gênica. 
Preparo da Amtra: 
✓ As amostras podem ser obtidas por meio de diferentes 
procedimentos, como produção de vasos sanguíneos, 
biópsias, esfreaços, cultivo microbiológico ou fragmento 
de tecido, de acordo com o organismo envolvido; 
Passo a passo do preparo: 
✓ Extração de rna ou DNA; 
✓ Análise da integridade do RNA ou DNA; 
✓ Quantificação do DNA ou RNA; 
✓ Conversão de RNA para cDNA - extração de RNA; 
✓ Técnica Molecular - PCR, sequenciamento, NGS. 
Extração de rna ou DNA: 
✓ 1. - Lise Celular: 
• Envolve o rompimento das células e deve ser 
realizada em soluções tamponadas, geralmente 
contendo um detergente. 
✓ 2. - Separação dos Constituintes Celulares: 
• Após a lise das membranas, os ácidos nucleicos são 
liberados na solução aquosa juntamente com outros 
constituintes celulares dos quais devem ser isolados; 
• Para esse fim, são utilizados solventes orgânicos, 
como o fenol ou clorofórmio, que desnaturam 
proteínas; 
• Após a centrifugação, o DNA permanecerá solúvel na 
fase aquosa - sobrenadante. 
O acondicionamento adequado das amostras após a 
coleta é essencial para sua preservação até o 
momento da extração. Além disso, todo material 
utilizado no procedimento deve ser esterilizado, a fim 
de evitar a contaminação do DNA ou RNA.
O NaCl contribui rompendo ligações iônicas das 
cadeias peptídicas, auxiliando na desnaturação das 
proteínas e adicionalmente promove a aglomeração 
das moléculas de DNA. 
A adição o agente quelante EDTA também auxilia na 
inibição da ação das DNAses por se ligar aos 
cofatores Ca2+ e Mg2+ da enzima DNAse.
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✓ 3. - Precipitação do DNA: 
• Em condições de baixa temperatura e elevada 
concentração salina (devido ao NaCl presente no 
tampão de lise), a adição de etanol absoluto, 
isopropanol ou soluções acetatos de amônio ou sódio 
resulta na precipitação do DNA; 
• Isso forma em solução um aglomerado de filamentos 
esbranquiçados que podem ser “pescados” com um 
bastão de vidro ou concentrados no fundo do tubo 
por centrifugação. 
Quantificação e qualidade do material genético: 
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase: 
Amplificação de DNA pelo PCR: 
✓ Técnica que permite a amplificação da quantidade de 
DNA específico utilizando a enzima Taq DNA 
polimerase, dNTP, sequências iniciadoras específicas 
(primers) e variações de temperatura controladas. 
✓ Primers: 
• Responsáveis pela localização da sequência alvo; 
• Oligonucleotídeos com 20-24 bases; 
• O pareamento dos “primers” com a sequência alvo se 
faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, 
segundo o pareamento convencional descrito por 
Watson e Crick. 
✓ Passo a Passo do Processo: 
• 1. - Adição da DNA-polimerase de Taq + dNTPs; 
• 2. - Desnaturação 
- As moléculas e DNA são inicialmente desnaturadas 
por alta temperatura - acima de 90ºC; 
- Anelamento: a seguir, a temperatura é diminuida 
(entre 45ºC e 65ºC) e 2 primers pareiam-se com 
suas sequências complementares nas fitas moldes; 
- Polimerização: posteriormente, pela disponibilidade 
de extremidades 3’OH dos primers, a enzima DNA 
polimerase realiza a síntese das novas fitas. 
• 3. - 2º Ciclo de Síntese; 
• 4. - Demais Ciclos; 
• 5. - Visualização do Produto. 
PCR em tempo real: 
✓ Técnica realizada em um instrumento fechado, que 
contém um termociclador acoplado a um sistema 
óptico para a excitação da fluorescência e um sistema 
de detecção dos sinais fluorescentes; 
✓ Encontra-se acoplado a um computador com um 
software que captura os dados e faz a análise final da 
reação. 
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✓ Componentes: 
Sequenciador de DNA: 
✓ São equipamentos que leem uma amostra de DNA e 
geram um arquivo eletrônico com símbolos que 
representam a sequência de bases nitrogenadas – A, 
C, G, T – contidas na amostra; 
✓ Sequenciador de Eletroforese - processa no máximo 
96 fragmentos por vez.; 
✓ NGS - podem ler até bilhões de fragmentos ao mesmo 
tempo. 
Benefícios: 
✓ Obter informações genômicas em curto tempo a um 
custo razoável; 
✓ Flexibilidade para ser aplicada em uma série de estudos 
genômicos; 
✓ Sequenciamento gênico completo em determinadas 
situações e condições biológicas; 
✓ Exoma 
Nova geração de sequenciadores - ngs: 
✓ ABI 3730xl; 
• Método - sanger. 
✓ Roche/454 FLX; 
• Método - pirosequenciamento. 
✓ Illumina/Solexa GÁS; 
• Método - sequenciamento por síntese. 
✓ ABI SOLiD 
• Método - sequenciamento por ligação. 
 
Genotipagem de Microrganismos: 
✓ Identifica quais são as mutações ente os microrganismo 
circulantes; 
✓ Pode identificar espécies novas; 
✓ Auxilia no diagnóstico e tratamento; 
✓ Auxilia na definição de perfis epidemiológicos. 
✓ Metodologia: 
• Técnica de Sequenciamento Automático de DNA. 
Tecnologia DNA Recombinante: 
✓ Técnicas que visam o isolamento de genes e a 
introdução de genoma exógeno em outro organismo; 
✓ São produzidos organismos transgênicos, com diversas 
finalidades; 
✓ Ampla aplicação comercial e tecnológica. 
Cada tecnologia de sequenciamento possui uma estratégia 
diferentes, mas em geral podemos identificar etapas comuns 
entre todos os sequenciadores.
O sequenciamento completo do Exoma - 
Prática Clínica: 
Exoma refere-se ao conjunto de éxons presentes no genoma de 
grande parte dos seres vivos, composto por cerca de 180.000 
éxons nos humanos. O Sequenciamento Completo do Exoma 
consiste na análise dos éxons do DNA, que correspondem às 
regiões codificantes do mRNA.
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Enzimas de Restrição: 
✓ São enzimas encontradas em bactérias, utilizadas para 
realizar cortes no DNA; 
✓ Cada enzima de restrição corta o material genético em 
um sítio específico, que são palíndromas; 
✓ As extremidades das partes cortadas recebem o nome 
de extremidades de ligação, pois se encaixam 
perfeitamente.
Crispr Cas9: 
O sistema CRISPR, ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas 
Agrupadas e Regularmente Interespaçadas, consiste em 
pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições 
de nucleotídeos —> “sistema imune das bactérias”.