Bactérias Gram-negativas: características e diagnóstico

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Grupo composto por bacilos Gram-negativos, sendo a maior e mais heterogênea família de bactérias Gram-negativas de importância médica; e, é encontrado em diversos ambientes. Subdividido a partir de um teste em ágar MacConkey:
· Lactose +: são as bactérias que fermentam a lactose (meio rosado), sendo elas: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter.
· Lactose -: são bactérias que não fermentam a lactose (meio amarelado), sendo elas: Shigella, Salmonella, Proteus, Providencia, Morganella, Yesinia.
São considerados patógenos primários (sempre causam doença), Escherichia, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Yesinia; sendo as duas primeiras pertencentes a microbiota do TGI humano. Já os patógenos oportunistas (causam doenças em determinadas condições ou em alguns hospedeiros) são Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Proteus, Providencia, Morganella.
As principais doenças causadas são: sepse, ITU, infecções gastrointestinais e meningites. Por serem causadores de infecções gastrointestinais, são considerados enteropatógenos: Salmonella typhi, Shingella spp. e Escherichia coli. A origens das infecções são: reservatório animal, carreador humano, transmissão endógena.
CARACTERIZAÇÃO:
São bacilos Gram-negativos, anaeróbicos facultativo, apresentando vários fatores de virulência como toxinas, não são possuidores de esporos, mas a maioria apresenta flagelos peritríquios (sem dimensão) e são catalases positivo. 
São normalmente fermentadores de açúcares (lactose, glicose e sacarose) com ou sem produção de gás; são oxidases negativos; reduzem nitratos a nitritos, normalmente encontrado na urina.
Possui característica especifica, apresentando coloração verde metálica.
FATORES DE VIRULÊNCIA:
Varia de bactéria para bactéria e de gênero para gênero. Sendo os mais comuns:
· Endotoxina
· Cápsula
· Variação da fase antigênica: possui antígenos
· Sequestro de fatores de crescimento: as bactérias impedem que outras bactérias cresçam através dela com maior velocidade;
· Resistência ao poder bactericida do soro: a bactéria não morre com a quantidade menor dela, fazendo com que algumas sobrevivam;
· Resistência antimicrobiana
COLETA:
Se dá por diversos tipos de amostra como: urina, fezes (meio de transporte), hemocultura, LCR, secreções em geral
MEIOS DE CULTURA:
Crescem em meios, cada amostra tendo o seu específico. Dividido em três meios:
· Básicos: caldo peptona – todos tipos de microrganismos microbianos crescem;
· Ricos: ágar sangue, ágar chocolate e ágar CLED (indicado em amostra biológica de urina);
· Seletivos: ágar MacConkey e ágar BEM – só microrganismos Gram-negativos crescem.
MORFOLOGIA:
A morfologia em ágar sangue possui pouco valor, pelas colônias serem muito parecidas – grandes, cinzas e opacas (exceto: K. pneumoniae), então é considerado não distintivo.
O efeito de propagação de Proteus spp. apresenta ondas ou motilidade. Já em relação ao ágar MacConkey, há formação de ácido a parti da lactose do meio; valendo lembrar que é seletivo para bactérias Gram-negativas (ácido biliar e cristal violeta na composição).
Em relação ao ágar BEM, ele é caracterizado por ser lactose positiva e negativa, assim como o ágar MacConkey, ágar CLED.
 DIAGNÓSTICO:
As provas bioquímicas importantes para a identificação são: 
· Fermentação em carboidratos específicos: sempre se usa fontes de carbono diferentes associadas a indicadores de pH. Logo, a fermentação é indicada pela mudança de cor do meio quando os produtos ácidos são formados.
· KIA/TSI: usados para identificar bacilos fermentadores. Possuem a mesma fórmula, exceto porque o TSI possui 10g/L de sacarose, além de glicose e lactose.
· TSI: glicose, sacarose e lactose + ferro, indicando um vermelho de fenol. As diferenças de diferentes carboidratos: produção de gás; produção de sulfureto de hidrogênio (H2S).
· Ápice vermelho/base vermelha (alcalino – alcalino): ausência de fermentação de carboidratos, ou seja, não é Enterobacteriaceae.
· Ápice vermelho/base amarela (alcalino – ácido): fermentação de glicose/ausência de fermentação de lactose e sacarose. Ex: Shigella, Providencia e Serratia;
· Ápice amarelo/base amarela (ácido – ácido): fermentação de glicose, lactose e sacarose. Ex: E. coli, Klebsiella-Enterobacter.
· Ápice vermelho/base amarela (negra) (alcalino – ácido – negra): fermentação de glicose/ausência de fermentação da lactose + produção de H2S. Ex: Salmonella, Citrobacter e Proteus.
· Produção de gás: quando a enterobactéria fermenta a lactose
· E. coli: fermenta os açúcares com grande produção de gás.
· Shigella e Salmonella typhi: fermentam os açúcares sem produzir gás.
O gás resultante das bactérias formadoras é uma mistura de hidrogênio e dióxido de carbono.
· Produção de sulfeto de hidrogênio: o meio deve ter uma fonte de enxofre e um indicador de H2S (mais comum: sulfato ferroso). São mais utilizados os meios: TSI, SIM, KIA; produzindo uma reação de emagrecimento do meio, sendo positivo para: Salmonella, Citrobacter e Proteus.
· Nitratos: verificar se a bactéria reduz nitratos a nitritos través da retirada de oxigênio, baseado na produção da enzima nitratorredutase. Reage produzindo uma coloração vermelha, sendo positivo para a maioria das enterobactérias.
· Atividade de descarboxilase: investigar produção de enzimas descarboxilases (lisina, ornitina e arginina), sendo cada enzima específica para um aminoácido. Fonte de carbono: glicose. 
· Teste no MEIO MIO:Ornitina
descarboxilase
Klebsiella: ornitina negativa e imóvel (amarela);
Enterobacter: ornitina positiva e móvel (púrpura);
· Teste no MEIO LIA: verificar a descarboxilação da lisina; meio: ágar lisina-ferro. 
Salmonella: lisina descarboxilase/sulfeto de hidrogênio positiva (fundo negro e superfície púrpura)
· Produção de indol: as bactérias que possuem a enzima triptofanase, produzem indol, ácido pirúvico e amônia. Indol detectado – produção de cor vermelha (adição de reativo de KOVAC); utilizado meio MIO e quando há positividade é para: E. coli, e algumas espécies de Klebsiella e Shigella.
· Produção de citrato: algumas bactérias podem adquirir energia utilizando citrato como única fonte de carbono (e não carboidratos). O meio é isento de proteínas e carboidratos, sendo utilizado o citrato de Simmons – produção de subprodutos alcalinos, tendo como indicador o azul de bromotimol. É positivo para: K. pneumoniae, Enterobacter sp., Serratia, Providencia, Salmonella.
· Vermelho de metila (VM): investigar a produção de acetoína – produto derivado do metabolismo da glicose. É negativo para Klebsiella, Enterobacter, Serratia; sendo positivo para: E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Morganella spp., Citrobacter spp. Indicador: vermelho de metila.
· Vorges-Proskauer (VP): avaliar se a bactéria utiliza a fermentação butilenoglicólica – investigar a produção de acetoína e butilenoglicol. É positivo para Klebsiella, Enterobacter, Serratia; sendo negativo para: E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Morganella spp., Citrobacter spp.; indicador: cor vermelha do meio após a adição de alfa-naftol.
· Produção de uréase: bactérias que produzem a enzima uréase têm capacidade de hidrolisar ureia e liberar amônia, produzindo como resultado a alcalinização do meio. Indicador: vermelho de fenol (coloração rosa). Meios utilizados: caldo de ureia de Stuart e ágar de ureia de Christensen, mostrando positividade para: P. mirabilis, P. vulgaris, M. morganii, Providencia rettgeri e K. pneumoniae.
· Motilidade: devem ser utilizados meios com 0,4% de ágar. BHI semi-sólido: após incubação, é observado o crescimento bacteriano. BHI líquido: após a incubação, a motilidade é observada no microscópio ótico. Meio MIO (motilidade, indol, ornitina). Motilidade positiva: P. mirabilis, P. vulgaris, M. morgannii, E. coli, Salmonella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia spp.; imóveis: Shigella spp, Klebsiella spp
· Fenilalanina: bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina do meio, originam o ácidofinilpirúvico – reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde.
· Identificação bacteriana: meios de cultura
· Coloração de Gram: bacilos Gram-negativos
· Teste da oxidase: negativo
Pseudomonas spp.
É um patógeno importante relacionado a casos de infecções hospitalares. No meio de cultura, produz um pigmento esverdeado (pioverdina), produz uma particularidade que é o seu cheiro adocicado. Não fermenta a glicose, e nem reduz o nitrito; sendo oxidases positivos, aeróbicos estritos e produtores de energia por oxidação e não por fermentação.
Ornitina do meio
CO2 e putreceína (aumenta o pH)