A eletroforese-WPS Office

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A eletroforese é uma técnica analítica utilizada na análise de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos. Essa técnica foi descoberta e empregada pela primeira vez em 1937 por Arne Tisélius um bioquímico sueco. O efeito eletroforético tem como base a teoria de Debye-Hückel-Onsager, onde esta teoria de dissociação eletrolítica aceita o fato de as partículas carregadas moverem-se sob a influência de forças eletrostáticas para um eletrodo de carga oposta quando é aplicada uma diferença de potencial em uma solução contendo eletrólitos.
A eletroforese é a migração de uma molécula carregada sob a influência de um campo elétrico. A mobilidade eletroforética é dada por:
μ= v/E = Z/f
Onde:
A mobilidade eletroforética (μ) é a razão entre a velocidade(v) da macromolécula e o potencial elétrico(E) que move a macromolécula ou a razão entre a carga líquida(Z) e o coeficiente de atrito(f).
Suportes para eletroforese
Os suportes para eletroforese comumente empregados são os géis de poliacrilamida para proteínas e agarose para os ácidos nucléicos, em virtude de estes polímeros funcionarem como uma peneira molecular, ou seja, separar as espécies em função de sua massa e tamanho molecular, respectivamente, inibe a propagação do calor em virtude do atrito causado pela migração e pela aplicação do campo elétrico.
Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie(corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilemente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.
Os géis de agarose são utilizados para macmoléculas com massa molecular a superior a 200 kD visto que os ácidos nucléicos apresentam massas moleculares extremamente grande. A coloração do eletroforetograma de ácidos nucléicos é realizada como brometo de etídio, em fução dos outros corantes provocarem a coração total do gel de agrose impossibilitando a identificação dos ácidos nucléicos.
Eletroforese de macromoléculas em Gel de SDS
A amostra de interesse deve ser preparada com o rompimento da matriz em que encontra-se o composto de interesse, nesse caso é uma célula que é rompida por métodos, físicos ou químicos onde os métodos físicos incluem destruição mecânica ou maceração e métodos químicos funcionam através do rompimento por meio da adição de compostos químicos que não afetem as características físico-químicas, do composto de interesse.
Após a essa preparação a amostra é colocada em uma solução chamada de tampão de amostra que contém em sua composição agentes químicos redutores, desnaturantes e tamponantes. Em seguida essa solução é aquecida a 90ºC por um períodos de 5 a 10 minutos para desnaturação da macromolécula. Um exemplo desses agentes são:
SDS ou dodecilsulfato de sódio: é uma molécula anfifílica usada como desnaturante, ou seja, é um detergente que é adicionado a solução com o objetivo de proporcionar uma carga liquida negativa para a biomolécula de interesse, de modo que ele agrega-se ao redor desta.
Agentes redutores: os agentes redutores comumente utilizados são β-mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol), que agem causando a redução das pontes dissulfeto que são responsáveis pela estrutura nativa da proteína.
Resumidamente o procedimento para eletroforese de macromoléculas é o seguinte:
As macromoléculas são colocadas em uma solução chamada tampão de amostra contendo SDS, Azul de Bromo-fenol e DTT;
A solução tampão de amostra contendo as proteínas é aquecida a 90ºC de 5 a 10 minutos;
Após o aquecimento das proteínas são desnaturadas, suas ligações dissulfeto são quebradas, e o SDS agrega-se ao redor das proteínas proporcionando uma carga líquida negativa.
Mecanismo da eletroforese
Abaixo é descrito o mecanismo da eletroforese.
1 – a amostra contendo as macromoléculas devidamente desnaturadas e reduzidas é distribuída ao nos poços ou cavidades do gel de suporte;
2 - após a distribuição o equipamento é fechado e o campo elétrico é aplicado no gel, através de um dispositivo diferencial de energia elétrica e as macromoléculas vão sendo distribuídas pela extensão do gel e são separadas em função de sua massa e tamanho molecular que são os principais fatores que determinam a mobilidade eletroforética.
No topo do gel existe uma mistura de macromoléculas de variados tamanhos e massas moleculares de modo que quando o campo elétrico é aplicado as moléculas menores migram primeiro, pela malha formada pelo gel. Ao passo que durante a distribuição o gel funciona como uma peneira molecular e as moléculas com massa molecular mais elevada vão sendo retidas ao longo do processo pelas malhas gel o que permite que as macromoléculas sejam analisadas pela sua massa molecular.
No final do processo quando todas as macromoléculas estão ditribuidas o gel é mergulhado em uma solução corante.
Para proteínas são usadas solução de nitrato de prata que detecta proteínas mesmo que a concentração seja muito baixa. Ou o gel é mergulhado em uma solução ácida e alcoólica de corante azul de coomassie. Um período de tempo é aguardo e em seguida observa-se o eletroforetograma que nada mais é do que o gel corado. Para analise de ácidos nucléicos (DNA e RNA) são usados corantes como brometo de etidio, laranja de acridina e profalvina que são corantes com estrutura aromática, quando sob a luz utravioleta apresentam fluorescência.
 
Focalização Isoelétrica de proteínas em gel de SDS
Uma técnica muito poderosa para analise de proteínas que proporciona alta resolução é chamada Focalização Isoelétrica onde as proteínas são separadas, através de seu ponto isoelétrico.
A focalização isoelétrica consiste na neutralização das cargas das proteínas onde um gel contendo anfólitos (íons que se comportam como ácido e base ao mesmo tempo), é submetido a um campo elétrico de modo que no momento em que os anfólitos migram em direção aos pólos negativos e positivos de acordo com sua carga elétrica e distribuem-se pelo gel cilíndrico, estabelecendo assim um gradiente de pH estável onde as proteínas irão migrar para um local onde seu ponto isoelétrico seja igual o do anfólito. A focalização isoelétrica se processa da seguinte maneira:
No primeiro gel os anfólitos adicionados são distribuídos com a aplicação do campo elétrico.
No segundo gel é adicionada a solução de proteínas.
No terceiro gel é aplicado o campo novamente e as proteínas migram em direção a seu ponto isoelétrico.
O processo de migração termina por que as cargas se igualam, ou seja, pI = pH as cargas se anulam de modo que na equação inicial Z=0, e a proteína é focalizada ou seja ela para exatamente no ponto conhecido.
Eletroforese Bidimensional ou 2D
Essa técnica oferece uma resolução melhor, ou seja, um grau maior de detalhes no eletroforetograma final por que combina a focalização isoelétrica e a eletroforese em gel SDS. De acordo com o esquema abaixo:
 
Na eletroforese bidimensional o gel da focalização isoelétrica é colocado horizontalmente sobre um gel de sds, o campo elétrico é aplicado e as macromoléculas protéicas são separadas de acrodo com o ponto isoelétrico e em função de sua massa molecular, fornecendo um eletroforetograma que possibilita a visualização e identificação de várias proteínas de uma só vez.
A eletroforese é o termo usado para descrever o movimento de partículas em um gel ou fluido dentro de um campo elétrico relativamente uniforme.
A eletroforese pode ser usada para separar moléculas com base na carga, tamanho e afinidade de ligação que possuem. A técnica é aplicada principalmente para separar e analisar biomoléculas, como DNA, RNA, proteínas, ácidos nucleicos, plasmídeos e fragmentos dessas macromoléculas. Esta é uma das técnicas utilizadas para identificar DNA-fonte, como no teste de paternidade e na ciência forense.
A eletroforese de ânion ou partículas carregadas negativamente é chamada anaforese.A eletroforese de cátion ou partículas carregadas positivamente é chamada de cataforese.
Esse processo foi observado pela primeira vez em 1807 por Ferdinand Frederic Reuss, da Universidade Estadual de Moscou, que notou que as partículas de argila migraram em águas expostas a um campo elétrico contínuo.
 
COMO FUNCIONA A ELETROFORESE
Existem dois fatores principais que controlam a rapidez com que uma partícula pode se mover e em que direção ela se move. Primeiro, a carga da amostra é importante. As moléculas carregadas negativamente são atraídas para o pólo positivo de um campo elétrico, enquanto as positivamente carregadas são atraídas para o pólo negativo. Uma espécie neutra pode ser ionizada se o campo for forte o suficiente. Caso contrário, não tende a ser afetada.
O outro fator é o tamanho da partícula. Pequenos íons e moléculas podem se mover através de um gel ou líquido muito mais rapidamente do que os grandes.
Enquanto uma partícula carregada é atraída por uma carga oposta em um campo elétrico, existem outras forças que afetam a forma como uma molécula se move. A fricção e a força de atraso eletrostático retardam o progresso das partículas através do fluido ou gel. No caso de eletroforese em gel, a concentração do gel pode ser controlada para determinar o tamanho dos poros da matriz de gel, o que influencia a mobilidade.
Um tampão líquido também está presente, o que controla o pH do ambiente.
À medida que as moléculas são puxadas através de um líquido ou gel, o meio aquece. Isso pode desnaturar as moléculas e afetar a taxa de movimento. A tensão é controlada para tentar minimizar o tempo necessário para separar as moléculas, mantendo uma boa separação e mantendo as moléculas intactas. Às vezes, a eletroforese é realizada na geladeira para ajudar a compensar o calor.
TIPOS DE ELETROFORESE
A eletroforese abrange várias técnicas analíticas relacionadas. Exemplos incluem:
Eletroforese de afinidade – É um tipo de eletroforese em que as partículas são separadas com base na formação complexa ou interação bioespecífica.
Eletroforese capilar – É um tipo de eletroforese usado para separar íons dependendo principalmente do raio atômico, carga e viscosidade. Como o nome sugere, esta técnica é comumente realizada em um tubo de vidro. Produz resultados rápidos e uma separação de alta resolução.
Eletroforese em gel – É um tipo de eletroforese amplamente utilizado em que as moléculas são separadas por movimento através de um gel poroso sob a influência de um campo elétrico. Os dois principais materiais de gel são agarose e poliacrilamida. A eletroforese em gel é utilizada para separar ácidos nucleicos (DNA e RNA), fragmentos de ácido nucleico e proteínas.
Imunoeletroforese – A imunoeletroforese é o nome geral dado a uma variedade de técnicas eletroforéticas utilizadas para caracterizar e separar proteínas com base na sua reação a anticorpos.
Eiectromancheamento – Eletromancheamento ou eletroblotting é uma técnica utilizada para recuperar ácidos nucleicos ou proteínas após a electroforese, transferindo-os para uma membrana. Os polímeros de fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nitrocelulose são comumente usados. Uma vez que a molécula foi recuperada, ela pode ser analisada adicionalmente usando manchas ou sondas. Um western blot é uma forma de eletromancheamento usado para detectar proteínas específicas usando anticorpos artificiais.
Electroforese em gel de campo pulsado – A eletroforese em campo pulsado é usada para separar macromoléculas, como o DNA, alterando periodicamente a direção do campo elétrico aplicado a uma matriz de gel. A razão pela qual o campo elétrico é alterado é porque a eletroforese em gel tradicional é incapaz de separar eficientemente moléculas muito grandes que tendem a migrar juntas. Alterar a direção do campo elétrico dá às moléculas direções adicionais para viajar, então elas têm um caminho através do gel. A tensão geralmente é trocada entre três direções: uma que corre ao longo do eixo do gel e duas a 60 graus para ambos os lados. Embora o processo demore mais do que a eletroforese em gel tradicional, é o melhor para separar grandes partes de DNA.
Foco isoelétrico – focagem isoelétrica (IEF ou eletrofocagem) é uma forma de eletroforese que separa moléculas com base em diferentes pontos isoelétricos. Esse método é mais frequentemente realizado em proteínas porque a carga elétrica depende do pH