Fisiologia Nutrição e Crescimento de Bactérias

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Fisiologia – Nutrição e Crescimento de Bactérias:
· Fisiologia: ciência biológica que estuda as funções orgânicas, processos ou atividades vitais, tais como a nutrição, o crescimento, a respiração, entre outros. 
· Composição química de uma célula procariótica: as células bacterianas são compostas por água, macromoléculas (como proteínas, polissacarídeos, lipídeos, DNA e RNA), outros compostos orgânicos (como aminoácidos, açucares e nucleotídeos) e íons inorgânicos. 
· Basicamente as necessidades nutritivas dos microrganismos são as mesmas de todos os seres vivos que, para renovarem seu protoplasma (matéria) e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fontes de material plástico. Nos seres superiores, encontramos apenas dois tipos nutritivos: os vegetais que são fotossintéticos, isto é, obtêm energia da luz solar, e autotróficos, nutrindo-se exclusivamente de substâncias inorgânicas; e os animais que são quimiotróficos, pois obtêm energia à custa de reações químicas, e heterotróficas, por exigirem fontes orgânicas de carbono.
· Fontes de energia: algumas bactérias são fotossintéticas, ou seja, usam a luz como fonte de energia (nas cianobactérias, o pigmento principal é a clorofila, como nas plantas. Em outro grupo de bactérias, o pigmento fotossintético não é a clorofila vegetal e sim a bacterioclorofila). No entanto, a grande maioria das bactérias é quimiotrófica, obtendo energia à custa de reações químicas nos quais substratos adequados são oxidados. As litotróficas oxidam compostos inorgânicos (ex: (H2S), enquanto as organotróficas oxidam compostos orgânicos (ex: glicose). A energia é usada pelas bactérias, por exemplo, na biossíntese de macromoléculas, na montagem de estruturas e na divisão celular.
· Fontes de material plástico: para a renovação da matéria viva, os elementos químicos quantitativamente mais importantes são: carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, enxofre e o fósforo.
· Fontes de carbono: para as bactérias autotróficas, a única fonte de carbono é o CO2 ou o íon bicarbonato a partir dos quais conseguem sintetizar todos os compostos orgânicos de que necessitam. Já as bactérias heterotróficas (representam a maioria das bactérias) exigem fontes orgânicas de carbono, como por exemplo carboidratos, aminoácidos, lipídeos, álcoois e mesmo polímeros como amido e celulose podem ser utilizados, entre outros.
· Fontes de nitrogênio: quanto à necessidade de nitrogênio há, em linhas gerais, três categorias: (1) algumas bactérias retiram o nitrogênio diretamente da atmosfera (N2) e o converte a nitrogênio orgânico, ação exercida, por exemplo, por bactérias dos gêneros Azotobacter e Rhizobium, as quais executam esta atividade em simbiose com plantas leguminosas num processo de considerável importância econômica, pois contribuem de maneira significativa na fertilidade e produtividade do solo. (2) A quase totalidade das bactérias utiliza compostos inorgânicos de nitrogênio, tais como sais de amônio, nitratos, entre outros. (3) Algumas bactérias exigem fontes orgânicas de nitrogênio, tais como aminoácidos ou hidrolisados de proteínas. De modo geral, a adição de aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece o crescimento da maioria das bactérias heterotróficas.
· Íons inorgânicos essenciais: além de carbono e nitrogênio, as bactérias exigem uma série de outros elementos químicos sob a forma de compostos inorgânicos, como macronutrientes (necessários em quantidades apreciáveis) e micronutrientes (necessários em pouca quantidade). Entre os macronutrientes, podemos citar o carbono, oxigênio, nitrogênio, hidrogênio, fósforo, enxofre, potássio, cálcio, magnésio e ferro. Dentre os micronutrientes, estão incluídos o manganês, cobalto, zinco, cobre, molibdênio, cromo, níquel, selênio e tungstênio.
· Fatores de crescimento: denominam-se fatores de crescimento os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microrganismo, mas que ele não consegue sintetizar. Tais fatores, portanto, devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer. Ex: vitaminas (em especial do complexo B), aminoácidos, nucleotídeos e ácidos graxos. As necessidades específicas desses fatores de crescimento são muito variáveis para cada microrganismo. Quando um microrganismo exige um determinado fator, seu crescimento será limitado pela quantidade do fator presente no meio.
· Água: a água não é um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento das bactérias. Possui diversas funções, dentre elas a de solvente universal (passagem de substâncias em solução através da membrana citoplasmática, pelas quais as bactérias se nutrem) e na regulação da pressão osmótica e térmica. A maior parte das bactérias, especialmente as que não esporulam, morre rapidamente pela dessecação.
OBS: utiliza-se água destilada na preparação dos meios de cultura. 
· Oxigênio atmosférico: o oxigênio atmosférico não é um nutriente e funciona apenas como receptor final de hidrogênio nos processos de respiração aeróbica. Entra na célula por difusão e as bactérias têm comportamentos diferentes na presença de O2 livre: aeróbias exigem a presença de O2 livre; algumas o exigem em pequena quantidade, não tolerando as pressões normais de O2 atmosférico – são as microaerófilas; anaeróbias estritas não toleram a presença de O2 livre, morrendo rapidamente nessas condições; anaeróbias não-estritas não utilizam o O2 atmosférico, mas este não é tóxico; e facultativas tanto podem crescer na presença como na ausência de O2 livre.
· Processo de nutrição em procariotos:
· Bactérias gram-positivas: sintetizam exoenzimas que são liberadas no meio, clivando os nutrientes, que são captados por proteínas transportadoras. 
· Bactérias gram-negativas: porinas associadas à membrana externa permitem a passagem de moléculas hidrofílicas de baixa massa molecular. No espaço periplasmático são encontradas proteases, fosfatases, lipases, nucleases e enzimas de degradação de carboidratos.
· Meios de cultura: nas condições artificiais do laboratório, o crescimento de bactérias é conseguido pela semeadura destas em meios de cultura (material nutriente). Dada a variedade de tipos nutritivos, é fácil compreender que não há um meio de cultura universal. Muitas vezes, o que é exigido por uma determinada bactéria inibe totalmente o crescimento de outras. Ex: a matéria orgânica utilizada para o crescimento de heterotróficas inibe totalmente o crescimento de autotróficas. 
Existem muitos meios de cultura e para se compor um meio adequado, é necessário conhecer a fisiologia das bactérias em estudo. A escolha do meio de cultura deve levar em consideração a origem do material a ser analisado, a espécie que se imagina estar presente nessa amostra e as necessidades nutricionais dos microrganismos. Algumas bactérias não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura desenvolvido. 
Há uma grande variedade de meios de cultura, que podem ser líquidos ou sólidos. 
· Composição dos meios de cultura: basicamente existem dois grandes grupos de meios de cultura: os meios quimicamente definidos ou sintéticos e os meios complexos.
· Meios quimicamente definidos/sintéticos: são aqueles cuja composição exata é conhecida (qualitativa e quantitativamente). Para permitir o crescimento, o meio deverá conter fonte de energia, fonte de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo e todos os fatores orgânicos que o microrganismo não é capaz de sintetizar. Os organismos que necessitam de muitos fatores de crescimento são descritos como “fastidiosos” ou muito exigentes em ternos nutricionais. Ex: para o crescimento de um quimiotrófico, o meio deve conter compostos orgânicos que sirvam como fonte de carbono e energia; para o crescimento da bactéria E. coli, o meio precisa ter: 
· Meios complexos: são feitos de nutrientes como extrato de levedura, de carne, de plantas ou então de produtos de digestão proteica destas e de outras fontes. A composição química exata pode conter pequenas variações em diferentes lotes dos produtos. Muitas bactérias heterotróficas (compostos orgânicos comofonte de C) e fungos crescem normalmente em meios complexos. Nos meios complexos, os fornecedores das necessidades de energia, carbono, nitrogênio e enxofre dos microrganismos em cultura são as proteínas. A proteína é uma molécula grande relativamente insolúvel que a maioria dos microrganismos não pode utilizar diretamente. Através da digestão parcial dessas proteínas, ocorre a produção de pequenas cadeias de aminoácidos denominadas peptonas, que são solúveis e podem ser metabolizadas pelas bactérias. Vitaminas e outros fatores orgânicos de crescimento são fornecidos pelos extratos de carne e de levedura.
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· Estado físico dos meios de cultura: 
· Meios líquidos: as bactérias têm maior facilidade de iniciarem seu crescimento nesse tipo de meio, principalmente quando estão em número pequeno. Se existir mais de um tipo de bactéria no meio semeado, o crescimento final será uma mistura destas, o que impede conclusões de cada uma.
· Meios sólidos: permite a separação de diferentes tipos de bactérias provenientes de um meio líquido em colônia. As colônias são visíveis macroscopicamente e facilmente transferíveis para um novo meio onde crescerão em cultura pura.
· Tipos de meios de cultura: os meios podem ser meios seletivos, meios diferenciais ou meios seletivos e diferenciais (ambos). Eles impedem e/ou diferenciam o crescimento de determinadas bactérias em relação às outras. 
· Meios seletivos: são elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento da bactéria de interesse, inibindo o crescimento de outras bactérias. Ex: no ágar verde brilhante, o corante verde brilhante presente nesse meio inibe gram-positivas e a maioria das gram-negativas, com exceção de Salmonella, que consegue se multiplicar na presença desse corante.
· Meios diferenciais: são utilizados para a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa. Ex: o meio de ágar sangue é utilizado na identificação de bactérias capazes de lisar (quebrar) células sanguíneas, como Streptococcus pyogenes, causadora de infecções de garganta (forma um anel claro em torno da colônia). O Streptococcus pode causar hemólise (alteração/destruição dos glóbulos vermelhos) no ágar-sangue. 
· Meios seletivos e diferenciais: em alguns casos, as características dos meios seletivos e diferenciais podem ser combinadas no mesmo meio de cultivo. Ex: o ágar MacConkey é seletivo, pois contém sais biliares e cristal violeta, que favorecem o crescimento de bactérias gram-negativas, inibindo o crescimento de gram-positivas; e é diferencial, pois contém lactose, permitindo diferenciar as bactérias gram-negativas capazes de utilizar a lactose daquelas que não a utilizam.
· Ágar MacConkey: as bactérias fermentadoras de lactose formam colônias vermelhas ou rosas. As bactérias não fermentadoras de lactose formam colônias incolores. Os fermentadores intensos de lactose, como Escherichia, Klebsiella e Enterobacter apresentam suas colônias rosas/vermelhas. Os fermentadores lentos ou fracos de lactose, como Citrobacter, Providencia, Serratia e Hafnia podem aparecer incolores ou transparentes após 24 horas ou rosa pálidos em 24 a 48 horas. Os não fermentadores de lactose, como Proteus, Edwardsiella, Salmonella, Shigella e Yersinia, com raras exceções, produzem colônias incolores ou transparentes.
· Ágar Manitol: esse meio de cultura apresenta 7,5% de NaCl, o que resulta na inibição parcial ou completa de microrganismos que não sejam Staphylococcus. Com a fermentação do Manitol, há alteração de pH e, consequentemente, alteração da cor do meio. Staphylococcus aureus fermentam Manitol, por isso a sua colônia fica amarela. Já o Staphylococcus epidermidis não fermenta, por isso sua colônia fica rosa.
 
· Ágar SS (Salmonella-Shigella): é um meio moderadamente seletivo e diferencial. Possui a finalidade de selecionar e isolar espécies de Salmonella spp. e Shigella spp. A cor original do meio é vermelho alaranjado. Se formar colônias com centro negro (H2S) ou colônias incolores, é suspeita de Salmonella spp. Se formar colônias incolores, é suspeita de Shigella spp. Se formar colônias rosas ou vermelhas, é suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores. As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa. 
· Ágar Sabouraud (Sb): esse meio contém alta concentração de glicose, que é fonte de energia e vantagem para o desenvolvimento de fungos (estáveis por osmose). O pH baixo (5,6) é ideal para fungos, mas não para muitas bactérias. O meio ainda contém cloranfenicol, que é um antibiótico acrescentado para inibir o crescimento bacteriano. Esse meio não é muito seletivo, mas favorece o crescimento de diversos fungos leveduriformes e filamentosos. Tem a finalidade de cultivo e crescimento de espécies de Candida e fungos filamentosos, particularmente associados a infecções superficiais. A cor original do meio é amarelo claro opalescente. Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.
 
· Meios e metodologia para o crescimento de anaeróbios (meios redutores): o cultivo de bactérias anaeróbias apresenta um problema especial. Como o oxigênio pode causar a morte de bactérias anaeróbias, deve-se utilizar para seu crescimento meios de cultivo especiais, denominados meios redutores. Estes meios contêm reagentes, como tioglicolato de sódio, que são capazes de se combinar com o oxigênio dissolvido eliminando esse elemento do meio de cultura. A cultura rotineira de anaeróbios obrigatórios é realizada em tubos contendo tampas seladoras.
· Jarras de anaerobiose: quando é necessária a utilização de placas de Petri para a obtenção de colônias isoladas, são utilizadas jarras especiais (jarras de anaerobiose). Uma embalagem contendo reagentes químicos é colocada na jarra umedecida com alguns mililitros de H2O. A jarra é selada e, por meio da reação dos produtos químicos com H2O, ocorre a liberação de H2 e CO2. Um catalisador de paládio combina o O2 presente com o H2 liberado, formando H2O (há a eliminação do O2). 
· Muitos pesquisadores que trabalham regularmente com anaeróbios utilizam capelas especiais transparentes totalmente seladas contendo gás inerte sem oxigênio no seu interior. 
· Meios de enriquecimento: são utilizados para o isolamento de bactérias persentes em pequeno número em relação a outras que estão em grande quantidade. O meio de enriquecimento é líquido e contém todos os nutrientes necessários para favorecer a multiplicação da bactéria de interesse. Pode ser considerado um meio de enriquecimento seletivo se apresenta a característica especial de favorecer o crescimento do organismo de interesse, tornando possível sua detecção.
· Outros fatores envolvidos na nutrição:
· Temperatura: cada microrganismo tem um ótimo de temperatura para a absorção de nutrientes e que está intimamente relacionado ao seu crescimento e desenvolvimento. Os microrganismos podem ser classificados como psicrófilos (crescem e absorvem melhor nutrientes entre as temperaturas de 0°C e 20°C), mesófilos (entre 25°C e 40°C) e termófilos (entre 40°C e 70°C). 
· Concentração hidrogeniônica (pH): para bactérias os valores de pH em torno de 7 são os mais adequados para a absorção dos nutrientes, embora existam algumas bactérias adaptadas a viver em ambientes ácidos e alcalinos. A maioria das bactérias cresce melhor dentro de variações pequenas de pH, sempre perto da neutralidade, entre pH 6,5 a 7,5. Para bolores e leveduras, a faixa de pH é mais ampla. 
· Crescimento bacteriano: o crescimento é uma somatória dos processos metabólicos progressivos, que normalmente conduz à divisão (reprodução assexuada) com produção de duas células-filhas a partir de uma célula mãe. 
· Curva de crescimento bacteriano: quando uma determinada bactéria é semeada em um meio líquido de composição apropriada e incubada em temperatura adequada o seu crescimento segue uma curva característica e definida. 
1) Fase de lag: é a fase durante a qualpraticamente não ocorre divisão celular, porém há aumento de massa. A fase lag é considerada um período de adaptação que precede a fase logarítmica. Essa fase não deve ser considerada um período de repouso, mas sim de intensa atividade metabólica. 
2) Fase logarítmica (log) ou exponencial: é aquele período durante o qual a multiplicação é máxima e constante. As bactérias crescem e se reproduzem assexuadamente por fissão binária. Cada duplicação do número de bactérias numa cultura representa uma nova geração (aumento logarítmico – 1 bactéria gera 2, as quais geram 4, as quais geram 8, as quais geram 16, as quais geram 32, as quais geram 64 e assim por diante – na inoculação de uma só célula, a proporção se daria da seguinte maneira – 1: 2: 4: 8: 16: 32: 64: ...). A fase logarítmica termina quando as condições do meio de cultura se alterarem pela atividade metabólica das bactérias, não provendo mais as condições necessárias para manter o crescimento uniforme. 
3) Fase estacionária: é a fase durante a qual a velocidade de multiplicação diminui gradualmente, até que se anule. Durante essa fase, o número de bactérias novas equivale ao número daquelas que estão morrendo. A falta de nutrientes, acúmulo de materiais tóxicos, alteração de pH, entre outros fatores, podem cessar o crescimento de uma cultura. 
4) Fase de declínio: nessa fase, os microrganismos começam a morrer e diminuem de número exponencialmente. A excessiva falta de nutrientes e o acúmulo de materiais tóxicos são as principais causas de morte. 
· Fatores que influenciam no crescimento de microrganismos: o tempo de geração, que implica diretamente na velocidade de crescimento, depende de uma série de fatores, como a temperatura de incubação, aeração do meio, concentração de íons hidrogênio (pH), natureza do organismo, entre outros. 
· Temperatura de incubação: os diferentes microrganismos apresentam, conforme seu habitat natural, diferentes ótimos de temperatura, onde suas enzimas estão na forma mais ativa. Assim, obedecida essa temperatura ideal, o tempo de geração será menor. Ex: psicrófilos crescem em baixas temperaturas, entre 0°C e 20°C (ótima: 15°C); mesófilos crescem em temperatura moderadas, entre 25°C e 40°C (ótima: 37°C); termófilos crescem em altas temperaturas, entre 40°C e 70°C (ótima: de 50 a 60°C). Cada espécie bacteriana apresenta uma temperatura mínima, ótima e máxima para seu crescimento.
OBS: a temperatura ótima de crescimento de muitas bactérias patogênicas fica em torno de 37°C (mesófilas).
· Aeração do meio: a aeração acelera o crescimento de organismos aeróbios estritos e de facultativos fermentativos. Entretanto, a aeração é completamente tóxica para os anaeróbios estritos. 
· Concentração de íons hidrogênio (pH): o pH do meio de cultura é um fator muito importante para a atividade enzimática. De maneira geral, o pH próximo do neutro (para bactérias) é requerido para o desenvolvimento da cultura em termos de velocidade. Acredita-se que a medida que o pH se afasta da neutralidade, os íons presentes no meio afetam proteínas, como por exemplo as permeases, impedindo assim uma penetração adequada dos nutrientes.
· Natureza do organismo: dependendo das características metabólicas dos microrganismos, seu tempo de geração será maior ou menor. Ex: 10 minutos para bactérias marinhas; vários dias para espécies do gênero Mycobacterium.