Sequenciamento de DNA e Aplicações

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Prof. Dr. Júlio César Borges 
 
Eduardo Nazaré 
Felipe Gonçalves 
Renato Capelo 
 Introdução 
Método de Sanger 
Pirosequenciamento 
 Ion Torrent 
Aplicações 
 
 
 Desde a descoberta da dupla fita de DNA 
surgiram diversas ciências, entre elas a 
genética e a biologia molecular. 
 Os estudos surgiram com o objetivo de 
conhecer o funcionamento de uma célula ou 
organismo, além de conhecer possíveis 
doenças e tentar encontrar a cura. 
 Para que isso fosse possível foram 
descobertos várias técnicas, entre elas o 
sequenciamento do genético, afim de 
descobrir a sequência das bases nitrogenadas 
do DNA. 
 O primeiro método de sequenciamento de 
DNA surgiu em meados dos anos 70 e ficou 
conhecido como método químico ou Maxam 
– Gilbert, método no qual foi amplamente 
aplicável na época. 
 Alguns anos depois, em 1977, Frederick 
Sanger propõe um método diferente e mais 
eficiente chamado de método enzimático ou 
de Sanger. Esse método logo se tornou 
altamente replicável e é utilizado até os dias 
de hoje. 
 Frederick Sanger nasceu em 1918 e faleceu 
em 2013 aos 95 anos em Cambridge, onde 
era pesquisador no laboratório de biologia 
molecular da Universidade de Cambridge. 
 Ganhador de 2 prêmios Nobel. 
 1977: Sanger desenvolve seu método de 
sequenciamento de DNA. 
 A partir daí sequencias com até 96% de 
similaridade puderam ser diferenciadas. 
 O DNA é formado por duas fitas antiparalelas de nucleotídeos complementares 
formando uma dupla hélice. 
 Sanger descobriu que se conseguisse 
interromper a replicação de um mesmo 
DNA em pontos diferentes ele poderia 
juntar essas fitas menores e formar a 
sequência completa do DNA. 
 O método consiste em adicionar 
didesoxiribonucleotídeos (ddNTP’s), que 
são nucleotídeos modificados que não 
possuem o grupo OH livre no carbono 3’ 
da pentose. 
 Existem quatro tipos de ddNTP’s, um para 
cada base nitrogenada (A,T,G,C). 
 Quando os ddNTP’s tentam se ligar com a 
fita de DNA, com a ausência do OH, o 
próximo nucleotídeo não têm onde se 
ligar e a replicação para. 
 Assim é possível obter fitas do mesmo 
DNA com número de resíduos diferentes. 
 A reação é realizada em 4 tubos de ensaio. 
 Cada tudo contêm: 
 DNA; 
 DNA polimerase; 
 Primer; 
 Nucleotídeos; 
 E um tipo de ddNTP diferente. 
 Após isso ocorre a replicação em todos os tubos. 
 Dentro de cada tubo a replicação 
acontece e termina em lugares diferentes. 
 No final do processo temos fragmentos 
da fita de DNA de diferentes tamanhos. 
 O conteúdo desses tubos é aplicado em 
gel de poliacrilamida e separado por 
tamanho (eletroforese). 
 Os fragmentos menores ficaram mais em 
baixo e os maiores mais em cima. 
 Para obter a sequência do DNA, a leitura 
é feita de baixo para cima, resultando em 
fragmentos que se sobrepõem, e formam 
a fita completa de DNA. 
 Proposto por Mostafa Ronaghi (1996); 
 Instituto Real Tecnológico da Suécia; 
 Pesquisador na Universidade de Stanford; 
 Vice-presidente da Illumina Company; 
 Primeira alternativa ao método de Sanger para sequenciamento do DNA. 
 
 Detecção através da Luz; 
 Liberação de Pirofosfato na adição de um nucleotídeo; 
 Ação de 4 diferentes enzimas: 
 DNA polimerase; 
 ATP sulfurilase; 
 Luciferase; 
 Apirase; 
 Substratos utilizados: 
 Adenosina 5’ fosfossulfato (APS); 
 Luciferina; 
 Resultados obtidos rapidamente. 
 
 Passo 1 
 Extração do DNA. 
 
 Passo 2 
 Adição do Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (dNTP); 
 DNA polimerase catalisa a incorporação do dNTP na fita; 
 Complementar à fita molde; 
 Liberação de pirofosfato (PPi); 
 Quantidade equivalente à de nucleotídeos incorporados. 
 Passo 3 
 ATP sulfurilase converte PPi para ATP; 
 Presença de adenosina 5’fosfossulfato (APS); 
 Conversão de luciferina em oxiluciferina (pela luciferase); 
 Luz visível; 
 Proporcional à quantidade de ATP; 
 Detcção é feita por um chip ; 
 Gera um pico na saída de dados do software; 
 Cada pico (sinal de luz) é proporcional ao número de nucleotídeos. 
 Passo 4 
 Apirase degrada nucleotídeos não incorporados e ATP; 
 Após degradar, mais nucleotídeos são adicionados. 
 Passo 5 
 Adição de dNTP é realizada sequencialmente; 
 Cadeia complementar de DNA é construída; 
 Sequência nucleotídica é determinada a partir dos picos. 
• Identificação de bactérias; 
• Tipagem fúngica e viral; 
• Detectar mutações; 
• Análises de metilação do DNA; 
• Sequências múltiplas; 
• Verificações de clones; 
• Sequenciamento do genoma humano. 
 Vantagens: 
 Processo automatizado 
 Tempo de análise curta; 
 Resposta instantânea do sequenciamento; 
 Alto rendimento; 
 Preparo rápido da amostra; 
 
 Desvantagens: 
 Custo elevado; 
 Grande conhecimento de bioinformática; 
 Taxa de erro considerada alta (0,0098) 
 
 Sequenciamento de DNA da nova 
geração; 
 Pesquisadores de Connecticut, USA; 
 Pretendem democratizar o 
sequenciamento 
 Desejam chegar em US$ 1000; 
 
 Necessidade de remoção do 
sinalisador 
 Parecido com o pirosequenciamento; 
 
 Utiliza microchip para deterctar a 
incorporação do dNTP; 
 
 Chip mede a diferença de pH; 
 
 Evolução acompanha informática; 
 
 
 
 DNA é fragmentado; 
 Adição de marcadores; 
 Cada fragmento liga-se a um “bead”; 
 “Beads” são posicionados em poços; 
 Ocorre replicação do fragmento; 
 Cobre o “bead”; 
 Poços individuais; 
 Banho de dNTP; 
 Caso dNTP ligue-se, libera H+; 
 Variação do pH detectada pelo chip; 
 
 Análises rápidas ~2h; Elevada sensibilidade; 
 Ideal para DNA pequeno a médio; Baixo custo; 
 Localiza prontamente sítios específicos no DNA; 
 Altamente recomendado para avaliação de fragmentos específicos; 
 
 Biologia molecular 
 Sequenciamento é utilizado no estudo de 
genes e quais proteínas codificam; 
 Assim, o que levam trocas nos genes? 
 Biologia evolutiva 
 O sequenciamento do DNA é útil para 
entender como diferentes organismos estão 
relacionados; 
 Medicina 
 Pacientes podem saber se apresentam 
doenças genéticas; 
 Ciência forense 
 Identificação; 
 Teste de paternidade; 
 
 
 
 Obrigado.