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Influência dos métodos de cozimento e tempo de armazenamento na oxidação lipídica e protéica e na produção de aminas aromáticas heterocíclicas em bacon Abstrato Este estudo teve como objetivo examinar a influência dos métodos de cozimento e dias de armazenamento pré-determinados refrigerados na produção de oxidação lipídica (TBARS), oxidação de proteínas (PROTOX) e aminas aromáticas heterocíclicas (HAA) em bacon. Quarenta e quatro barrigas de porco selecionadas de suínos variando em raça, sexo e dietas para introduzir variabilidade na composição foram processadas como bacon. O bacon fatiado foi armazenado a 4 ° C durante 2 ou 28 dias e estes grupos de armazenamento foram cozinhados com microondas ou frigideira. Microondas levou a significativamente maior PROTOX (P <0,001), enquanto frigideira levou a níveis mais elevados de HAA e TBARS em bacon (P <0,001). O cozimento da frigideira aumentou a salinidade e a friabilidade do bacon (P <0,05), enquanto outros atributos sensoriais não foram afetados (P> 0,05) pelos métodos de cozimento e tempos de armazenamento. Da mesma forma, a composição de ácidos graxos da barriga de porco não influenciou significativamente a produção de HAA, TBARS e PROTOX produzidos no bacon durante o cozimento. No geral, a cocção de microondas teve menor impacto na produção de compostos carcinogênicos no bacon, com apenas pequeno impacto nos atributos sensoriais. 1. Introdução Dados epidemiológicos, bem como estudos em animais, destacaram o papel importante que a dieta desempenha no desenvolvimento do câncer, especialmente no que se refere ao consumo de carne. Durante os procedimentos de processamento térmico da carne, vários compostos carcinogênicos podem ser produzidos. Estes podem incluir compostos N-nitroso (NOC), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH), produtos de oxidação lipídica e aminas aromáticas heterocíclicas (HAA), entre outros. A ingestão dietética de proteínas oxidadas e seus impactos na saúde humana têm sido objeto de muitas pesquisas científicas recentes. Como o advento da maioria desses compostos tem sido influenciado pelos métodos de cozimento, tempo de cozimento e temperatura de cozimento, a escolha do processamento ou do método de cozimento pelos consumidores, bem como a modificação do estilo de cozimento existente, pode aliviar significativamente a extensão quais estes compostos carcinogênicos são produzidos em produtos cárneos (Kizil, Oz, & Besler, 2011). Aminas heterocíclicas aromáticas são mutagênicos potentes que podem desempenhar um papel crucial na etiologia do câncer, já que estudos anteriores mostraram que eles são carcinogênicos e genotóxicos em estudos em animais e durante testes de reparo de DNA, respectivamente (Jägerstad, Skog, Arvidsson, & Solyakov , 1998). Dois grupos de HAA foram identificados. Estes incluem o tipo IQ ou aminoimidazoazereno HAA e os grupos HAI do tipo não QI ou aminocarbolina (Jägerstad et al., 1998; Kizil et al., 2011). Segundo Gibis (2016), esses dois grupos também correspondem ao HAA polar e não polar e são amplamente produzidos sob diferentes condições de cozimento. O primeiro grupo é formado por escurecimento não enzimático induzido pelo calor (reação de Maillard) durante temperaturas de cozimento convencionais entre 150 e 300 ° C envolvendo reação de creatina ou creatinina, aminoácidos e hexose. O tipo não-QI, por outro lado, é formado pela reação pirolítica entre aminoácidos e proteínas em temperatura mais alta, geralmente acima de 300 ° C (Kizil et al., 2011). A oxidação de proteínas (PROTOX) é a alteração covalente da proteína, induzida diretamente por espécies reativas de oxigênio (ROS) ou indiretamente pela reação com produtos secundários do estresse oxidativo. As carbonilas proteicas foram identificadas como o principal produto da oxidação proteica mediada por radicais e têm sido aclamadas como marcas em numerosas condições patológicas. Revisões recentes também destacaram o possível envolvimento de proteínas oxidadas em muitas doenças (Estévez & Luna, 2016; Soladoye, Juárez, Aalhus, Shand, & Estévez, 2015). Alguns estudos demonstraram que as proteínas oxidadas podem contribuir para as doenças inflamatórias intestinais (DII) (Keshavarzian et al., 2003), degeneração fibrótica do fígado e rins (Li, Shi, Le, Ding e Zhao, 2015) e outras doenças relacionadas à idade. como a doença de Alzheimer e a cataratogênese (Berlett & Stadtman, 1997). Da mesma forma, os produtos de oxidação lipídica têm sido fortemente associados à patogênese de vários distúrbios, incluindo doenças cardiovasculares e inflamatórias, condições gastropáticas, mutagenicidade, genotoxicidade e teratogenicidade (Albert, Cameron-Smith, Hofman, & Cutfield, 2013). Tem sido relatado que os tratamentos térmicos aceleram os processos oxidativos não apenas nos lipídios, mas também nas proteínas devido ao seu efeito crescente sobre a produção de radicais livres e ao efeito decrescente na proteção antioxidante dos alimentos (Santé-Lhoutellier, Astruc, Marinova, Greve e Gatellier, 2008a). ). Tendo a compreensão de que a produção de substâncias cancerígenas é dependente e pode ser largamente influenciada pelo processo e métodos de cocção, as recomendações sobre formas de limitar a sua produção durante a cozedura doméstica ou industrial podem ser o melhor sistema de intervenção de saúde pública. O objetivo do nosso estudo foi observar como o tempo de armazenamento e dois métodos amplamente utilizados para cocção de bacon (frigideira e cozimento em microondas) podem influenciar os níveis de HAA, PROTOX e oxidação lipídica. O impacto sobre os atributos sensoriais do bacon também foi avaliado. Este é o primeiro estudo que avalia o nível de PROTOX em bacon cozido, comparando diferentes métodos de cozimento. 2. Materiais e métodos 2.1. Manejo de animais, seleção de amostras e produção de bacon Todos os tratamentos dietéticos e procedimentos experimentais foram aprovados pelo Animal Care Committee do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento Agricultura e Agricultura Agri-Food Canadá-Lacombe e os suínos foram cuidados conforme descrito nas diretrizes estabelecidas pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC, 1993). . Depois de atingir os pesos de abate exigidos (120-140 kg), os animais foram eletricamente atordoados e abatidos de acordo com o processo convencional de abate. Quarenta e quatro barrigas direitas foram selecionadas aleatoriamente de um pool populacional experimental maior (Soladoye et al., 2016), incluindo porcos e porcos de dois cruzamentos (açudes Lacombe ou ibérico × Large White ∗ Landrace F1), alimentados com duas dietas [alimento convencional ou 10% de Extrapro (50% de ervilha e 50% de linho)]. Esses animais foram selecionados com esses critérios para criar uma população com variação inerente na composição da carcaça. Barrigas foram enviadas para processamento em placas de bacon em uma planta de processamento comercial em Edmonton, AB, Canadá, e foram devolvidas à unidade de pesquisa embalada em caixas de linha de polietileno sob refrigeração para posterior análise. Durante o processamento, as barrigas foram injetadas com ~ 12,5% de salmoura contendo 9,1% de sal de cura (~ 6,25% de nitrito em sal comum) e ~ 1% de açúcar mascavo. Os horários de fumar foram os seguintes: 2 horas a 65 ° C, 1 hora a 70 ° C, depois 30 minutos a 80 ° C. Isto foi seguido por cozimento a vapor a 80 ° C até a temperatura interna de 65 ° C. 2.2. Bacon cozinhar e tratamentos No prazo de 24 horas após o recebimento, as 44 placas de bacon de cada animal foram cortadas manualmente (cortador de gravidade Globe, Stamford, Conn, EUA) em fatias de 2,45 mm de espessura e embaladas a vácuo com cada pacote contendo seis fatias. Cinco pacotes foram coletados de cada placa de bacon. Um pacote foi congelado (-30 ° C) imediatamente e isso representou o controle (não cozido e 0 d de armazenamento, que será posteriormente chamado de "controle de bacon" neste artigo). Duas das embalagens foram mantidas a 4 ° C por 2 dias, uma para cozinhar em microondas e outra para cozinharem frigideira. Os dois últimos conjuntos foram refrigerados (4 ° C) durante 28 dias, após o que foram cozidos com microondas ou frigideira. Outras quatro embalagens correspondentes foram coletadas e submetidas ao tratamento similar descrito acima (exceto tratamento controle) e usadas para avaliação sensorial. O cozimento de microondas foi feito com Baconwave ™ (Emson Inc., NY, EUA), um utensílio de cozinha para cozinhar com bacon no microondas. O microondas (Amana Radarange, Modelo CRSW459P, 850 W, Newton, Iowa, EUA) foi ajustado para cinco minutos para cozinhar o bacon. Para a fritura em panela, um Garland Grill (Ed30b, Condo Barr Food Equipment Ltd., Edmonton, AB, Canadá) foi pré-ajustado a 250 ° C e as frigideiras foram colocadas na grelha e equilibradas à temperatura de cozimento antes do cozimento. As fatias de bacon foram preparados de um lado por 5 min, viradas e cozidos por 2,5 min e, em seguida, voltou a cozinhar para um final 1 min. Os tratamentos de micro-ondas e panela foram previamente testados para fornecer um grau semelhante de cozimento. Fatias de bacon foram resfriadas por 10 min e limpas com papel toalha. As fatias de bacon foram pesadas antes e depois dos tratamentos de cozimento para calcular as perdas de cozimento. 2.3. Preparação de amostra Após os dias de armazenamento e cozimento, as fatias de bacon foram trituradas usando um cupê robótico (Robot Coupe Blixir BX3, Robot Coupé USA Inc .; Ridgeland, MS, EUA). Estas amostras foram armazenadas congeladas a -80 ° C até nova análise. As amostras foram ainda mais congeladas antes da análise química usando um almofariz e pilão para assegurar uma amostragem homogénea. 2.4. Análise de carbonilação de proteínas 2.4.1. Síntese dos padrões autênticos de AAS e GGS AAS-ABA e GGS-ABA autênticos foram respectivamente sintetizados a partir de Na-acetil-l-lisina e Na-acetil-L-ornitina usando a actividade da lisil oxidase da membrana da casca do ovo seguindo o procedimento descrito por Utrera, Morcuende, Rodríguez-Carpena e Estévez (2011). Resumidamente, Na-acetil-l-lisina (188 mg) e Na-acetil-L-ornitina (174 mg) foram incubadas individualmente com 5 g de membrana de casca de ovo em 100 mL de tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 9,0) a 37 °. C por 24 h com agitação contínua. Após a remoção da membrana da casca do ovo por centrifugação, o pH da solução foi ajustado para 6,0 usando HCl 1M. Os aldeídos resultantes foram então aminados de forma redutiva com ácido p-aminobenzóico (ABA, 2 g como sólido) na presença de cianoboro-hidreto de sódio (NaBH3CN, 1,5 g como sólido). Deixou-se a mistura reagir a 37 ° C durante 20 h com agitação constante. Cem mililitros de HCl 12 M foram cuidadosamente adicionados à solução que foi depois arrefecida durante cerca de 1 hora e depois hidrolisada durante 10 horas a 110 ° C num tubo. O hidrolisado foi evaporado em secador a vácuo a 45 ° C (concentrador de vácuo centrífugo refrigerado a ácido Centrivap resistente a ácido, Labconco, Kansas City, EUA). O resíduo resultante foi posteriormente reconstituído em 100 mL de água destilada. Esta solução foi empregada como padrão. 2.4.2. Preparação de amostra de bacon para análise PROTOX HPLC-FLD Detalhes da derivatização da amostra foram relatados por Utrera et al. (2011). 1 g de bacon triturado finamente foi derivatizado com 0,5 ml de ABA (250 mM em tampão MES pH 6,0) na presença de 0,25 ml de NaBH3CN (100 mM em tampão MES 250 mM, pH 6,0). Esta proteína derivatizada foi então submetida a hidrólise ácida e depois seca a 45 ° C utilizando o concentrador de vácuo. O hidrolisado seco foi reconstituído em 1000 mL de água grau HPLC e filtrado através de filtros de seringa de polipropileno GH polypro (GHP) hidrófilos (tamanho de poro de 0,45 µm, Pall Corporation, EUA) para análise por HPLC. 10 μL dos hidrolisados de proteínas derivatizados reconstituídos foram injetados e analisados usando o sistema de HPLC Waters Alliance (Milford, MA, EUA) equipado com coluna de RP-HPLC COSMOSIL 5C18-AR-II (150 × 4.6 mm) e uma coluna de guarda (10 × 4.6 mm) contendo material de embalagem semelhante. 10 μL do padrão reconstituído também foi injetado e submetido a condições semelhantes às amostras. O programa de eluição foi baseado no método de gradiente de baixa pressão de Utrera et al. (2011) com Eluente A: tamp de acetato de sio a 50 mM pH 5,4 e Eluente B: acetonitrilo em que a concentrao do eluente B variou de 0% (min 0) a 8% (min 20). O caudal foi mantido a 1 mL / min, a temperatura da coluna a 30 e um tempo de funcionamento total de 30 min. O eluato foi monitorado com comprimentos de onda de excitação e emissão de 283 nm e 350 nm, respectivamente. A identificação de AAS-ABA e GGS-ABA no cromatograma FLD foi feita comparando seus tempos de retenção com aqueles dos padrões. Esses componentes foram manualmente integrados e suas áreas resultantes foram plotadas contra uma concentração conhecida (0,01-0,05 mM) da curva padrão ABA com R2> 0,9991. Isto segue a suposição de que a fluorescência emitida por 1 mol de ABA é equivalente àquela emitida por 1 mol de AAS-ABA ou GGS-ABA. Os resultados foram expressos em nmol carbonil / mg proteína onde a proteína do bacon foi quantificada usando um cubo RapidN (Elementar, Rhine main, Alemanha) empregando o método de combustão Dumas. O teor de proteína das amostras variou entre 8,0 e 63,0 g / 100 g. Todos os reagentes utilizados foram de grau HPLC e adquiridos da Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, EUA). 2.5. Oxidação lipídica A oxidação lipídica foi medida como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) de acordo com Nielsen, Sørensen, Skibsted e Bertelsen (1997). Resumidamente, 5 g de bacon finamente moído foram homogeneizados durante 30 s em 30 mL de solução de TCA a 7,5% com um homogeneizador Polytron (PT 3100 D, Kinematics, Littau-Luzern, Suíça). O homogenato foi filtrado através de papel de filtro Whatman # 4 e 2,5 mL de solução de TBA (20 mM) foram adicionados a 2,5 mL do filtrado em tubos de topo de rosca pirex. Os tubos foram sujeitos a vtice e deixados a incubar durante 40 min em banho de ua a 94. O MDA total (malondialdeído) nas amostras foi medido espectrofotometricamente a 541 nm e quantificado contra uma curva padrão (1,1,3,3-Tetraetoxi-propano, 0-20 µM, R2> 0,99). Os resultados foram expressos em mgMDA / kg de amostra. 2.6. Análises de aminas aromáticas heterocíclicas 2.6.1. Preparação dos Padrões de HAA Todos os padrões HAA (pureza> 98%) foram adquiridos à Toronto Research Chemicals (North York, ON, Canadá): 2-amino-3-metil-3H imidazo [4,5, f] quinolina (IQ), 2-amino- 3-metil-3H imidazo [4,5, f] quinoxalina (IQx), 2-amino-3,4-dimetil-3Himidazo [4,5, f] quinolona (MelQ), 2-amino-3,8-dimetilo -3H imidazo [4,5, f] quinoxalina (MelQx), 2-amino-3,7,8-trimetil-3H imidazo [4,5, f] quinoxalina (7,8-DiMelQx), 2-amino-3 , 4,8-trimetil-3H-imidazo [4,5, f] quinoxalina (4,8-DiMelQx), 2-amino-3,4,7,8- tetrametil-3H-imidazo [4,5, f] quinoxalina ( TriMelQx), acetato de 3-amino-1-metil-5H-pirido [4,3-b] indole (Trp-P-2), 3-amino- 1,4-dimetil-5H-pirido [4,3-b] indole acetato (Trp-P-1), 2-amino-9H-pirido [2,3- b] indole (AaC), 2-amino-3-metil-9H-pirido [2,3-b] indole (MeAαC), 2 -amino-6-metidipirido [1,1-A: 3,2] imidazole, hidrato de cloridrato (Glu-P-1), 2-amino dipirido [1,2-A: 3,2D] imidazole, dicloreto (Glu P -2), Norharmane, Harmane e 2-amino-l-metil-6-fenilimidazo [4,5-b] piridina (PhIP). Todos os solventes utilizados neste estudo eram de grau HPLC. Trietilamina, HCl, NaOH e acetato de amio foram adquiridos da Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, EUA). O ácido propil-sulfônico (PRS), os cartuchos Bond-Elut (500 mg), os cartuchos C-18 (100 mg), o reservatório Bond-Elut e os materiais de embalagem (terra diatomácea) foram obtidos da Varian (Harbor City, CA, EUA). . Um padrão combinado de trabalho foi preparado a partir das respectivas soluções de estoque individuais. A concentração do padrão individual em ng / μL dentro da combinação foi a seguinte: QI, 0,2; IQx, 0,2; MeIQ, 0,24; MeIQx, 0,24; TriMeIQx, 0,24; 4,8 DiMeIQx, 0,15;7,8 Di MeIQx, 0,15; Glu P-1, 0,05; Glu P-2, 0,05; Harmane, 0,05; Norharmane, 0,08; Trp-P-1, 0,05; Trp-P-2, 0,1; PhIP, 0,07; AAC, 0,07 e MeAaC, 0,05 (padrão interno). 2.6.2. Extração de amostra HAA e análise HPLC Quinze HAAs diferentes foram analisados para cada amostra de bacon, incluindo o tipo IQ (IQx, IQ, MeIQ, MeIQx, 7,8 DiMeIQx, 4,8 DiMeIQx, 4,7,8 TriMeIQx e PhIP) e o tipo sem QI (Glu P-2 , Glu P-1, Norharman, Harman, AAC, Trp P-2 e Trp P-1). A extração da amostra foi baseada em Ruan, Juárez et al. (2014). Resumidamente, 1 ± 0,05 g de bacon cozido no solo foi pesado em duplicado em tubos de centrífuga de 50 mL. No caso da amostra de controlo em bruto, devido ao seu elevado teor de humidade, pesou-se 3 ± 0,05 g de amostra. Para amostras, 7,5 mL de NaOH 1 M e 100 mL do padrão interno foram adicionados e as amostras foram deixadas em repouso por 20 min a 37 ° C. Subsequentemente, adicionou-se 2,75 g de terra diatom�ea (Agilent Hydromatrix Bulk Material 198 003) e 25 mL de acetato de etilo (Fluka 34 972) e as amostras foram submetidas a v�tice durante 20 min (Multi Pulse Vortexer 099A VB4, Terre Haute, EUA). As amostras foram centrifugadas por 5 min a 6900 rpm e extraídas usando o cartucho PRS. As aminas heterocíclicas foram eluídas de PRS para um cartucho C18 e depois eluídas do C18 para tubos limpos utilizando 1,2 mL de metanol: amónio (9: 1 v: v) sob vácuo baixo. Os solventes foram evaporados das amostras eluas a temperatura ambiente sob azoto e reconstituos com 120 de tamp fosfato de trimetilamina, 0,01 M, pH 3,0 / metanol (1: 1) para injeco de HPLC. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada utilizando o HPLC Waters Alliance (Milford, MA, EUA) equipado com coluna TSKgel Super-ODS C18 (4,6 mm × 10 cm com tamanho de partícula de 2 µm; TOSOH Bioscience, São Francisco, CA, EUA). EUA). A fase móvel foi um gradiente de solvente A (trietilamina 0,01 M, pH 3,0), solvente B (trietilamina 0,01 M, pH 4,0) e solvente C (acetonitrilo) a um caudal de 1 mL / min. O programa detalhado de eluição foi relatado anteriormente (Ruan, Juárez et al., 2014). Os analitos foram detectados usando UV / FLR e o tempo total de execução do programa foi de 21 min. As determinações quantitativas foram realizadas usando as curvas de calibração padrão (R2 = 0,9896–0,9999). O LOD foi (~ 1,89 × 10− 3 ng / g, média dos padrões) determinado usando a fórmula 3.3 ∗ (desvio padrão do intercepto y / declive da curva de calibração) enquanto o LOQ (~ 5.73 × 10− 3 ng / g, média) foi determinado usando 10 ∗ (desvio padrão do intercepto y / declive da curva de calibração). A recuperação de HAAs usando o padrão interno também variou entre 57,14 e 88,10%, similar ao que foi relatado anteriormente em nosso estudo anterior em carne bovina (Ruan, Juárez et al., 2014). 2.7. Avaliação sensorial A avaliação sensorial do bacon foi realizada por um painel treinado de sete membros. Bacon foi cego codificado e apresentado quente para os painelistas em um stand bem ventilado, particionado sob 124 Lx relâmpago vermelho. Uma escala de nove pontos foi empregada, com 9 representando "extremamente intenso" e 1 referindo-se a "nenhum" para todos os atributos (crocância inicial e geral, intensidade de sal, sabor de bacon, sabor de fumaça, revestimento bucal, mastigabilidade e intensidade do sabor). exceto a intensidade do sabor, que estava em ordem inversa (Holdstock et al., 2014). As classificações de atributos foram coletadas eletronicamente usando o software de computador Compusense 5 (Release 4.6) (Compusense Inc. Guelph. ON). Suco de maçã e bolachas sem sal foram fornecidos aos entrevistados para limpar seu paladar de notas de sabor entre as amostras. 2.8. Análise estatística Os dados foram analisados utilizando um planejamento fatorial com métodos de cozimento (microondas e frigideira) e dias de armazenamento (2 e 28 dias) como fatores. Os dados para cada combinação de tratamento representaram a diferença entre o tratamento e o controle, exceto os dados sensoriais, que foram analisados de forma não paramétrica (usando o PROC NPAR1WAY do SAS). O procedimento PROC MIXED no SAS versão 9.3 (SAS Institute Inc., 2011) foi usado para analisar todos os dados e as diferenças significativas foram declaradas em P <0,01. A correlação entre a composição química do bacon e da carne de porco dentro de cada grupo de tratamento, bem como a média de todos os tratamentos, também foram realizadas usando o procedimento PROC CORR no SAS. Para examinar a possibilidade de explicar a variação dentro dessas amostras com menos parâmetros, o Minitab 17 Statistical Software (Minitab, 2010) foi usado para explorar os principais componentes empregando vários compostos quantificados neste estudo como variáveis. 3 Resultados e discussão Houve ampla variação na composição química da barriga suína utilizada neste estudo (Tabela 1). O valor do iodo (IV), poliinsaturados (PUFA), monoinsaturados (MUFA) e ácidos graxos saturados (SFA) variaram muito e podem ter efeitos sobre a estabilidade oxidativa dos produtos. O National Pork Producer Council indicou que a gordura de porco de boa qualidade deveria ter <15% de PUFA com valores de IV abaixo de 70 g / 100 g (Benz et al., 2010). O IV e PUFA de barrigas de porco relatados no presente estudo estavam abaixo deste limite definido para qualidade de gordura aceitável, o que sugere uma boa qualidade de gordura. Diferenças nas dietas alimentadas, no entanto, resultaram em uma variabilidade bastante grande em AGPI, comparada a relatos da literatura (Correa, Gariépy, Marcoux, & Faucitano, 2008). Os níveis de PROTOX, TBARS e HAA no controle de bacon antes dos tratamentos de cozimento foram apresentados na Tabela 1. O controle de bacon continha níveis relativamente baixos de HAAs e TBARS. No entanto, a quantidade de PROTOX no presente estudo foi maior em comparação com os valores relatados anteriormente para outros produtos processados na literatura. A concentração de AAS, GGS e proteínas totais carbonilas (PROTOX Total) em diversos alimentos musculares varia de 0,5-1 nmol de carbonilas / mg proteína em músculo fresco a cerca de 20 nmol carbonilas / mg proteína em outras carnes processadas ou cozidos e armazenados a longo prazo produtos de fígado (Estévez, 2011; Utrera, Rodríguez-Carpena, Morcuende, & Estévez, 2012). Os altos níveis de proteínas carbonilas encontrados no presente estudo podem estar relacionados à natureza da matéria-prima, à formulação e ao subsequente processamento do bacon. A maioria dos ingredientes adicionados ao bacon no presente estudo foi recentemente relatada para aumentar eficientemente a carbonilação de proteínas em alimentos musculares. O sal promove a oxidação das proteínas, facilitando o inchaço das miofibrilas e a exposição dos grupos funcionais suscetíveis à oxidação (Lobo, Ventanas, Morcuende, & Estévez, 2016). O nitrito é conhecido por ser um eficiente indutor de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, que podem iniciar a desaminação oxidativa de aminoácidos alcalinos levando à carbonilação (Villaverde, Ventanas, & Estévez, 2014). Esses autores mostraram ainda que, enquanto o nitrito promoveu a carbonilação de proteínas, a adição de ascorbato levou a uma redução significativa do mesmo. A exclusão de ascorbato em bacon no presente estudo poderia ter contribuído para o maior nível de carbonilação de proteínas observado. Esse resultado pode destacar ainda mais a importância de incluir o ascorbato na mistura de ingredientes de bacon, conforme exigido pelos Estados Unidos (FSIS, 2011). Os açúcares também têm sido diretamente implicados na formação de carbonilas em proteínas de carne através de um mecanismo mediado por Maillard (Villaverde & Estévez, 2013). Desconhece-se até que ponto o tabagismo também promoveria a carbonilação, mas o cozimento subsequente aumentou a formação de AAS e GGS. A maior concentração de AAS em comparação com a fluorescência GGS no presente estudo está de acordo com outros relatórios (Estévez, Ollilainen, & Heinonen, 2009), e pode refletir uma maior abundânciade lisina na amostra de bacon em comparação com outros aminoácidos básicos desde a lisina é o precursor de AAS, enquanto que GGS é derivado de prolina e arginina. 3.1. Efeitos do método de cozimento e tempo de armazenamento na carbonilação de proteínas em bacon Como esperado, em comparação com amostras de controlo, a extensão da carbonilação de proteínas aumentou significativamente com a cozedura (P <0,001) (Tabela 2). Efeitos semelhantes foram relatados com proteínas carbonilas com o aumento da temperatura e do tempo de cozimento (Santé-Lhoutellier, Engel, Aubry & Gatellier, 2008b). Durante o cozimento da carne, não apenas os sistemas de defesa antioxidante são prejudicados, os radicais livres também são produzidos, levando à oxidação de proteínas (Santé-Lhoutellier et al., 2008b). Aminoácidos básicos (lisina, histidina e arginina) são particularmente suscetíveis ao ataque de radicais livres produzidos durante o cozimento e, como tal, são facilmente convertidos em seus derivados carbonílicos. Conseqüentemente, a formação desses compostos carbonílicos tem sido destacada como uma das modificações mensuráveis mais notáveis em proteínas oxidadas com a formação do semialdeído α-amino-adípico (AAS) e semialdeído -glutâmico (GGS), responsável por cerca de 60-70% do a proteína total carbonilas na proteína oxidada (Estévez, 2011; Utrera et al., 2011). Vale ressaltar que a maior parte do PROTOX produzido em toucinho empregado no presente estudo ocorreu durante o estágio térmico de defumação / inicial (com PROTOX médio total no controle acabado de bacon de 80,01 nmol / mg de proteína) e AAS foi o carbonil mais produzido (Tabela 1). Essa observação pode enfatizar a necessidade de controlar o PROTOX em um estágio anterior durante o processamento de bacon, além de durante o cozimento doméstico ou pré-cozimento industrial. Além dos fatores descritos anteriormente que poderiam ter contribuído largamente para o alto nível de PROTOX no controle de bacon, a condição de cozimento durante o horário de fumar também poderia ser um fator importante. O bacon de controlo neste estudo foi sujeito a um horário de fumar a uma temperatura variando entre cerca de 65 e 80 ° C e as placas de toucinho atingiram a temperatura interna de cerca de 65 ° C. Esta temperatura é superior à temperatura típica de 53 ° C empregada como temperatura interna final no processamento do bacon comercial (utilizando a faixa de temperatura do fumeiro entre 42 e 63 ° C durante o horário do fumo) (National Provisioner, 2008). O aumento de AAS e GGS foi significativamente maior no cozimento em micro-ondas em comparação com a fritura em panela (Tabela 2). Embora isso não tenha sido relatado anteriormente em outro lugar, o PROTOX mais alto da culinária no microondas pode estar relacionado aos mecanismos de cocção. Ao contrário do aquecimento por condução que caracteriza a cozedura convencional ou frigideira, as microondas electromagnéticas têm frequências entre 0,3 e 300 GHz e comprimentos de onda entre 1n e 1mm que podem penetrar na comida e directamente excitar moléculas específicas por oscilação de moléculas iónicas (eg sal) bem como a rotação do dipolo (moléculas de água). Os efeitos globais desses movimentos levam ao aumento da energia cinética das moléculas, resultando em aumento da temperatura e da taxa de cozimento. Dado que este mecanismo permite a interação íntima com as moléculas do alimento, a geração de espécies reativas de oxigênio pode resultar devido à ruptura da compartimentalização celular. O efeito não-térmico do cozimento em micro-ondas nas proteínas também poderia estar implicado neste maior aumento no PROTOX (Bohr & Bohr, 2000). De acordo com os resultados atuais, Silva, Ferreira, Madruga e Estévez (2016) encontraram recentemente efeitos significativos dos procedimentos de cocção na extensão do dano oxidativo às proteínas da carne. Eles hipotetizaram, no entanto, que o sistema de transferência de calor e a formação de produtos Maillard com potencial antioxidante em peito de frango grelhado poderiam ter diminuído a formação de proteínas carbonilas nessa técnica de cocção, em comparação com outras. O aumento nos valores de PROTOX no bacon armazenado por 28 dias foi significativamente menor do que aqueles armazenados por 2 dias (Tabela 3). Isto pode ser explicado pela possível quebra de carbonilas proteicas com o armazenamento. Relatórios anteriores mostraram que as proteínas carbonilas podem diminuir durante o processamento e armazenamento contínuo da carne como resultado de sua degradação para produzir estruturas de base de Schiff e ácido alfa-amino-adípico; o produto final da oxidação da lisina (Estévez, 2011; Utrera et al., 2012). Além disso, a possível maior perda de gotejamento armazenada por 28 dias em comparação com os armazenados por 2 dias pode aumentar os produtos de reação de Maillard durante o cozimento, já que a reação de Maillard aumentou com a atividade de água, no máximo entre 0,6 e 0,7 (BeMiller & Huber, 2008). Conforme confirmado por Silva et al. (2016), estes podem atuar como antioxidantes para a oxidação de proteínas, consequentemente, reduzir carbonilas proteicas com maiores dias de armazenamento. Ao contrário do presente estudo, Ganhão, Morcuende e Estévez (2010) relataram um aumento significativo na quantidade de compostos carbonílicos com dias em armazenamento resfriado (até 5,8 nmol / mg de proteína em 12 dias a 2 ° C). Isso pode ser devido aos dias de armazenamento mais curtos e ao método de embalagem diferente empregado em seu estudo. Além disso, o maior teor de ferro na carne bovina comparado à carne suína, tendo sido identificado como um pró-oxidante efetivo (Lund, Heinonen, Baron, & Estévez, 2011), poderia ter constituído um maior grau de suscetibilidade. 3.2. Efeito do método de cozimento e tempo de armazenamento na oxidação lipídica Semelhante à oxidação da proteína, a oxidação lipídica tem sido largamente relatada como aumentando com a temperatura e o tempo de cozimento da carne de porco (Broncano, Petrón, Parra, & Timón, 2009). Além do aumento dos radicais livres e da diminuição do sistema de defesa antioxidante já mencionado, Broncano et al. (2009) enfatizaram a importância dos coeficientes de transferência de calor do meio envolvido no desenvolvimento da oxidação lipídica. Geralmente, a oxidação lipídica foi maior no bacon cozido, independentemente dos tratamentos de cozimento, em comparação com o bacon controle (Tabela 2). No entanto, ao contrário da tendência na oxidação de proteínas, a fritura em panela contribuiu para um maior aumento na oxidação lipídica (TBARS) em comparação com o cozimento em micro-ondas. Alguns estudos, no entanto, relataram resultados contrários com maior oxidação lipídica no microondas em comparação com a fritura (Domínguez, Gómez, Fonseca & Lorenzo, 2014). Esta discrepância pode ser devida à natureza da carne envolvida, bem como ao comprimento e temperatura do método de cozimento. Além disso, a aderência de gordura no bacon com a frigideira (bacon cozido em sua própria gordura em comparação com o cozimento em microondas no utensílio Baconwave ™ que permitia a drenagem de gordura) também poderia ter contribuído parcialmente para o maior valor de TBARS no bacon frito. O valor médio de TBARS no toucinho cru foi de cerca de 0,19 mg MD / kg (Tabela 1) e aumentou em três e quatro vezes após a cozedura em micro-ondas e frigideiras (0,69 e 0,93 mgMD / kg), respectivamente. Esses níveis pós-cozimento estão próximos do nível geralmente aceitável de limiares sensoriais de cerca de 0,5 a 1 mg de MD / kg (Ruan, Aalhus e Juárez, 2014). O fato de que a oxidação lipídica e protéica não seguiu uma tendência semelhante em sua mudança com diferentes métodos de cozimento pode significar que não apenas a temperatura e o tempo são importantes nesses processos oxidativos, mas o mecanismo subjacente desses métodos de cozimento também pode ser crucial (Sánchez- Muniz & Bastida, 2006, Inchingolo, Cardenia e Rodriguez-Estrada, 2013). Vale ressaltar que a correlação entre TBARS e marcadores deoxidação protéica foi significativa (P <0,01) com microondas, mas não com cozimento em frigideira (P> 0,05) (resultado não mostrado). Isso também pode confirmar a possibilidade de diferença no mecanismo de cozimento ao afetar esses processos de maneira diferente. O tempo de armazenamento do bacon sob refrigeração e embalagem a vácuo não influenciou o nível de oxidação lipídica (P> 0,05; Tabela 3), apenas o efeito do método de cozimento foi significativo neste estudo (P <0,001). Além da embalagem a vácuo e da temperatura de refrigeração que poderiam ter limitado a oxidação lipídica, a natureza antioxidante do nitrito adicionado também poderia ter contribuído para a falta de efeito observado no tempo de armazenamento. Ele deve ser provado, no entanto, se o tempo de armazenamento mais longo dominar esses efeitos. 3.3. Efeito do método de cozimento e tempo de armazenamento na produção de aminas aromáticas heterocíclicas No geral, o tipo IQ HAA representou cerca de 72% do total de HAA quantificado em bacon, enquanto a aminocarbolina representou apenas até 24%. Gross et al. (1993) relataram que o MeIQx, 4,8 DiMeIQx e PhIP, todos pertencentes ao tipo IQ HAA, são os principais responsáveis pela mutagenicidade observada no bacon grelhado e representaram a maior porção do HAA detectada. Os valores dos HAAs do tipo IQ variaram entre 0,001 e 18,48 ng / g enquanto os tipos não-IQ estavam abaixo de 0,71 ng / g com a única exceção sendo Trp P-1 e Trp P-2 que foram respectivamente até 5,61 e 2,94 ng / g em algumas amostras de bacon. Embora não existam diretrizes estabelecidas direcionadas ao limite de consumo recomendado de HAA em carnes, a Agência de Proteção Ambiental da Califórnia define os seguintes valores de nível de risco não significativo (μg / dia): MeIQx, 0,41; MelQ, 0,46; Glu-P-1, 0,1; Glu-P-2 e IQ, 0,5; AAC, 2; MeAaC, 0,6; Trp-P-1, 0,03; e Trp-P-2, 0,2. (OEHHA, 2016). Embora estes valores possam não ser facilmente alcançados em dietas humanas regulares, o nível de exposição entre 50 e 1820 ng / d por pessoa foi relatado em diferentes países e essas variações na exposição dependem da frequência de consumo, método de preparação e preferência do consumidor por cor e sabor torrado (Gibis, 2016). Semelhante a outros relatos (Gross et al., 1993; Oz, Kaban e Kaya, 2010), a fritura em panela contribuiu mais para o aumento de HAA no bacon em comparação com o cozimento em micro-ondas (Tabela 2, Figura 1). Isto pode ser devido ao maior coeficiente de transferência de calor na frigideira do que no cozimento no microondas. Gibis (2016) relatou que os métodos de cozimento por contato direto (por exemplo, fritura) têm melhor transferência de calor do que o cozimento indireto por convecção (torrefação do forno) ou radiação (por exemplo, microondas). A menor transferência de calor no cozimento de microondas, acompanhada de maior gotejamento e perda de precursores, poderia ter resultado em seu menor HAA. De facto, Felton, Fultz, Dolbeare e Knize (1994) mostraram que o pré-tratamento por microondas pode reduzir os precursores de HAA e a actividade mutagénica na carne. No geral, independentemente do tempo de armazenamento, o HAA total médio em bacon cru foi de cerca de 0,31 ng / g (intervalo: 0,05 a 1,98 ng / g) e esse valor aumentou para cerca de 5,43 ng / g (variação: 0,98–19,5 ng / g) em bacon frito e apenas 2,19 ng / g (variação: 0,44 a 8,20 ng / g) em bacon com micro-ondas (fig. 1). Nenhuma interação entre o tempo de cozimento e os dias de armazenamento foi observada neste estudo para a produção de HAA e os dias de armazenamento também não influenciaram a produção de HAA (Tabela 3). 3.4. Relações entre a composição do bacon, a oxidação de lipídios e proteínas e a formação de HAA Correlações significantes entre os valores de TBARS, HAA e oxidação protéica foram encontradas no presente estudo (Tabela 4). Tem sido sugerido que a reação de Maillard desempenha um papel central na formação de todos esses compostos químicos. Zamora e Hidalgo (2005) concluíram que tanto a reação de Maillard quanto a oxidação lipídica estão inter-relacionadas e compartilham mecanismos químicos e intermediários comuns. Os produtos de degradação da oxidação lipídica (por exemplo, aldeídos) foram relatados para participar na reação de Maillard e influenciar significativamente o desenvolvimento de sabor na carne. Da mesma forma, a relação entre a formação de HAA e a reação de Maillard foi enfatizada. Jägerstad et al. (1998) postulou que a parte amino-imidazo da molécula de HAA do tipo IQ é formada por ciclização e eliminação de água da creatina enquanto que a parte restante pode ser formada a partir de produtos de degradação de Strecker da reacção de Maillard, e. piridina e pirazina. Os mesmos autores também propuseram que a produção de radicais livres durante a oxidação da gordura poderia aumentar o rendimento de HAA em sistemas de carne. Vários estudos também estabeleceram uma ligação posterior entre a carbonilação de proteínas e os produtos de reação de Maillard. Akagawa, Sasaki, Kurota e Suyama (2005) mostraram que AAS e GGS podem ser formados na presença de glicose e dicarbonil derivados de Maillard enquanto reagem com aminoácidos ligados a proteínas. Esses próprios semialdeídos foram destacados como possíveis candidatos carbonílicos para interagir com grupos amino livres na formação de aldeídos de Strecker (Villaverde et al., 2014). De fato, a via mediada por Maillard foi destacada como um dos três mecanismos estabelecidos pelos quais proteínas carbonilas são formadas em sistemas alimentares (Akagawa et al., 2005; Estévez & Luna, 2016). Como essas reações estão relacionadas, isso poderia explicar a correlação significativa observada entre elas no presente estudo (Tabela 4). No entanto, mais estudos são necessários para explorar essas relações e os mecanismos subjacentes. Enquanto alguns autores relataram a possível interação entre a oxidação lipídica e protéica (Estévez, Morcuende, & Ventanas, 2008), outros sugeriram que o ambiente oxidante dessas reações influenciam em grande parte o acoplamento desses dois fenômenos (Lund et al., 2011; Park, Xiong, Alderton e Ooizumi, 2006). No presente estudo, os valores de TBARS foram significativamente e positivamente correlacionados com as proteínas carbonilas, embora a relação não tenha sido forte (r = 0,42–0,59, P <0,01) (Tabela 5.4). De fato, a análise de componentes principais de todas as variáveis químicas consideradas no presente estudo produziu dois componentes principais que explicam até 81% da variação no conjunto de dados (Fig. 2 a & b). Esta análise incluiu as 176 observações (micro-ondas × tratamentos de frigideira) para os 44 animais empregados neste estudo. Para cada observação, o HAA, TBARS e medidas de oxidação protéica foram incluídos na análise como variáveis. O primeiro componente principal (PC1), que explicou até 56% da variação dentro do conjunto de dados, carregou alto em medidas de oxidação de proteína, enquanto o segundo componente principal (PC2), explicando cerca de 25% da variação, carregou alto medidas de oxidação lipídica e aminas heterocíclicas. Considerando que esses dois PCs são de natureza ortogonal, isso pode sugerir que sob diferentes tratamentos ou ambientes de processamento, esses dois grupos de reações podem não seguir a mesma progressão. Vale ressaltar que o PC2 separou esses conjuntos de dados com base em métodos de cocção, confirmando a maior contribuição da fritura à oxidação lipídica. Embora PC1 não tenha segregado este conjunto de dados, mais bacon tratado com microondas foi agrupado em torno do eixo positivo de PC1 do que o bacon frito, indicando mais oxidação proteica em bacon do que bacon frito, como discutido anteriormente. Além disso, todas as medidas de insaturação de ácido graxo medidas em barrigas cruas (IV, ômega 3 e 6 e PUFA) não foram significativamente correlacionadas com esses compostos químicos de bacon cozido (P> 0,05, Tabela 4). Essa falta de relacionamento poderia ser explicada pelos fortes efeitos que as etapas de processamento e ingredientesadicionados no bacon poderiam ter sobre o estado geral de oxidação do produto, o que poderia, por sua vez, negar os efeitos que a composição de ácidos graxos poderia ter contribuído na produção. destes compostos. Por exemplo, o nitrito, um ingrediente de cura crucial empregado no processamento de bacon, possui uma forte atividade antioxidante. O seu efeito global durante o processamento pode ter sido suficiente para suprimir a susceptibilidade mínima que a insaturação de ácido gordo poderia ter no produto. Este resultado confirma ainda que a variação na composição do toucinho de porco, tal como empregada no presente estudo, pode não ter efeito significativo sobre a produção de oxidação lipídica e protéica, bem como aminas aromáticas heterocíclicas em bacon cozido. A perda de Cook também foi fraca, mas significativamente correlacionada com todas as medidas de oxidação de proteínas. Isto concorda com a perda de capacidade de retenção de água na carne devido à modificação de proteína que foi previamente relatada na literatura (Estévez, 2011). 3.5. Efeitos do método de cozimento e tempo de armazenamento em atributos sensoriais de bacon A avaliação sensorial foi incluída neste estudo para entender o impacto dos métodos de cozimento e tempo de armazenamento na palatabilidade geral do bacon. De todos os atributos sensoriais avaliados, apenas a friabilidade inicial foi afetada por um método de cocção por interação no dia de armazenamento (P = 0,0046) (fig. 3). Maior crispiness inicial foi encontrada no bacon frito do que no microwaved após 2 dias de armazenamento refrigerado, mas este efeito desapareceu após um armazenamento de 28 dias. Embora isso possa não ter uma explicação direta simples, pode ter a ver com possível perda de umidade no pacote a vácuo conforme os dias de armazenamento progrediram. Vários estudos relataram o aumento da perda de gotejamento em carnes embaladas a vácuo com menor capacidade de retenção de água relacionada à pressão, resultando em carne mais seca (Marcinkowska-Lesiak et al., 2016), o que poderia resultar em maior quebradiça de bacon após o cozimento. Dos demais atributos sensoriais do toucinho avaliados no presente estudo, a friabilidade, a intensidade de sal e a mastigabilidade foram afetadas (P <0,01) pelo método de cozimento (Tabela 5), enquanto o tempo de armazenamento não afetou nenhum atributo sensorial (P> 0,05). A frigideira cozinhando uma frescura geral melhorada no bacon (P <0,01) em comparação com a cozedura em micro-ondas, e isto pode estar relacionado com a natureza de formação da crosta deste método de cozedura. Além disso, a alta perda por evaporação na fritura, bem como a alta temperatura de cozimento empregada neste método de cozimento (250 ° C), poderiam ter contribuído para a formação da crosta e, consequentemente, para a friabilidade geral. Ao contrário de outros relatos em que a perda de cozimento foi relatada como maior durante a cocção em microondas comparada à fritura, e onde essa perda foi atribuída mais à umidade do que à perda de gordura (Domínguez et al., 2014), o presente trabalho não mostrou diferença significativa no cozimento perdas entre estes dois métodos (~ 77%; P> 0,05; resultados não mostrados), e mais das perdas pareciam ser devidas à gordura do que à umidade (41-47 vs 32-36%). Isto pode ser devido à natureza gordurosa do bacon fatiado em comparação com os bifes mais finos utilizados em outros estudos, bem como as diferentes condições de cozimento. Tradicionalmente, a peroxidação lipídica tem sido enfocada como a principal forma de deterioração química que pode afetar o sabor geral, incluindo tanto o odor quanto o sabor da carne e produtos de carne. A decomposição de hidroperóxidos lipídicos para formar produtos secundários, tais como aldeídos, cetonas, álcoois e hidrocarbonetos, tem sido amplamente implicada nesta modificação de qualidade. Mais recentemente, no entanto, o papel da oxidação protéica na deterioração da qualidade, incluindo textura e capacidade de retenção de água, entre outros atributos sensoriais da carne, tem sido documentado (Estévez, 2011; Lund et al., 2011). A oxidação de proteínas pode manifestar-se como a modificação de cadeias laterais de aminoácidos (por exemplo, carbonilação de proteínas), clivagem de ligações peptídicas de proteínas ou através da formação de ligações cruzadas (por exemplo, polimerização de proteínas). Estes podem ter efeitos significativos na deterioração da qualidade da carne. Além da variação no teor de umidade, que pode desempenhar um papel, a maior mastigabilidade observada no bacon tratado com microondas poderia possivelmente estar relacionada ao aumento da oxidação / polimerização de proteínas. Como mencionado anteriormente (seção 3.1), o cozimento em micro-ondas pode aumentar o nível de oxidação da proteína no bacon em comparação com a cozedura da frigideira. Isso poderia ter contribuído para a maior mastigabilidade do bacon. Foi relatado que grupos carbonila reagem com grupos amino não oxidados de proteína para produzir ligações amida, resultando em polimerização de proteínas e formação de agregados que poderiam ser percebidos em produtos de carne como aumento de mastigabilidade (Morzel, Gatellier, Sayd, Renerre, & Laville, 2006). ). Isso, no entanto, requer exploração futura. Verificou-se também que a salinidade aumenta no frito em comparação com o bacon cozido no microondas. Embora as perdas gerais de cozimento devido ao método de cozimento não sejam significativamente diferentes, a possível alta perda de evaporação durante a fritura pode resultar em concentração de sal no bacon durante o cozimento. O efeito global da concentração de sal e formação de crosta pode ser percebido como maior intensidade de sal em bacon pelos painelistas. A tendência para mais sabor off com cozimento em micro-ondas (P = 0,077; Tabela 5), que foi amplamente descrita pelos painelistas como “maple”, “azedo” e “gorduroso” (dados não mostrados) pode não ser de significância prática para consumidores. No entanto, uma vez que se esperava que este sabor desfavorável fosse maior com bacon frito devido ao seu maior valor de TBARS, o impacto da oxidação de proteínas nessa percepção também pode ser de interesse para estudos futuros. 4. Conclusões Embora o cozimento em microondas produza produtos de oxidação lipídica mais baixos e aminas heterocíclicas em comparação com a cozedura da frigideira, isso leva a produtos de oxidação de proteínas mais elevados que parecem diminuir com os dias de armazenamento. Os efeitos gerais do tempo de armazenamento e da composição química da carne suína nas características químicas e sensoriais do bacon, conforme empregado neste estudo, foram mínimos e podem não apresentar efeito prejudicial de significância prática. Geralmente, os métodos de cocção afetam a oxidação lipídica do bacon, a oxidação de proteínas e a produção de aminas heterocíclicas aromáticas, bem como as características sensoriais do bacon, e isso deve ser considerado ao desenvolver recomendações culinárias para este popular produto de carne. O alto nível de produtos de oxidação de proteínas no bacon também precisa ser levado em consideração devido à sua potencial implicação na nutrição e saúde humana. Esclarecimentos adicionais sobre como o mecanismo de sublinhação desses métodos de cocção pode influenciar a produção desses compostos de maneira diferente também é crucial. O impacto geral da oxidação protéica sobre os atributos sensoriais do bacon ainda precisa ser mais elucidado.
