TECNICA DE MICROCULTIVO EM LÂMINA PARA DIAGNOSTICO FUNGICO

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

41
UNIVERSIDADE VILA VELHA - UVV
AMANDA CORREA GAMA
JULIA DA SILVA SANTOS
TECNICA DE MICROCULTIVO EM LÂMINA PARA DIAGNOSTICO FUNGICO 
VILA VELHA 
2018
AMANDA CORREA GAMAA
JULIA DA SILVA SANTOS
TECNICA DE MICROCULTIVO EM LÂMINA PARA DIAGNOSTICO FUNGICO 
Relatório de aula prática referente a disciplina de Microbiologia Geral do terceiro período do curso de Medicina Veterinária da Universidade Vila Velha do Espírito Santo sob a orientação do(a) Prof.(a) Marcus Alexandre. 
VILA VELHA
2018
INTRODUÇÃO
Os fungos têm existência bastante difusa. Eles são considerados ubiquitários por estarem no solo, na água e no ar, cosmopolitas por serem encontrados em todas as partes do planeta (KONEMAN et al., 2001). 
Estes microrganismos necessitam de matéria orgânica para obtenção de carbono e de energia para seu metabolismo, por isso, estarão sempre associados ao material orgânico como sapróbios ou decompositores, simbiontes, comensais e parasitas. (BARON et al., 1994; BLEVINS, 1999; KONEMAN et al., 2001). 
Esses fungos compreendem uma grande diversidade de gêneros que colonizam diferentes ambientes, onde desenvolvem estruturas reprodutivas como esporos e conídios, os quais são veiculados por correntes de ar, dispersos com muita facilidade e com alto potencial de contaminação (SIDRIM, 1999).
A partir da quantidade de células, os fungos podem ser divididos em unicelulares, como as leveduras ou pluricelulares, como os fungos filamentosos. Leveduras possuem colônias lisas e brilhantes, já os fungos filamentosos formam colônias aveludadas e mais dispersas, estes são compostos por hifas, e seu conjunto forma o micélio (FIGURA 1 e 2). (IOGI, 2016). 
 
FIGURA 1: Macroscópia de levedura e fungos filamentosos.
Fonte: Google imagens. 
 
FIGURA 2: Microscopia de leveduras e fungos filamentosos. 
Fonte: Google imagens.
Para a identificação dos fungos filamentosos, é necessário analisar cor, textura, superfície, pigmentos e outros, mas só esta análise não permite uma efetiva identificação. A observação microscópica das estruturas fúngicas costuma ser eficiente para isto, apesar de que, algumas espécies necessitam ainda de provas bioquímicas para uma real certeza. Uma das melhores técnicas para a análise de fungos filamentosos é o microcultivo, já que mantém suas estruturas íntegras (IOGI, 2016). 
OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo, verificar a importância da técnica de microcultivo na caracterização dos fungos. 
MATERIAIS 
- Cultura fúngica. 
- Tubo de ensaio. 
- Alça de inoculação. 
- Pinça. 
- Lamina. 
- Lamínula. 
- Placa de Petri.
- Palitos de dente. 
- Algodão. 
- Bico de Busen. 
- Azul de lactofenol. 
- Água destilada. 
- Luvas e Microscópio. 
METODOLOGIA 
Inicialmente foram distribuídos para cada dupla um meio de cultura com colônias fúngicas já desenvolvidas, no qual iriamos realizar todo procedimento (FIGURA 3). 
FIGURA 3: Colônia fúngica. 
Com esta colônia, foram realizadas primeiramente a caracterização macroscópica, seguindo alguns critérios, afim de identificar a cor, tamanho, forma, borda, elevação e aspecto (TABELA 1). 
Tabela 1: Critérios macroscópicos.
	COR
	FORMA
	BORDA
	ELEVAÇÃO
	ASPECTO
	Verso/
	Circular 
	Regular
	Plana
	Algodonoso
	Reverso
	Irregular
	Irregular
	Elevada
	Aveludado
	Radial
	Convexa
	Pulverulento
	Rizoide
	Monticular
	Farináceo
Para uma melhor identificação microscópica do fungo, foi realizado preparo do microcultivo no processo de câmara úmida, que tem por finalidade impedir a troca de umidade entre o ambiente interno e o externo, mantendo elevada a umidade relativa do ar (CORREA, 2010). 
A montagem da câmara foi feita tomando-se alguns cuidados; flambou-se a pinça no bico de Busen e com ela colocou-se la placa de petri dois palitos de dente com uma distância entre eles e a lâmina em cima destes; em seguida com a borda de um tubo de ensaio estéreo retirou-se um pedaço, em forma de moeda, de um Agar Sabouraud e com a alça flambada transferiu-se esse pedaço de ágar para a lamina.
O próximo passo foi pegar, com alça já flambada, um mínimo fragmento (com muitos esporos) da colônia de fungos e inocular no ágar, onde foi colocado a lamínula em cima deste fragmento, por último umedeceu um pedaço de algodão que também foi colocado dentro da placa, com a função de manter o meio úmido, para o ágar não ressecar e o fungo parar de crescer estragando o micro cultivo, já que esse ágar desidrata muito rápido.
A câmara foi incubada em temperatura ambiente a 22°/28° graus Celsius por 5 a 7 dias em condições de aerobiose (presença de oxigênio), (FIGURA 4).
Figura 4: Câmara úmida. 
Depois do tempo de encubação, foi realizado o processo para caracterização microscópica. Pingou-se uma gota de azul lactofenol em uma lâmina de vidro e em seguida, com a pinça devidamente flambada no bico de Busen, retirou-se a lamínula e pressionou-a sobre a lâmina para melhor fixação e visualização no microscópico (FIGURA 5). 
 
Figura 5: Materiais utilizados.
Com as lâminas finalizadas, realiza-se a caracterização microscópica das estruturas fúngicas. Focaliza-se normalmente a lâmina nas lentes objetivas de 4x, 10x e 40x normalmente; na microscopia é visualizada as hifas, que podem ser septadas ou não septadas, os esporos e os micélios reprodutivos.
RESULTADOS 
Após realizado todos os processos descritos na metodologia, foram obtidos os resultados aguardados tanto da caracterização macroscópica como da microscópica (TABELA 2). 
Tabela 2: Caracterização Macroscópica das colônias.
	CARACTERISTICAS
	COLÔNIA 
	COR
	Verde escuro
	FORMA
	Circular 
	BORDA
	Regular 
	ELEVAÇÃO
	Convexa
	ASPECTO
	Aveludado
Já na caracterização microscópica, foi possível identificarmos todas as estruturas fúngicas, como os esporos, o micélio reprodutivo e as hifas septadas (FIGURA 6).
Figura 6: Microscopia das estruturas fúngicas. 
DISCUSSÃO 
Após as análises macroscópicas da colônia, e microscópica das estruturas fúngicas, podemos associá-lo ao gênero Cladosporium spp, que pertencem à família Davidiellaceae, à classe Dothideomycetes, e ao filo Ascomycota.
Os fungos pertencentes ao gênero Cladosporium spp são denominados fungos demácios, as colónias são de crescimento rápido, mas restritas (3.5 cm em 10 dias) quanto à dimensão, são verde-escuras com um reverso quase preto. A textura é inicialmente aveludada tornando-se a granular com o tempo de incubação; na fase saprófita, formam hifas septadas e escuras, com conidióforos laterais e terminais de tamanhos variados, e podem ser septados. Eles são pretos esverdeados e levemente dilatados nas extremidades distais. Produzem cadeias longas e ramificadas de conídios ovais e de paredes lisas e finas, à maneira de uma árvore (FISHER E COOK, 2001).
As espécies deste gênero são regularmente encontradas como contaminantes e agentes de deterioração nos alimentos ou produtos industriais, podendo ser isolados a partir de uma vasta gama de substratos, tais como terra, pedras, tijolos, bem como os têxteis, papel e couro, além de ser frequentemente associados com queixas de infecções, patogenia asmáticas e lesões da pele (BENSCH et al., 2012). 
CONCLUSÃO 
A partir dos resultados obtidos, com os procedimentos realizados na aula prática, observa-se a importância do microcultivo para um melhor diagnostico fúngico onde identificou-se na microscopia a espécie de fungos do gênero Cladosporium spp., que são fungos que apresentam como característica macroscópica da colônia coloração verde escura a preto, de aspecto aveludado, possuem hifas septadas e formação de conidióforos; estes fungos são importantes decompositores de alimentos e sementes. 
REFERÊNCIAS
BARON, E. J.; PETERSON, L. R.; FINEGOLD, S. M. (1994). Diagnostic Microbiology. 9. ed. St Louis: Mosby.
BENSCH, K.; BRAUN, U.; GROENNEWAL, J.Z.; CROUS, P.W. 2012. The genus Cladosporium. Studies in Mycology, 72: 1-401.
BLEVINS, K.S. (1999). Micologia Médica: Texto e Atlas. 2. ed. São Paulo: Premier.
CORRÊA, L. et al. Uso de câmara úmida
em enxertia convencional de maracujazeiro-amarelo três porta-enxertos. Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 32, n. 2, p. 591-598, 2010. 
FISHER, F.; COOK, N.B. 2001. Micologia Fundamentos e Diagnóstico. 1. ed. Rio de Janeiro: Revinter. 337 p.
IOGI, A. Validação da técnica de microcultivo para a identificação de microrganismos ambientais. Centro Universitário das Faculdade Metropolitanas unidas, SEMESP, São Paulo, 2016. 
KONEMAM. E. W.; Allen, S. D.; Janda, W. M.; Schreckenberger, P. C.; Winn Jr., W. M. (2001). Diagnóstico Microbiológico. 5. ed. Rio de Janeiro: Ed. Medsi.
SIDRIM, J., MOREIRA, J. Fundamentos clínico-laboratoriais da micologia médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 171-190, 1999.