Intensivão de BioMol e Proteínas: exercícios de práticas em Biologia Molecular

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LISTA DE EXERCÍCIOS 2 
 
1. Quais os principais componentes a serem analisados para a expressão de proteínas 
recombinante em Escherichia coli ? 
R: ​O vetor a ser utilizado (plasmídeo), o inserto (mRNA ou DNA) e qual a bactéria será utilizada 
para a expressão. 
 
2. Quais os princípios da regulação da expressão do operon lac? 
R: ​O operon lac é baseado principalmente na indução ou repressão com base na disponibilidade 
do indutor. Na presença de alolactose (indutor), ela se liga ao repressor de modo que este se 
desconecte do promotor. A RNA-polimerase se liga ao promotor e inicia a transcrição. Ou seja, os 
princípios são: relação promotor RNA-polimerase e a interação das proteínas repressoras com o 
operador e com o indutor. 
 
 
(a) Em quais sítios de restrição o gene da enzima em questão poderia ter sido inserido? 
Porque? 
R​: NcoI e XhoI pois a proteína recombinante tem apenas uma cauda com terminal de histidina. 
 
 (b) Dentre as linhagens de Escherichia coli descritas abaixo, quais seriam apropriadas 
para expressão do gene em questão? Porque? Quais as características dessas linhagens 
que poderiam melhorar a expressão da enzima? Por quais motivos? DH5α; Bl21 (DE3); 
Origami; Rosetta; C43 (DE3) 
R: ​B121 (DE3) : possui o gene para a expressão da RNA polimerase 
C43 (DE3): Possui o gene para a expressão da RNA polimerase. 
Como as outras enzimas não tem o gene, não conseguem produzir t7 polimerase. 
 
 
 
Respostas: a) o tipo 2 será o mais abundante. 
b) CGU/CGC pois é o mais abundante. 
 
5. Qual a utilidade e princípio de funcionamento dos reagentes e materiais descritos 
abaixo? (a) - imidazol; (b) IPTG (isopropil--D-tiogalactopiranosídeo) ; (c) ampicilina; 
(d) DNA ligase; (e) poliacrilamida; (f) brometo de etídeo; (g) Taq polimerase; (h) DTT 
= ditiotreitol; (i) ágar; (j) PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila); (n) SDS (dodecil 
sulfato de sódio) 
 
R: ​Imidazol: separar proteína com cauda de histidina da coluna de níquel por competição. 
IPTG - Indutor análogo à lactose. 
Ampicilina - seleciona as bactérias com o inserto de interesse. 
Poliacrilamida - eletroforese de proteínas 
Brometo de etídeo - intercalante de DNA 
DTT - Cliva ponte dissulfeto e reduz as pontes. 
Ágar - eletroforese de ácido nucleico 
TAQ polimerase - enzima de bactérias termais, usado em PCR 
PMSF - inibidor de protease 
SDS - rompe ponte de hidrogênio e interrompe ligações iônicas.