Resumos de Enzimologia

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Resumos de Enzimologia
Programa da UC:
1. Fundamentos físico-químicos das reações enzimáticas:
- Catálise química: aspetos termodinâmicos e cinéticos;
- Relação estrutura-reatividade funcional.
 •Estrutura do local activo e mecanismo de actuação das enzimas. Tipos de reacções enzimáticas;
 •Estereoespecificidade e estereoselectividade
2. Estratégias catalíticas como mecanismos adaptativos para a resolução de problemas
3. Especificidade catalítica e estratégias regulatórias:
 •Regulação alostérica
 •Regulação por modificação covalente reversível e irreversível
4. Enzimologia aplicada
 •Fundamentos e estratégias dos ensaios enzimáticos;
 •Princípios de engenharia de proteínas;
 •Anticorpos catalíticos (abzimas);
 •Ribozimas;
 •Produção de enzimas em sistemas heterólogos;
 •Aplicações em Biotecnologia. 
Enzimas
O que são?
Maioritariamente, as enzimas são proteínas ou complexos proteicos, que atuam controlando a velocidade e regulando as reações químicas do organismo.
As enzimas são biocatalisadores, isto é, aumentam a velocidade de uma reação, sem sofrer alterações permanentes.
É importante destacar que algumas moléculas de RNA, conhecidas como ribozimas, atuam como enzimas.
As enzimas são altamente específicas, atuando sobre substratos específicos e em locais específicos desses substratos. 
Como funcionam?
As enzimas fornecem um ambiente específico dentro do qual uma dada reação pode ocorrer de forma mais rápida. 
A característica que distingue uma reação catalisada por uma enzima é o facto de a reação ocorrer dentro de uma “bolsa” na enzima que é denominada de sítio ativo.
A molécula que está ligado ao sítio ativo e sob a ação da enzima é chamada de substrato. A superfície do sítio ativo é revestida com aminoácidos residuais com grupos substituintes que se ligam ao substrato e catalisam a reação química. Frequentemente, o sítio ativo envolve o substrato, retirando-o completamente da solução. 
O complexo enzima-substrato é fundamental para a ação das enzimas.
As enzimas afetam as taxas de reação, não o equilíbrio!
Uma reação enzimática simples pode ser escrita como: 
E + S ES EP E + P , onde E, S e P representam a Enzima, o Substrato e os Produtos; ES e EP são complexos transitórios da enzima com o substrato e com o produto.
A função de um catalisador é aumentar a taxa de uma reação. Os catalisadores não afetam o equilíbrio da reação! (Uma reação está em equilíbrio quando não há mudança líquida nas concentrações de reagentes ou produtos)
A energia de um sistema biológico é descrito em termos de energia livre, G. No diagrama de coordenadas (Fig. 6-2), a energia livre do sistema é plotada contra o progresso da reação (a coordenada da reação). O ponto de partida para a reação espontânea ou irreversível é chamado de estado fundamental, a contribuição para a energia livre de um sistema por uma molécula média (S ou P) sob um determinado conjunto de condições. 
O equilíbrio entre S e P reflete a diferença nas energias livres dos seus estados fundamentais.
Mudança de energia livre padrão, ΔGº.
A energia livre do estado fundamental de P é inferior à de S, então ΔGº para a reação é negativa (a reação é exergônica) e, no equilíbrio, há mais P do que S (o equilíbrio favorece P). A posição e direção do equilíbrio não são afetadas por nenhum catalisador. 
Um equilíbrio favorável não significa que a conversão de S P ocorrerá a uma taxa detetável. A taxa de uma reação depende de vários diferentes parâmetros. Isso é ilustrado pela “colina” presente na figura. 
Existe uma barreira de energia entre S e P: a energia necessária para o alinhamento dos grupos reagentes, a formação de cargas instáveis transitórias, os rearranjos de ligações e outras transformações necessárias para prosseguir em qualquer direção. 
Para a reação ocorrer, as moléculas devem superar esta barreira, e, portanto, deve ser elevado a um nível de energia mais alto. 
No topo de energia da “colina”, há um ponto que decai para o estado S ou para o estado P que é igualmente provável de acontecer. Isso é chamado de estado de transição. O estado de transição não é nenhuma espécie química com qualquer estabilidade significativa e não deve ser confundido com um intermediário de reação (como ES ou EP). O estado de transição é simplesmente um passageiro molecular, momento em que eventos como quebra de vínculo, formação de vínculo e desenvolvimento de carga, procederam para o ponto preciso em que o decair para substrato ou produto é igualmente provável. 
A diferença entre os níveis de energia do estado fundamental e do estado de transição é a energia de ativação, ΔG+. A taxa de uma reação reflete esta energia de ativação: uma energia de ativação mais elevada corresponde a uma reação mais lenta. As taxas de reação podem ser aumentadas com o aumento da temperatura e/ou pressão, aumentando, assim, o número de moléculas com energia suficiente para superar a barreira de energia. Contrariamente, a energia de ativação pode ser reduzida por adição de um catalisador (Fig. 6-3).
Relação estrutura-função: a arquitetura da parte ativa faz prever a função que esta possa vir a ter.
Estrutura Primária: resíduos de aminoácidos
Estrutura Secundária: cadeia em hélice
Estrutura Terciária: cadeia polipeptídica
Estrutura Quaternária: subunidades montadas
Nomenclatura e classificação das enzimas
· Hidrolases: são aquelas enzimas que se associam às moléculas de água para promoverem a quebra das ligações covalentes, como as peptidases;
· Ligases: são responsáveis por formar novas moléculas através da união de duas já pré-existentes, como as sintetases;
· Oxidoreductases: são responsáveis por efetuar a transferência de eletrões, o que podemos definir como oxi-redução (ex.: desidrogenases);
· Transferases: são enzimas que têm como finalidade realizar a translocação de grupos funcionais como agrupamento amina, carbonila, carboxila, fosfato, de uma molécula para outra (ex.: quinase);
· Liases: atuam na remoção de molécula de água, gás carbônico e amónio, a partir da ruptura de ligações covalentes (ex.: descarboxilase);
· Isomerases: responsáveis por mediar a conversão de substâncias isoméricas, sejam elas geométricas ou ópticas (ex.: epimerases).
· Translocases
Número EC
As enzimas são classificadas em sete grupos diferentes de acordo com a reação que se encontra a ser catalisada.
Propriedades das enzimas: necessidades para a atividade
· Algumas enzimas necessitam que não haja grupos químicos
· Algumas enzimas necessitam de um componente químico adicional (îões) cofator
· Algumas enzimas precisam de um complexo orgânico ou de uma molécula metalorgânica coenzima
· Algumas enzimas precisam de uma coenzima e de um cofator
Se o cofator/coenzima é ligado covalentemente = grupo protético
Cofatores e coenzimas não são proteínas ou peptídeos
Enzima completa: holoenzima = apoproteína + cofator/coenzima
Muitas enzimas podem ser modificadas por fosforização/glicosilação/…
Local ativo de uma enzima pode ter:
· Aminoácidos
· Outros requisitos para poder funcionar
· Essencialmente cofatores (se precisar de iões)
· Água
· Etc.
Reações enzimáticas
Há uma barreira de energia entre a formação de produto e a formação de substrato.
Há uma energia de ativação para a formação do estado de transição.
O aumento da concentração de substrato, faz aumentar a velocidade, até atingir uma velocidade máxima e estabilizar.
Energia Livre de Gibbs 
diz se uma reação é espontânea ou não.
Reação exorgânica Reação espontânea (quando a energia livre dos substratos é superior à energia livre dos produtos)
Reação endorgônica Reação não espontânea (resulta numa maior ordem)
ΔS Mudança de entropia: ΔS > 0 Menor ordem; ΔS < 0 Maior ordem.
ΔH Variação de entalpia: ΔH < 0 Reação exotérmica; ΔH > 0 Reação endotérmica.
Nota: A variação do T é que vai fazer com que a reação tenda para um lado ou para o outro.
Enzimas…
· Enzimas têm um elevado grau de especificidade para os seus substratos;
· Aceleram imenso as reações químicas;
· Funcionam em soluções aquosas sob condições muito leves(temperatura e pH);
· Há alguns catalisadores não biológicos que têm todas estas propriedades;
· São importantes na engenharia química, na tecnologia alimentar e na agricultura.
As enzimas aumentam as taxas de reação por diminuição da energia de ativação, as enzimas não afetam o equilíbrio! 
Constante de equilíbrio 
O equilíbrio é descrito por uma constante de equilíbrio, Keq ou K Diz quando uma determinada reação tomba para que lado (para a formação do produto ou para a desagregação do produto).
Se k é elevado, há uma maior probabilidade dessa reação ocorrer.
Enzimas modificam o k? Não! Elas aceleram as reações, não influenciam a tendência da reação de ir para um lado ou para o outro.
A taxa da reação (V) é determinada pela concentração do reatante [S] e de uma constante de taxa k (rate constant).
k=0.03s-1 Significa que, num segundo, 3% do substrato foi convertido numa reação de 2ª ordem.
Este k (rate constant) é o parâmetro que as enzimas modificam nas reações!
As enzimas reduzem o estado de transição para eventos menos energético.
O inibidor é uma molécula que se liga à nossa enzima e é tão estável que já não a liberta.
Energia de ligação (GB)
A energia de ligação (GB) é usada para compensar a energia de ativação G+, permitindo que o estado de transição baixe. provém de interações entre o substrato e as enzimas em si.
A energia de ligação pode vir:
· Baixa entropia do substrato (trazendo moléculas juntas)
· Solvatação do substrato (remoção de água)
· Mudança conformacional na enzima (ajuste induzido)
· Alinhamento dos grupos catalíticos funcionais na enzima
Porque as enzimas, geralmente, são muito grandes? Porque precisamos de diversos pontos de interação > nº de interações, > tamanho da enzima, > flexibilidade vão fazer baixar a energia de ativação
Catálise enzimática
· Catálise ácido-base: os intermediários carregados podem, frequentemente, ser estabilizados pela transferência de protões de ou para o substrato ou intermediário para formar uma espécie que se decompõe mais prontamente para produtos.
· Catálise covalente: uma ligação covalente transiente é formada entre a enzima e o substrato.
· Catálise de iões metálicos: os metais, sejam fortemente ligados à enzima ou retirados da solução junta com o substrato, podem participar na catálise de várias maneiras. Interações iónicas entre um metal ligado à enzima e um substrato podem ajudar a orientar o substrato para a reação ou estabilizar estados de transição de reação carregados.
Nota: Uma enzima pode utilizar todos os tipos de catálise! (ex.: Quimotripsina).
Cinética do estado estacionário
Equação de Michaelis-Menten serve para compreender a cinética das enzimas, quais as características que elas mostram. 
O estudo é feito com a enzima em baixa quantidade e com uma quantidade (maior que a da enzima) apreciável de substrato permite determinar as características das enzimas meço a Vinicial da reação a partir da concentração de substrato.
Há que ter em atenção os primeiros instantes da reação ir mudando a concentração de substrato e ir registando a velocidade com que o produto é formado. 
Nós temos de ter em atenção os primeiros instantes porque é nesses primeiros instantes que temos a completa quantidade de substrato, porque passando um tempo este começa a degradar-se.
Km (Michaelis Constant)
 
Para uma concentração igual de enzima, vou variando a concentração de substrato até um determinado ponto (Vmáx).
Km vai ser igual a metade do ponto da Vmáx. representa a Vmáx. com que a enzima trabalha na menor presença de substrato.
Porque esta constante é importante? Porque para enzimas com perfis constantes, conseguimos ver qual é a mais interessante, a que precisa de menor concentração de substrato.
< Km é melhor! Significa que, com uma menor concentração de substrato se consegue chegar à Vmáx. de forma mais rápida.
Com a equação anterior, conseguimos fazer algumas previsões quando a concentração de substrato é demasiado alta, o Km torna-se quase insignificante, o que significa que, V0 está a aproximar-se da Vmáx.
A Vmáx. é a velocidade intrínseca com que a enzima consegue “trabalhar”, isto é, que consegue conhecer o substrato.
Km está dependente do meio envolvente da enzima (se houver muita quantidade de substrato biologicamente, o Km vai ser mais baixo). 
Kcat (rate limiting step) quantas unidades são transformadas por período de tempo refere-se à rapidez com que a enzima “trabalha”
Diferentes enzimas e diferentes substratos têm diferentes kcat.
Quanto mais enzimas mais catálise vai ocorrer mais rápido será a reação
Uma enzima ideal apresenta um kcat elevado e um baixo km que, significa que, respetivamente, a enzima atua de forma muito rápida e com uma pouca quantidade de substrato. A combinação do Kcat com o Km dá-nos a ideia da eficiência.
Nota: Nem Kcat nem Km falam-nos da eficiência da reação!
Duplo-recíproco ou Gráfico de Lineweaver-Burk
Representa a inversão do gráfico de Km.
Serve para entender melhor o efeito dos inibidores.
Inibidor competitivo: compete com o substrato para ligar-se ao local ativo.
Inibidor não competitivo: liga-se a um local ativo da enzima, mas a um local diferente do do substrato. 
 
Inibição irreversível: reduz permanentemente a quantidade de enzima, fixando-se ao local ativo.
Nucleófilos repelem os iões
Eletrófilos atraem os iões
Para estudar o mecanismo de uma enzima (como o aminoácido se liga ao local ativo da enzima) Pôr algo similar com o aminoácido (com propriedades estruturais muito similares) 
Nota:
A Penicilina é o antibiótico que inibe a transpeptidase nas bactérias. Os antibióticos não eliminam a bactéria por completo, eles fazem com que a sua multiplicação não ocorra.
A Penicilina não é tão eficiente hoje em dia porque as bactérias possuem uma proteína que a degrada, a B-lactamase Resistência aos antibióticos.
A solução é usar Ácido Clavulânico para combater a B-lactamase este ácido consegue inativar a B-lactamase por isso, a Penicilina não pode ser usada por si só.
Uma enzima pode sofrer mais do que uma fosforilação e nem sempre fosforilação significa ativação. 
Mecanismo de regulação por clivagem proteolítica: um mecanismo comum de ativação ou inativação de enzimas.
Lisossomas: organelos que destroem tudo são como células individuais.
Perguntas e Respostas
1. Uma solução enzimática perde atividade ao longo do tempo quando lhe fornecemos calor.
Provavelmente, houve uma degradação da enzima (desnaturou) a determinada temperatura. 
Desnaturação perda da estrutura da proteína.
2. Uma solução com hexokinase incubada a 45ºC perdeu 50% da atividade em 12 minutos. Contudo, uma solução com hexokinase incubada a 45ºC, mas com substrato, perdeu só 3% da atividade em 12 minutos.
As enzimas podem ter alguma flexibilidade, mas quando se ligam a um substrato podem perder essa flexibilidade e tornarem-se estáveis, resistindo à desnaturação.
3. S k1 k2 P, onde k-1eq= [P]/[S].
a) Uma enzima consegue diminuir a constante de equilíbrio?
Não
b) Uma enzima consegue aumentar o k1?
Sim, uma enzima é um catalisador, logo altera a velocidade de uma reação, diminuindo o ΔG do estado de transição.
c) Uma enzima consegue aumentar a constante de equilíbrio?
Não
d) Uma enzima consegue alterar o ΔG?
Não
Biologia Molecular
O Dogma Central da Biologia Molecular:
DNA RNA Proteína
Gene:
· Exões (codificam)
· Intrões (não codificam)
· Promotor
Função do DNA? Manter a informação
RNA contém informação e tem atividade catalítica (é o genoma dos vírus)
Replicação do DNA:
· DNA Polimerase
· DNA Primase
· RNA Primer
· DNA Ligase
· Helicase
· Topoisomerase
Na replicação, a molécula de DNA será duplicada. As duas moléculas formadas serão constituídas por uma fita que pertencia à molécula original e uma fita recentemente sintetizada. Pelo fato de as novas moléculas serem constituídas por uma fita “antiga” e uma “nova”, esse processo é denominado semiconservativo. O processo de replicação é mediado por ação de algumas enzimas, como a helicase, responsável por desenrolar a hélice deDNA e separar as cadeias de nucleotídeos.
O processo de replicação inicia-se com a separação das duas fitas que formam a molécula de DNA, por meio da ação de enzimas, como a helicase. Isso ocorre em pontos em que existem sequências específicas de nucleotídeos, esses pontos são denominados origens de replicação. As enzimas que atuam nesse processo identificam-nos e ligam-se ao DNA, formando as chamadas “bolhas” de replicação.
Em células procarióticas, cujo DNA é circular, esse processo inicia-se em um único ponto. Em células eucarióticas, como na espécie humana, ele se inicia em diversos pontos. As diversas bolhas formadas fundem-se posteriormente, fazendo com que a replicação ocorra de forma mais rápida. O processo de replicação ocorre nos dois sentidos da fita de DNA.
As helicases movem-se sobre as fitas de DNA, separando as cadeias. As regiões onde as cadeias separam-se apresentam a forma de Y e são chamadas de forquilha de replicação. Para evitar que as cadeias liguem-se novamente, as chamadas proteínas ligantes ao DNA de cadeia simples (SSB) ligam-se às cadeias simples, no entanto, elas o fazem de forma a deixar as bases livres para a associação dos nucleotídeos.
À medida que essas associações ocorrem e a nova cadeia, denominada cadeia complementar, é sintetizada, essas proteínas desprendem-se do DNA. É importante lembrar que, nas moléculas de DNA, as bases nitrogenadas ligam-se da seguinte maneira: Timina (T) – Adenina (A)
A cadeia que vai ser formada inicia-se com uma porção de RNA. Essa cadeia inicial de RNA, sintetizada por meio da ação da enzima primase, é denominada de oligonucleotídeo iniciador (primer, em inglês).
O oligonucleotídeo iniciador é formado com base em um nucleotídeo de RNA, sendo que, em seguida, os demais vão sendo adicionados tendo a fita de DNA como molde. O oligonucleotídeo iniciador completo é então pareado com a fita molde, e a nova cadeia de DNA é iniciada. O oligonucleotídeo iniciador, quando está completo, apresenta entre cinco e 10 nucleotídeos.
O início da formação da nova cadeia de DNA ocorrerá da extremidade 3' do oligonucleotídeo iniciador. Enzimas, denominadas de DNA-polimerases, iniciam a ligação dos nucleotídeos livres no núcleo ao oligonucleotídeo iniciador e, em seguida, adicionam os nucleotídeos complementares aos da fita-molde.
Devido à estrutura do DNA, os nucleotídeos só poderão ser adicionados na extremidade 3' do oligonucleotídeo iniciador ou da fita de DNA que está sendo sintetizada. Assim, a nova fita poderá ser aumentada apenas no sentido do lado do carbono da pentose ligado ao fosfato (carbono 5') em direção ao carbono 3' da pentose (5'→3').
À medida que a forquilha vai sendo aberta, a adição de nucleotídeos em uma das fitas dá-se de forma contínua, essa fita é denominada de fitar líder ou fita contínua. No entanto, para que a outra fita seja alongada nesse sentido, a adição de nucleotídeos ocorrerá em sentido oposto ao da progressão da forquilha por meio de fragmentos, denominados fragmentos de Okazaki (em células eucarióticas, eles possuem entre 100 e 200 nucleotídeos). Essa fita é denominada de fita retardada ou fita descontínua, e, diferentemente da fita líder, que necessita apenas de um oligonucleotídeo iniciador, cada fragmento dela deverá ser iniciado separadamente.
Ao fim, a enzima DNA ligase liga os fragmentos, formando uma fita única de DNA. Tem-se agora duas moléculas de DNA, exatamente iguais em relação à sequência de nucleotídeos, sendo que essas moléculas são constituídas por uma fita antiga, pertencente à molécula original, e uma fita nova.
Fluxo de informação: RNA Transcrição
Transcrição do DNA
A transcrição é o nome que se dá à formação de RNA a partir de uma fita de DNA, havendo a “cópia” das informações contidas no DNA para o RNA. Esse processo é de extrema importância, pois as informações transcritas para a molécula de RNA são traduzidas na formação de proteínas. A transcrição pode ser dividida em três fases: início, elongação e término.
A transcrição é um processo por meio do qual ocorre a síntese de RNA a partir das informações contidas no DNA. Nesse processo, uma cadeia de DNA é transcrita em uma molécula de RNA simples, que se torna complementar à cadeia de DNA. Para que isso ocorra, uma molécula de DNA terá suas duas cadeias afastadas, e nucleotídeos livres de RNA se ligarão a um dos filamentos. Essa fita de RNA formada sob o controle da enzima RNA-polimerase se destacará da fita molde de DNA e se deslocará para o citoplasma. Já as duas cadeias de DNA se ligarão novamente.
A transcrição ocorre de maneira diferenciada em organismos procariontes e eucariontes. Como em organismos procariontes o DNA não está localizado separadamente das estruturas responsáveis pela síntese de proteínas (processo conhecido por tradução), esse processo inicia-se ainda enquanto ocorre a transcrição. Já em organismos eucariontes, onde o DNA encontra-se no núcleo da célula – que é delimitado pela membrana nuclear (carioteca) –, a tradução inicia-se apenas ao fim do processo de transcrição.
Os organismos eucariontes apresentam ao menos três tipos de RNA-polimerase que atuam na transcrição de moléculas de RNA. Entre as moléculas de RNA transcritas, basicamente três estão envolvidas na síntese de proteínas. São elas:
· RNAr (RNA ribossômico): a maior molécula de RNA entre as três envolvidas no processo de síntese de proteínas. Fica armazenada no núcleo (associado a proteínas), e, em seguida, é transportada ao citoplasma para formar os ribossomos;
· RNAm (RNA mensageiro): responsável pelo transporte da informação transcrita da cadeia de DNA. A informação é transportada por meio de códons, que são sequências de três nucleotídeos, por exemplo, AUG – Adenina, Uracila e Guanina;
· RNAt (RNAt transportador ou de transferência): é a menor das moléculas de RNA. Apresenta-se torcida sobre si mesma com regiões onde ocorre o pareamento de bases e uma região com três bases livres, denominadas de anticódons, que podem parear com um dos códons do RNAm. Essas moléculas de RNA transportam aminoácidos específicos, de acordo com seu anticódon, do citoplasma até os ribossomos. É importante destacar que os ribossomos são fundamentais para a síntese de proteínas.
Fases da Transcrição:
O processo de transcrição pode ser dividido, por questões didáticas, em três fases: início, elongação, também chamada de alongamento, e término, como veremos a seguir.
1. Início
O processo de transcrição inicia-se com o reconhecimento da sequência específica do DNA a ser transcrita. As ligações de hidrogênio que unem as duas cadeias de DNA se rompem e as duas fitas se separam. Apenas uma das duas fitas servirá como molde para a síntese de RNA.
2. Elongação ou Elongamento
Na fase de elongação ou alongamento, os nucleotídeos são incorporados a uma fita molde de DNA, e a outra fita de DNA permanece inativa. Os nucleotídeos estão presentes no núcleo livremente e ligam-se à fita molde de uma forma definida, pois as bases nitrogenadas são complementares, como pode ser observado a seguir:
Adenina (A) do DNA – Uracila (U) do RNA
Timina (T) do DNA – Adenina (A) do RNA
Citosina (C) do DNA – Guanina (G) do RNA
Guanina (G) do DNA – Citosina (C) do RNA
3. Término
Assim que a fita de RNA está pronta, ela se destaca da fita molde de DNA e se desloca em direção ao citoplasma, onde, em seguida, ocorre outro processo, denominado de tradução (síntese de proteínas). As duas fitas de DNA, então, ligam-se novamente. O afastamento e o encaixe das duas fitas de DNA ocorrem sob ação de uma enzima denominada de RNA-polimerase, que se desloca sob a molécula de DNA durante o processo de transcrição.
Transcrição RNA Polimerase reconhece o sítio que tem de atuar por causa do Promotor
Célula Procariótica e Célula Eucariótica
Célula Procariótica
· Sem envelope nuclear
· Sem organelos envolvidos por membrana
· Organismos unicelulares
· Pequenos
Célula Eucariótica
· Presença de membrana nuclear e organelos envoltos em membrana
· Possuem mitocôndria e cloroplastos, organelos que só existem nas células eucarióticase que têm o seu próprio DNA, tendo como função produzir energia.
· A célula eucariótica moderna originou-se com o aparecimento de alguns passos essenciais:
· Potencial para uma superfície celular flexível
· Citoesqueleto bem definido
· Origem de um envelope nuclear
· Desenvolvimento de vesículas digestivas (lisossomas onde as macromoléculas são hidrolisadas)
· Endossimbiose
· Formação de organismos multicelulares
Célula Eucariótica Animal
A Célula Eucariótica Animal, contrariamente à Célula Eucariótica Vegetal, não possui parede celular nem cloroplastos e, apresenta vacúolos pequenos.
Organelos:
· Retículo Endoplasmático (Liso e Rugoso): Rede de sacos e tubos membranosos; Ativo na síntese de membrana e outros processos sintéticos e metabólicos onde se dá a síntese de proteínas; Tem regiões ásperas (contém os ribossomas) e lisas.
· Centrosoma: Região onde os microtúbulos da célula são iniciados; Contém um par de centríolos.
· Flagelo: Estrutura de mobilidade presente em algumas células animais, composta por um agrupamento de microtúbulos dentro de uma extensão da membrana plasmática.
· Citoesqueleto: Reforça a forma da célula; Funções no movimento celular; Os componentes são feitos de proteína. Inclui: Microfilamentos, Filamentos intermediários e Microtúbulos.
· Microvilosidades: Projeções que aumentam a área de superfície da célula.
· Peroxissomo: Organelo com várias funções metabólicas especializadas; Produz peróxido de hidrogénio como um subproduto e depois converte-o em água.
· Mitocôndria: Organelo onde ocorre a respiração celular; E maior parte do ATP é gerado.
· Membrana plasmática: Membrana que envolve a célula.
· Ribossomas (pequenos pontos roxos): Complexos que formam proteínas; Livres no citosol ou ligados ao Retículo Endoplasmático Rugoso ou Envelope Nuclear.
· Complexo de Golgi: Organelo ativo na síntese, modificação, classificação e secreção de produtos celulares.
· Lisossoma: Organelo digestivo onde as macromoléculas são hidrolisadas.
· Núcleo:
· Envelope nuclear: Membrana dupla envolvendo o núcleo; Perfurado por poros; Contínuo com o Retículo Endoplasmático.
· Nucléolo: Estrutura não membranosa envolvida na produção de ribossomas; Um núcleo tem um ou mais nucléolos.
· Cromatina: Material constituído por DNA e proteínas; Visível numa células em divisão como cromossomas condensados individuais.
Célula Eucariótica Vegetal
Contrariamente às Células Eucarióticas Animais, as Células Eucarióticas Vegetais apresentam parede celular (composta por celulose, hemicelulose e pectina), bem como plasmodesmo, cloroplastos e, apresentam vacúolos grandes. 
Organelos:
· Retículo Endoplasmático Rugoso
· Retículo Endoplasmático Liso
· Complexo de Golgi
· Mitocôndria
· Peroxissoma
· Membrana plasmática
· Parede celular: Camada externa que mantém a forma da célula e protege a célula de danos mecânicos; Feito de celulose, outros polissacarídeos e proteínas.
· Parede da célula adjacente
· Ribossomas (pequenos pontos castanhos)
· Vacúolo central: Organelo proeminente em células vegetais mais velhas; As funções incluem armazenamento, decomposição de produtos residuais e hidrólise de macromoléculas; Alargamento do vacúolo é um mecanismo importante de crescimento da planta.
· Cloroplasto: Organelo fotossintético; Converte a energia da luz solar em energia química armazenada em moléculas de açúcar.
· Plasmodos: Canais citoplasmáticos através das paredes celulares que conectam com os citoplasmas das células adjacentes.
· Citoesqueleto:
· Microfilamentos
· Microtúbulos
· Núcleo:
· Envelope nuclear
· Nucléolo
· Cromatina
Célula Eucariótica – Fungos
As células dos fungos são similares às células animais, com as seguintes particularidades:
· Podem ter parede celular que contém quitina
· Fungos multicelulares podem apresentar hifa – uma especialização que forma o micorriza
· Apresentam menor compartimentalização entre células (mesmo as septas podem permitir passagem de citoplasma, organelos e até núcleos)
· Só os fungos mais primitivos apresentam flagelos.
Célula Eucariótica – Protista
Definidos na negativa: São células eucariotas que não são plantas, animais ou fungos
· Podem ser pequenos como protiotas
· Maioria são unicelulares
· Podem apresentar organelos fotossintéticos, mitocôndrias, ou organelos especializados (vacúolo contráctil) 
· Exemplo: leveduras
O Núcleo – “A Central de Informação”
O núcleo alberga a maioria do DNA e dos ribossomas de cada célula
· Lamina: rigidez estrutural
· Poros nucleares: entrada e saída de RNA e proteínas
· Cromatina: complexo de DNA + proteínas
· Nucléolo: síntese de rRNA e montagem de ribossomas
Ribossomas – “Fábrica de Proteínas”
Os ribossomas são compostos por RNA ribossomal e proteínas.
Não são organelos!
Os ribossomas produzem proteínas em dois locais:
· Ribossomas livres no citoplasma (proteínas do citoplasma)
· Ribossomas associados ao exterior do retículo endoplasmático ou ao envelope nuclear (proteínas membranares, para exportar para organelos, ou para excreção)
Uma só célula pode ter milhões de ribossomas!
Intrões, Exões e DNA Codificante
Exões
Os Exões são as sequências de nucleótidos no ADN e no RNA que são conservadas na criação do RNA maduro. O processo por que o ADN é usado enquanto um molde para criar o mRNA é chamado transcrição.
O mRNA trabalha então conjuntamente com os ribossomas e o RNA de transferência (tRNA), ambos presente no citoplasma, para criar proteínas em um processo conhecido como a tradução.
Os Exões incluem geralmente o 5' - e 3' - as regiões untranslated de mRNA, que contêm codões do começo e de parada, além do que todas as sequências de codificação da proteína.
Intrões
Os Intrões são as sequências de nucleótidos no ADN e no RNA que não codificam diretamente para proteínas, e são removidos durante a fase do RNA de mensageiro do precursor (pre-mRNA) da maturação do mRNA pela emenda do RNA.
É vital para os Intrões serem removidos precisamente, porque todos os nucleótidos restantes do Intrão, ou supressão de nucleótidos do Exão, pode conduzir a uma proteína defeituosa que está sendo produzida. 
Tradução do DNA
Conversão da informação presente no mRNA numa sequência especifica de aminoácidos (cadeia polipetídica), mediada por ribossomas e tRNA, isto é, a síntese de polipeptidos dirigida pelo RNA.
A tradução do mRNA ocorre em três etapas: iniciação, alongamento e terminação. A informação presente no mRNA (transcrito anteriormente do DNA) e organizada em codões (sequência de 3 nucleótidos - tripleto), é reconhecida pelos anticodões (sequência de 3 nucleótidos no tRNA, complementar do codão do mRNA) presentes nos tRNA’s que transportam os resíduos de aminoácidos. As moléculas de tRNA estabelecem a ligação entre cada codão do mRNA e o respectivo aminoácido, permitindo assim, nos ribossomas, a tradução da informação codificada no mRNA em proteína.
A síntese proteica inicia-se, em geral, pelo codão AUG (""codão de iniciação"") que especifica o aminoácido metionina. Assim todas as proteínas recém-sintetizadas contêm metionina como primeiro aminoácido, que é frequentemente excluído da cadeia polipeptídica (clivado) pouco depois do fim do processo, pela enzima aminopeptidase.
Como decorre a tradução?
1. Iniciação
A tradução inicia-se com a formação de um Complexo de iniciação:
- tRNA que transporta o primeiro aminoácido – a metionina;
- subunidade menor do ribossoma; que se liga ao ponto de iniciação do mRNA, o codão de iniciação (AUG). 
O anticodão correspondente do tRNA é UAC que emparelha com o codão de iniciação cuja sequência é complementar. Após a formação do complexo de iniciação a subunidade maior do ribossoma liga-se a este complexo e começa a etapa de alongamento da cadeia peptídica. O ribossoma tem dois locais de reconhecimento do tRNA: o local A – à qual se liga o tRNA que transporta o aminoácido, e o local P – que transporta o tRNA já ligado à cadeia polipeptídica em crescimento e um terceiro local, o local E, correspondente ao local de saída do tRNA. Todo este mecanismo do mRNA, das duas subunidades do ribossoma e do tRNA com a metioninaé auxiliado pela presença de proteínas – factores de iniciação – que utiliza a energia do GTP. A metionina transportada pelo tRNA ocupa o local P na fase de iniciação e o local A livre poderá receber o segundo tRNA com o segundo aminoácido.
2. Alongamento
O segundo tRNA liga-se ao local A. A proximidade dos dois aminoácidos permite o estabelecimento de uma ligação peptídica (entre aminoácidos), entre o grupo carboxilo (COOH) do aminoácido do local P e o grupo amina (NH2) do aminoácido do local A, catalizada por uma enzima, a peptidil-transferase. O segundo tRNA agora transporta o dipéptido, mudando-se para o local P do ribossoma que se desloca ao longo do mRNA mais um tripleto no sentido 5’ – 3’ da molécula de mRNA. Após transferir o aminoácido o tRNA passa para o local E e é libertado para o citoplasma onde se irá ligar a outro aminoácido que mais tarde fará parte da cadeia polipeptídica.
O processo continua com a ligação de outro tRNA que transporta um determinado aminoácido ao local A do ribossoma, o aminoácido forma uma ligação peptídica com o último aminoácido da cadeia já formada ligada ao tRNA no local P e por fim todo o complexo tRNA – cadeia polipeptídica desloca-se para o recém disponível local P.
3. Terminação
O processo pára quando no local A, surge um dos codões de terminação ou codão stop (UAA, UAG e UGA). Nenhum destes codões tem um aminoácido correspondente (ver código genético) nem se liga a um tRNA. O codão stop liga-se a uma proteína – factor de dissociação, que promove a ligação de uma molécula de água em vez de um aminoácido à cadeia polipeptídica, parando a síntese proteica. O último tRNA liberta-se do ribossoma, separando-se as duas subunidades (reutilizáveis) e a proteína recém - sintetizada é libertada, adquirindo a sua estrutura tridimensional.
Cada molécula de mRNA pode ser traduzida simultaneamente por vários ribossomas, produzindo muitas cópias da mesma proteína. Ao conjunto formado pela molécula de mRNA a ser traduzida, pelo vários ribossomas e pelas cadeias de péptidos em crescimento denomina-se polirribossoma ou polissoma.
Nos procariotas, como não há núcleo, o DNA encontra-se no citoplasma e não ocorre o processamento da molécula de mRNA formada na transcrição, dado que o DNA dos procariotas não possui intrões (regiões do DNA que não codificam informação). O mRNA transcrito está imediatamente acessível para ser traduzido pelos ribossomas e sintetizar proteínas. Os processos de transcrição e tradução nos procariotas são quase simultâneos.
As proteínas podem ser sintetizadas em locais diferentes, isto é, as proteínas que ficam solúveis na célula são sintetizadas em ribossomas livres no citoplasma (que não estão ligados ao retículo endoplasmático); as proteínas que farão parte das membranas, que serão exportadas para o exterior da célula ou que terminarão nos lisossomas ou peroxissomas, são produzidas nos ribossomas associados ao retículo endoplasmático rugoso.
Código Genético
O código genético é o conjunto de regras através das quais a informação contida no material genético (DNA e RNA) é traduzida em proteínas, estabelecendo-se a correspondência entre sequências de 3 nucleótidos de RNA (codões) e um determinado aminoácido.
Características do código genético:
Como o código genético se forma a partir de uma cadeia molde de DNA cada codão do mRNA é complementar de uma sequência de três nucleótidos de DNA, designada codogene, e que está presente na cadeia de DNA transcrita.
O código genético apresenta as seguintes características:
- Cada aminoácido é codificado por um tripleto de nucleótidos do mRNA – codão.
- Universalidade: a um determinado codão corresponde o mesmo aminoácido na maioria dos organismos. Existem algumas excepções quando se consideram reinos diferentes de seres vivos.
- Redundância: existem vários codões que podem codificar o mesmo aminoácido (ver tabela) (as combinações de 3X3 geram 64 variantes possíveis)
- Não ambiguidade: um determinado codão não codifica dois aminoácidos diferentes
- Codões de finalização (ou stop): os tripletos UAA, UAG e UGA quando ‘lidos’ pelo complexo de tradução indicam a interrupção do processo, e a proteína é libertada. Nenhum destes codões codifica um aminoácido.
- Codão de iniciação: o codão AUG que codifica o aminoácido metionina, é responsável pelo sinal de início da tradução.
- O terceiro nucleótido de cada codão é menos específico que os dois primeiros.
Maturação do pré-mRNA em mRNA
Do Gene à Proteína
Em procariotas, pode não haver presença de intrões, logo o mRNA não necessita de ser processado.
Com gDNA eucariota, normalmente, apenas uma das cadeiras é codificante.
O mRNA é lido em tripletos para codificar proteína.
É a chamada critical step Ligação do tRNA ao aminoácido correto.
mRNA produz várias proteínas em simultâneo devido aos polirribossomas
Nota:
Os seres simples (como as bactérias) não conseguem produzir algumas proteínas, porque não têm o mecanismo para transformá-las (não conseguem excluir os intrões). Uma solução é dar à bactéria um gene sintético mais simples (livre de intrões, só com exões), pois elas não conseguem traduzir genes complexos.
Proteínas humanas produzidas em bactérias: criar uma nova estirpe bacteriana que consiga produzir as proteínas (através da engenharia genética) sintetizar uma proteína artificialmente com a substituição de codões (estes codões elas vão conseguir traduzir facilmente)
Modificações pós-traducionais
· Formação correta de pontes dissulfeto
· Glicosilação
· Proteólise
· Alteração de aminoácidos:
· Fosforilação
· Acetilação
· Adição de ácidos gordos
A estrutura das proteínas determina a sua função
Cristalizar proteínas Permite determinar o centro ativo das enzimas; Ver quais são os valores para os parâmetros ótimos; Determinar a estrutura
Tecnologia de DNA Recombinante
Procariotas Bibliotecas genómicas
Eucariotas Bibliotecas de cDNA (neste caso, só tenho exões)
Quando quero clonar um organismo Não preciso de ter acesso ao DNA de todo o organismo, basta ir à “peça” específica que é do meu interesse.
Nota: O nosso DNA não pode ficar para sempre no tubo, devemos de o introduzir nas células (em forma de plasmídeo) é importante ter em atenção que uma bactéria contém (vai conter) um só plasmídeo! Quando as bactérias crescem numa caixa de Petri, elas vão multiplicando-se, originando colónias.
Sistemas de expressão de proteína recombinante:
· Bactéria 
· Insetos
· Animais
· Fungos
· Plantas
Engenharia de Proteínas Mutagénese; Seleção
Engenharia de Proteínas utilizada para manipular o DNA Preciso de: Enzimas de restrição; Vetores de clonagem; Células hospedeiras.
Cassete resistente onde é inserido o antibiótico no plasmídeo
DNA Recombinante: São moléculas de DNA produzidas a partir da combinação de sequências de DNA proveniente de diferentes fontes. 
Clonagem Molecular Técnica central da metodologia do DNA Recombinante.
Tecnologia do DNA Recombinante: Conjunto de técnicas que permitem a manipulação do DNA.
Enzimas de Restrição:
Fundamentais na manipulação do DNA.
Para que o DNA Recombinante seja originado é necessária a ação das enzimas de restrição – denominadas de Endonucleases de Restrição são enzimas bacterianas que reconhecem sequências de pares de bases específicas na molécula de DNA e as cortam nesses pontos.
Como o DNA Recombinante é produzido?
A obtenção do DNA Recombinante baseia-se na Técnica de Clonagem Molecular.
O processo pode ser resumido do seguinte modo:
· 1º passo é isolar um fragmento de DNA que contém o gene de interesse.
· O gene de interesse, agora isolado, é colocado num meio com um fragmento de DNA bacteriano circular (o plasmídeo) e as enzimas de restrição.
· O plasmídeo bacteriano possui a capacidade de inserir um fragmento de DNA externo no seu próprio genoma.
· As enzimas de restrição vão cortar uma determinada região do plasmídeo, onde será ligado ao fragmento de DNA de interesse.
· O fragmento de DNA isolado irá unir-se com o DNA bacteriano, através das enzimas de ligação (as ligases).
· Nesse momento, é originadoo DNA Recombinante.
· O próximo passo é introduzir o DNA Recombinante em bactérias vivas ou diretamente no meio de cultura com as mesmas.
· Após a incorporação do DNA Recombinante, as bactérias serão capazes de produzir uma nova proteína, conforme os genes do fragmento de DNA isolado inicialmente.
Vetor Plasmídeo: cassete resistente (onde é inserido o antibiótico), ORI, região onde as minhas enzimas de restrição vão cortar e onde vou inserir o DNA com o gene de interesse. Plasmídeo vai ser inserido no meio de cultura que contém as bactérias e o antibiótico As bactérias que não capturaram os plasmídeos vão morrer na presença do antibiótico; As bactérias transformadas, isto é, as que capturaram os plasmídeos vão sobreviver e, consequentemente, vai haver replicação do plasmídeo.
Outros vetores de clonagem: Bacteriofagos ou Fagos é um tipo de vírus que infeta especificamente as bactérias.
Replicação dos Fagos
1. Ciclo Lítico
Após injetarem o DNA viral na bactéria, haverá replicação do DNA viral e produção de proteínas virais que formarão novos bacteriófagos que causaram a lise da célula para se libertarem.
· O fago insere-se na bactéria e injeta o DNA
· As moléculas de DNA do fago replicam-se
· Os componentes do capsídeo são sintetizados e, novas partículas de fago são montadas e liberadas.
2. Ciclo Lisogénico
O DNA viral após ser injetado dentro da bactéria, vai se integrar ao DNA bacteriano e ser replicado juntamente quando a bactéria se reproduzir, passando o DNA do bacteriófago para a sua descendência.
· Partícula de fago insere-se na bactéria e injeta o seu DNA
· O DNA circulariza e integra no cromossoma hospedeiro
· Há divisão celular
· O DNA do fago corta o cromossoma hospedeiro
· Novas partículas de fago são produzidas
Resumo da Replicação Lítica e Lisogénica
Razões para clonar:
· Determinação da estrutura primária
· Estudos funcionais
· Biossíntese
· Localização
· Regulação
· Produção de proteína recombinante
· Caracterização bioquímica
· Estrutura tridimensional
Estratégias de Clonagem vai depender:
· Do organismo (procariota ou eucariota?)
· Informações existentes sobre a proteína ou gene
· Sequência está na base de dados? Informação existente sobre a proteína
· Existem genes homólogos?
· Tipo de material disponível comercialmente
· Facilidade na obtenção de sondas
Biblioteca de DNA (genómica): é o conjunto dos fragmentos de restrição de DNA adquiridos a partir de enzimas que realizam o corte do material genético que foram posteriormente clonados.
Quando obtemos toda a sequência de DNA de um organismo é formada a “Biblioteca Genómica”.
Os tipos de biblioteca de DNA possíveis dependem do vetor de clonagem escolhido.
Após a escolha do vetor, opta-se por uma Biblioteca Genómica ou por uma Biblioteca de cDNA.
Procariotas Bibliotecas Genómicas
Eucariotas Bibliotecas de cDNA
Diferenças entre as Bibliotecas Genómicas e as Bibliotecas de cDNA:
· A BG foi escrita diretamente do DNA genómico;
· A BcDNA foi formada usando o mRNA como modelo;
· A BG ocupa todo o genoma desse organismo;
· A BcDNA representa apenas genes específicos;
· Duas enzimas, endonucleases de restrição e ligases são importantes para a construção da BG;
· A enzima transcriptase reversa desempenha um papel significativo na construção da BcDNA;
· A BG ocupa o DNA de organismos procarióticos e eucarióticos;
· A BcDNA representa o DNA de apenas organismos eucarióticos;
· A BcDNA é capaz de causar expressão do genoma em bactérias procarióticas, pois não possuem intrões;
· Uma BG não é capaz de causar expressão no organismo procariótico, porque eles têm intrões e o organismo procariótico não possui máquinas para processar os intrões.
Processos de Identificação do Clone Desejado:
· Rastreio por Hibridização de DNA
· Rastreio por Complementação
· Rastreio por Expressão:
· Imunodeteção
· Actividade da proteína
Hibridização de DNA
Como qualquer outra técnica de hibridação de ácidos nucleicos baseia-se na capacidade destas moléculas, quando em cadeias simples, se poderem associar formando cadeias duplas, estáveis, em resultado do estabelecimento de ligações de hidrogénio entre duas cadeiras simples que apresentam sequências de nucleótidos com bases complementares. Quando as duas cadeiras simples, que se associam, são de proveniência diferente, forma-se uma cadeia híbrida, daí o nome hibridação.
A Hibridação de DNA permite detetar, especificamente, a presença de sequências de DNA que sejam complementares de uma sonda, um fragmento, também ele de DNA, selecionado de modo a permitir essa deteção específica.
Desenha-se uma sequência de DNA que seja compatível com o local específico que queremos Sonda
Técnica: A desnaturação do DNA pode ser provocada por aquecimento ou por exposição a pH elevado. Assim, após a desnaturação, as duas cadeias de DNA deixam de estar em dupla hélice, ficando duas cadeias simples. Após isto, utilizamos a sonda de DNA marcada a sonda é uma molécula de DNA de cadeia simples usada para detetar sequências complementares (estas utilizam radioatividade ou marcadores químicos para facilitar a sua deteção). As BG e de BcDNA podem conter mais de um milhão de clones, no caso dos eucariotas; logo, procurar um clone em específico tem que obedecer a um método preciso como este, caso contrário, seria praticamente impossível encontra-lo. De forma geral, existem 2 formas para examinar (fazer o screening) uma biblioteca com o objetivo de identificar os clones que “transportam” um determinado gene ou outra região de DNA de interesse: 1. Deteção com uma sonda de oligonucleotídeos que se ligue ao clone de interesse; 2. Deteção baseada na expressão da proteína que o gene codifica.
“Screening” da Biblioteca
Caixa de Petri “mãe” (onde as células cresceram) com várias colónias Transferência de algumas células para um prato com uma determinada matriz Células lise manifestam o DNA Hibidrização (insere-se a sonda) Algumas colónias vão reagir, emparelhar com o DNA da sonda (colónias positivas) Vamos novamente à caixa de Petri “mãe” e retiramos a(s) colónia(s) positiva(s) para um tubo contendo as células de subcultura.
Deteção da Proteína por Imunodeteção
Caixa de Petri “mãe” (onde as células cresceram) com várias colónias Transferência de algumas células para um prato com uma determinada matriz Células lise manifestam a proteína Adiciona-se primeiro X e lava-se Adiciona-se segundo X e lava-se Adiciona-se substrato com cor no prato Algumas colónias vão reagir, as que degradam o substrato dão sinal (colónias positivas) Vamos novamente à caixa de Petri “mãe” e retiramos a(s) colónia(s) positiva(s) para um tubo contendo as células de subcultura.
E em Organismos Eucariotas?
Procede-se de maneira muito semelhante
· Bibliotecas de cDNA (cadeia complementar do mRNA)
· Isolamento do mRNA (mRNA é muito susceptível de se degradar, muito instável, pelo que não pode ser armazenado)
· Transformar o mRNA em DNA
· Colocar nas células do organismo
“Produção” do cDNA
1. Transcriptase Reversa
2. DNA Pol I e RNase H
3. E. Coli DNA Ligase
mRNA Primer Transcriptase reversa Hibrido mRNA/cDNA RNase H Fragmentos de RNA DNA Pol I Fragmentos de RNA Primers E. Coli DNA Ligase Biblioteca cDNA
Notas:
· Num único gene, podemos ter vários mRNAs, logo, podem ser codificadas várias proteínas!
· No mRNA, temos regiões não traducionais que têm como função só servir como reguladores
· Estratégia de clonagem depende do que se está a clonar!
Clonagem por PCR
Com base em base de dados, retiramos uma sequência complementar à que queremos e desenhamos primers com base nessa sequência.
PCR:
· Desnaturação: Para desemparelhar o DNA (colocar a molécula aberta, com as duas cadeias separadas)
· Annealing: Para os primers ligarem-se às regiões para que são específicas
· Extensão: Para a polimerase trabalhar (a uma elevada temperatura específica) para fechar a cadeia, agora com os primers já inseridos (nova cadeia)
Nota: Na etapa de Desnaturação, há a possibilidade de desnaturar as enzimas, por isso, usar DNA Polimerases termoestáveis.
Amplificaçãode DNA
Temos que saber: Sequência de DNA e Sequência dos Primers
Organismo Procariota: PCR
Organismo Eucariota: RT-PCR Criar primeiro um cDNA (ver base de dados), mas há raras excepções onde se pode fazer diretamente o PCR
Gene Procariota: 
· Isolamento do DNA genómico
· Reação de amplificação com primers específicos para a ORF (Open Reading Frame: Grelha Aberta de Leitura).
Gene Eucariota:
· Isolamento de RNA total
· Isolamento de mRNA poly A+
· Síntese da primeira cadeia de cDNA
· Amplificação do cDNA por PCR
Expressão Heteróloga
Porquê?
· Dificuldade em isolar ou produzir quantidade suficiente de proteína a partir do sistema natural (tudo o que existe naturalmente em grande quantidade já foi estudado!
· Optimizar a proteína para novas aplicações
Para quê?
· Produzir proteína recombinante em grande quantidade (sobre-expressão)
· Estabelecer um sistema fácil de proceder engenharia da proteína
· Produção de anticorpos
· Determinação da estrutura tridimensional
· Etc.
Sistemas de Expressão: Procariotas vs Eucariotas
Vantagens de usar Procariotas: nível de expressão elevado; expressam-se mais rápido (aproximadamente, em 1 dia); mais baratos; mais fáceis de manusear.
Os Eucariotas apresentam as características contrárias.
Modificações pós-traducionais são essenciais para algumas proteínas, sem isso as proteínas não se ativam! E só os organismos Eucariotas têm a capacidade de efetuar essas modificações pós-traducionais.
Não desenhamos uma bactéria por inteiro, porque isto iria precisar de muito açúcar na superfície para ser estável, ia ser um sistema complexo e dispendioso.
Nota: Nunca podemos esquecer para que queremos a proteína; que cada proteína é única; e, que uma boa estratégia nem sempre funciona!
A clonagem de um gene não garante a expressão eficiente da proteína!
Escolher o sistema de expressão e manipular a expressão genética
· Alterar características do plasmídeo de clonagem para a expressão do gene
· Selecionar um vetor de expressão
· Alterar características do gene clonado
Manipulação da expressão genética em Procariotas
· Promotor e terminador da transcrição
· Eficiência na tradução
· Estabilidade da proteína
· Localização celular (secretada ou não?)
· Etiquetas de proteína para aumentar o rendimento, para separar a proteína
Transcrição: Ponte de Controle
· Controlada pelo Promotor
· Características do Promotor: Forte e Regulável
Expressão génica por um Promotor forte e regulável
Forte: Grande afinidade pela RNA Polimerase
· Ligação forte gene muitas vezes transcrito
· Ligação fraca RNA Polimerase sai pouco transcrito
Regulável: Controle (indução) da expressão do gene 
· Utilização de indutores ou repressores
Nota: Deixar as células crescerem muito e só depois produzirem a proteína (caso seja uma toxina) elas vão morrer na mesma, mas vão produzir a proteína em grandes quantidades (mais do que se produzissem no inicio)!
Promotores com relevância em Biotecnologia e seus indutores:
· Lac
· Trp
· Tac ou Trc
Tudo isto num sistema único…
SISTEMA pET
O Sistema pET é o sistema mais poderoso já desenvolvido para a clonagem e expressão de proteínas recombinantes em E. coli com base no sistema acionado pelo promotor T7.
Tem sido usado para expressar milhares de proteínas diferentes.
O Sistema pET fornece 6 combinações possíveis de vetor-hospedeiro que permitem o ajuste dos níveis de expressão basal para otimizar a expressão do gene alvo.
Essas opções são necessárias porque nenhuma estratégia ou condição única é adequada para cada protocolo de destino.
IPTG
Muito parecido com a lactose
Porém, não é metabolizado como a lactose, mas é degradado pela bactéria
Mas, não se degrada pela B-galactosidade
Eficiência na Tradução
Promotor forte muito mRNA
Boa tradução muita proteína
Em Procariotas…
Início da Tradução: Ribosome-binding site
Sequência de 6-8 nucleótidos, no mRNA, que emparelha com a sequência complementar do mRNA ribossomal (menor subunidade)
Localizada a, aproximadamente, 10 nucleótidos a montante do codão de iniciação
Ligação forte: mRNA 16S rRNA
A Sequência de Shine-Dalgarno é uma sequência do RNA mensageiro de bactérias. Esta sequência de RNA ajuda a recrutar o ribossoma ao mRNA para iniciar a síntese de proteínas, alinhando o ribossoma com o codão de iniciação. Esta Sequência SD tem que ser complementar à sequência de 16S rRNA da célula hospedeira.
Utilização de codões diferentes
Um aminoácido Múltiplos codões
Baixa frequência de utilização Baixa quantidade de tRNA
Diferentes organismos utilizam codões diferentes com frequências distintas!!
Estratégias de otimização
Síntese química de um novo gene Pôr tRNAs dentro da células mudar a sequência para uma que apresente maior expressão nesse organismo (para codões mais expressivos nesse organismo)
pRARE
Genes que codificam codões raros em E. coli para expressão de genes eucariotas em E. coli
Organismo hospedeiro
E. coli mais utilizado bem caracterizado possui várias estirpes, ver qual é a melhor para o nosso caso
Contudo, nem sempre é o melhor organismo para expressão… mas pode ser otimizado!
Aumentar a estabilidade da proteína
O tempo de meia-vida de uma proteína pode variar de alguns minutos até mais de 24 horas.
Podemos adicionar certos aminoácidos ao N-terminal das proteínas para aumentar a estabilidade e, consequentemente, aumentar o tempo de meia-vida.
Fatores que afetam a estabilidade:
· Determinados aminoácidos no N-terminal
· Presença de sequências PEST (Prolina Glutamato Serina Treonina)
· Sistema de expressão
Localização final da proteína expressa Bactéria secreta ou não secreta a proteína? Se for secretada, a estabilidade da proteína aumenta Pode ser mais fácil de purificar.
Nota: Se objetivo for aumentar a estabilidade, ficar longe das protéases!
Soluções para expressar em organismos sem membrana externa:
· Bactérias gram positivas
· Fungos filamentosos
· Leveduras
· Células eucarióticas
Ter em atenção:
· Nível de expressão
· Custo metabólico
· Toxicidade
Problemas na expressão de proteína:
· Nível de expressão
· Degradação
· Purificação
Solução?
Insolúvel Corpos de Inclusão (para prevenir a desagregação da proteína); Produção: E. Coli qualquer estirpe; Purificação dos corpos de inclusão: fácil; Ciclo de desnaturação e renaturação é complicado.
Solúvel Proteínas de Fusão (remoção do codão “stop”)
Obtenção da estrutura nativa (Folding):
· Método de diluição rápido
· Método diálise 
· Método cromatográfico
Purificação:
Separação da proteína com a estrutura correta
Separação por cromatografia de coluna explorando as características das proteínas
· Tamanho
· Carga
· Afinidade
· Hidrofobicidade
Problemas de expressão Proteínas de Fusão são a solução!
O codão “stop” é removido a “pauta de leitura” é contínua
Servem para:
· Solubilizar
· Purificar
· Identificar
· Concentrar
Expressão heteróloga de proteínas em células eucariotas
Em procariotas Instabilidade; Inatividade; Contaminantes; …
Modificações pós-traducionais
Modificação pós-traducional de proteínas é a modificação química de uma cadeia proteica depois de sua tradução.
Algumas dessas modificações estendem o conjunto de possíveis funções proteicas pela adição de novos grupos funcionais ou de cadeias de carboidratos e/ou lipídios. Essas alterações químicas podem alterar a hidrofobicidade de uma proteína e assim determinar a localização celular desta. Outras modificações, como a fosforilação, são parte de um sistema para controlar o comportamento proteico amplamente utilizado pela célula.
Exemplo de Animais Transgénicos 
Proteína purificada a partir do leite leite comercializado com a proteína de interesse
Produção de gado transgénico
Recolha dos oócitos maturação in vitro fertilização in vitro centrifugação dos ovos microinjeção desenvolvimento do embrião implantação do embrião seleção da descendência 
Plantas como Bioreatores
Possíveis utilizações:
· Anticorpos monoclonais
· Agentes terapêuticos
· Polímeros (plásticos biodegradáveis)
· Biofuel
Vantagens de plantas transgénicas:
· A integração de DNA em plantas éestável (pode não ser em microorganismos)
· Modificações pós-traducionais são semelhantes às das células de mamíferos
· Armazenamento de longa duração: sementes
Engenharia de Proteínas
Proteínas nativas não são o ideal!!
Evolução de Enzima Dirigida (Directed Enzyme Evolution)
Mutações aleatórias são introduzidas no gene para a enzima que será alterada Os genes são inseridos em bactérias, que os usam como modelos e produzem enzimas mutantes aleatoriamente As enzimas alteradas são testadas Aquelas que são mais eficientes em catalisar a reação química desejada são selecionadas, as outras são descartadas Novas mutações aleatórias são introduzidas nos genes das enzimas selecionadas O ciclo começa novamente.
Este tipo de evolução permite re-optimizar uma enzima para um novo propósito.
Nota:
Enzimas e outras proteínas são altamente evolutíveis!
As proteínas podem adaptar-se, acumulando mutações benéficas e, até adquirir novas funções por uma pequena alteração da sequência.
Desvantagem: muitas mutações benéficas estão longe do sítio ativo e não podem ser previstas, ou mesmo, explicadas.
Propriedades que podemos modificar nas enzimas:
· Propriedades cinéticas
· Termo-estabilidade
· Estabilidade de pH
· Atividade em diferentes ambientes (solventes
· Alterar a ligação ao substrato
· Dispensar a ligação ao cofactor
· Aumentar a resistência a protéases
· Alterar a regulação alostérica da enzima
Como???
Mutagénese
Alterando a sequência de DNA que codifica a proteína Altero o aminoácido Altero a estrutura da proteína e altero as características enzimáticas
Mutagénese convencional
· Muitas mutações
· Dificil de selecionar
· Muito trabalho
· Etc.
Mutagénese dirigida
Aminoácidos específicos são alterados Poucas mutações Poucas proteínas mutadas Fácil testar as propriedades alteradas
Que informação é necessária?
· Sequência de DNA
· Estrutura 3D da proteína
· Identificar os codões a alterar para modificar os aminoácidos específicos
· Identificar os aminoácidos candidatos a modificação e a modificação em si
- Local ativo, Região Reguladora, Região estabilizadora, …
Métodos:
· Bacteriofago M13
· Plasmídeo
· PCR
Mutagénese por PCR:
Amplificar o plasmídeo com dois primers mutados 
Termoestabilidade: Adição de pontes dissulfeto (S-S)
Subtilisina: Importante na indústria agente de limpeza biodegradável são facilmente inativados por quelantes utilizados nos métodos de lavagens
Mutagénese ao acaso
Muitas vezes não se sabe qual o nucleotideo a mutar método que gere todos os aminoácidos possível em determinado local
Vantagens:
· Não é necessário saber o papel detalhado de cada aminoácido
· Podem ser obtidas proteínas (mutantes) com propriedades importantes
Phage Display
Inserção de um gene num fago Expressão de proteína à superfície da bactéria
PARTE PRÁTICA
Proteoma: Conjunto de proteínas e variantes de proteínas que podem ser encontrados numa células específica quando esta está sujeita a um certo estímulo.
Como posso ver a proteína?
Concentração de proteína pela absorvância
Lei de Beer: A = E x c x l 
Métodos para detetar a atividade enzimática?
Através do aparecimento do produto ou do desaparecimento do substrato
Desenho de ensaio enzimático
Método de deteção
Definição do meio de reação: estabilidade e atividade enzimática
Buffers, sais, ativadores, cofatores, inibidores,
Temperatura e tempo de reação
Enzima: relação com o substrato
Controlo da reação 
Atividade Enzimática
Unidades Internacionais ou Unidades Arbitrárias?
Atividade total na solução usa-se a unidade da atividade enzimática: umol substrato/min
Para seguir durante a purificação usa-se a atividade específica: umol substrato/min-mg E
Para comparar enzimas diferentes usa-se a atividade molecular: umol substrato/min-umol E 
Características das biomoléculas
· Dimensão
· Carga
· Hidrofobicidade/Hidrofilicidade
· Afinidade
Separação por Centrifugação: Separação de um homogéneo celular
Ponto isoelétrico: é o valor de pH onde uma molécula (um aminoácido ou uma proteína) apresenta carga elétrica líquida igual a zero. É o pH no qual há equilíbrio entre as cargas negativas e positivas dos agrupamentos iónicos de um aminoácido ou de uma proteína.
Solubilidade das proteínas
Salting in: Quando as proteínas são colocadas numa solução aquosa, as únicas espécies iónicas em solução são as outras moléculas de proteína. A água, embora polar, é apenas ligeiramente ionizada, de modo que as proteínas tendem a agregar-se com base nas interações iónicas que se formam entre si. As interações entre as moléculas de proteínas são mais favoráveis do que as interações entre a água e uma proteína.
Numa baixa concentração de sal (NaCl), outras espécies iónicas estão agora presentes para competir com a proteína iónicas: as interações de proteína. Como resultado, as interações iónicas entre as proteínas quebram-se e as proteínas dissolvem-se. Tanto os iões pequenos (do NaCl) quanto as proteínas são solvatadas pela água.
Salting out: Em alta concentração de sal, as moléculas de água são mais fortemente atraídas por esses iões pequenos (especialmente iões multivalentes) do que pelas moléculas grandes de proteínas. As proteínas são deixadas então para buscar quaisquer interações favoráveis existentes e estas são as associações proteína: proteína que resulta em agregação e precipitação. 
Diálise
A separação de moléculas muito grandes de muito pequenas é baseada na tentativa de equilibrar a concentração.
NOTAS ADICIONAIS:
Operão de Lactose ( Operão lac):
E. coli pode usar a lactose como fonte de carbono.
As enzimas necessárias só são sintetizadas quando a lactose está presente. 
O operão da lactose consiste em 3 genes estruturais:
· lacZ: codifica para a B-galactosidase. Enzima responsável pela hidrólise da lactose em galactose e glucose.
· lacY: codifica para uma permease, responsável pelo transporte de lactose através da parede celular bacteriana
· lacA: codifica para a transacetilase
Os três genes estruturais são transcritos numa única unidade de transcrição, lacZYA, que apresenta um único promotor (Plac) e um operador (Olac).
Na ausência de lactose, o operador pode ligar um repressor, repressor lac, que impede a transcrição. O repressor lac é codificado pelo gene regulador lacl.
Quando é adicionada lactose às células, o repressor lac altera a sua conformação, reduzindo a sua afinidade para o operador lac. Assim, a RNA polimerase inicia a transcrição dos genes lacZYA.