bacterias e roma

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ITB PROFº MARIA SYLVIA CHALUPPE MELLO
ANA BEATRIZ DE SOUZA
BRUNA GOMES
ERICK MARINHO
ISABELA SANTANA
VITÓRIA CLARO
COMPROVAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DO EXTRATO DE PUNICA GRANATUM NA ESCHERICHIA COLI E STAPHYLOCOCCUS AUREUS
BARUERI, 2020
SUMÁRIO
GLOSSÁRIO	1
INTRODUÇÃO	3
JUSTIFICATIVA	4
3.0. PÚNICA GRANATUM L.	5
3.1. AUTOCIANINA	5
3.2. QUERCETINA	5
3.3. ÁCIDOS FENÓLICOS	5
3.4. TANINOS	6
4.0. STAPHYLOCOCCUS AUREUS	6
5.0. ESCHERICHIA E. COLI	7
6.0. METODOLOGIA	7
6.1. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DA PLANTA	7
6.2. PRODUÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO	8
6.3. TESTES DE IDENTIFICAÇÃO	8
6.3.1 GELATINA	8
6.3.2. CLORETO FÉRRICO	8
6.4. MEIO DE CULTURA	9
6.5. AUTOCLAVE - CUIDADOS NA ESTERILIZAÇÃO EM VAPOR SOB PRESSÃO	10
7.0. PLANEJAMENTO	11
8.0. REFERÊNCIAS	12
1
3
13
GLOSSÁRIO
ABCESSO			 Acúmulo de pus. 
ANTÍGENO	É toda substância estranha ao organismo que desencadeia a produção de anticorpos.
APTIDÃO			Disposição inata ou adquirida para realizar algo. 
BOTÂNICA	Ramo da Biologia que se dedica ao estudo das plantas; abrange o reino vegetal.
COLÔNIA	Organização em que indivíduos da mesma espécie vivem agrupados, interagindo de forma mutuamente vantajosa.
ESPÉCIME		 	Indivíduo como parte de uma espécie, ser. 
ESPORULADA	Vem da esporulação, processo pelo qual alguns gêneros de bactérias formam esporos (unidades de reprodução).
ESTERIFICADAS	Substâncias produzidas com éster (composto orgânico, líquido ou sólido, obtido por meio da combinação e condensação de um ácido orgânico com um álcool). 
ETNOMEDICINAL 	Proveniente da etnomedicina, é uma área de pesquisa ou aplicação da etnologia cujo objeto são as práticas voltadas para conservação e recuperação da saúde ou da medicina.
FERMENTATIVA 		Produz ATP sem a presença de Oxigênio.
FITOTERAPIA 	Estudo das plantas medicinais e suas aplicações na cura das doenças.
HIDROLISÁVEIS 	Deriva da palavra Hidrólise, que é a quebra de substâncias por meio da água, são moléculas que podem ser quebradas/decompostas.
HODIEMOS 			Existe ou ocorre atualmente; atual, moderno, dos dias de hoje.
INOCULAÇÃO	 Consiste em adicionar micro-organismos em um meio de cultura para verificar seu crescimento.
MEDICAMENTOS	São produtos elaborados e pesquisados, manipulados por farmácias de manipulação ou indústrias farmacêuticas e obedecem as especificações da Anvisa.
METABÓLITO 	Produto do metabolismo de uma determinada molécula ou substância.
MICROBIOTA	É definido como um grupo de microrganismos que habitam em determinado ambiente. 
PATÓGENO			Agente capaz de causar doenças. 
PATOLOGIA	 Estudo das doenças (deriva do grego: pathos, que significa doença, e logos, que significa estudo).
PIOGÊNICO 	 		Capazes de gerar, formar ou produzir pus. 
PRIMORDIAL 	Aquilo que é importante ou o mais importante; principal, básico, essencial.
PROFILÁTICO 		Se refere à profilaxia, à prevenção de doenças.
REMÉDIO	No geral são de origem caseira, considerados métodos ou cuidados terapêuticos que ajudam a aliviar desconfortos. 
PRECIPITAÇÃO	Reação química da qual resulta um produto separado do líquido onde se encontrava dissolvido, em forma de sedimento.
INTRODUÇÃO
Nos países mais pobres as doenças estão fortemente relacionadas com a falta de saneamento básico, desnutrição e dificuldade de acesso aos medicamentos. Neste contexto e decorrente do uso etnomedicinal, a fitoterapia é amplamente praticada. Entre as plantas medicinais mais utilizadas pela população poucas têm ação comprovada. Contudo, o uso popular tradicionalmente consolidado tem sido utilizado como guia para pesquisas farmacológicas.
Várias patologias que afetam a saúde pública são de origem microbiana e sobretudo proveniente de bactérias. Portanto, para reduzir doenças e danos causados por conta desses microrganismos patogênicos, o uso de meios naturais que possuem compostos antimicrobianos é um modo conveniente para controlar a presença desse espécime causador de males. Diversos vegetais, frutos e plantas têm sido utilizados com fins profiláticos. Este tipo de terapia alternativa vem sido procurada para o combate à enfermidades, visto que é um procedimento com custo muita das vezes inferior e consequentemente, mais acessível à população, tais fatores vêm colaborando no desenvolvimento de práticas de saúde que utilizam esse modo de tratamento. 
Dentre os frutos com potencial medicinal está a Punica granatum L. (romã). O extrato da casca da Púnica Granatum L. é rico em polifenóis, os quais têm apresentado um forte efeito de atividade antibacteriana contra gram-negativas e gram-positivas. Destarte, esse fruto foi selecionado para a elaboração deste estudo com o intuito de verificarmos sua efetividade. As bactérias patógenas escolhidas para este trabalho foram a Escherichia Coli (gram- negativa) que pode provocar doenças, como: infecções urinárias, diarreia, colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica e a Staphylococcus Aureus (gram-positiva) que pode ocasionar: furúnculos, septicemias (sepse), endocardites e abscessos.
JUSTIFICATIVA
O primordial encorajamento para sustentar o projeto de pesquisa, reside na importância que o tema possui para a sociedade, visto que pode ser considerado essencial para o aprofundamento de novas pesquisas aprimorando os hodiernos métodos curativos. É notório que embora a inclusão social em diversos âmbitos esteja se desenvolvendo, ainda há uma parcela da população que não possui acessibilidade a medicamentos, portanto, a utilização de remédios obtidos por meio de frutos tais como a romã, possui uma ampla importância para a inclusão de todos indivíduos nessa esfera tão importante que é o tratamento de enfermidades.
3.0. PÚNICA GRANATUM L. 
Romã (Púnica granatum, L.) é um fruto da romãzeira, sua importância é milenar, ela aparece nos textos bíblicos e os gregos a consideravam como símbolo do amor e da fecundidade, é uma fruta originária da região do Oriente Médio, depois foi levada pelos fenícios para o Mediterrâneo, região de onde se difundiu para as Américas, chegando ao Brasil pelas mãos dos portugueses. A romãzeira é um arbusto (ou pequena árvore) de 2 a 5 metros de altura, por vezes espinhoso, com ramos e casca castanha acinzentada que apresenta boa aptidão de produção em regiões áridas e semiáridas do mundo, os frutos são esféricos, com casca coriácea e a produção se dá no período de setembro a fevereiro. Existem dois tipos de romãs: romã amarela possui uma grande quantidade de sementes e um pequeno mesocarpo (parte carnosa). Já a vermelha possui um pequeno número de sementes e uma grossa camada carnosa. O suco da romã apresenta em sua composição compostos fenólicos como: antocianinas (delfinidina, cianidina e pelargonidina), quercetina, ácidos fenólicos (caféico, catequínico, clorogênico, orto e para- cumárico, elágico, gálico e quínico) e taninos (punicalagina). 
3.1. AUTOCIANINA 
É um composto da família dos flavonoides e constitui um grupo de pigmentos responsáveis por grande parte das cores em flores, frutas, raízes, etc. São compostos solúveis em água e sensíveis ao calor. Além de atribuir coloração característica aos vegetais, a antocianina apresenta em sua composição propriedades antioxidantes.
3.2. QUERCETINA
É um flavonoide antioxidante, que está presente nos alimentos na forma de glicosídeo, pode ser verificado nos vegetais,frutas e sucos. Dentre as propriedades terapêuticas destaca-se o potencial antioxidante desse composto.
3.3. ÁCIDOS FENÓLICOS
Os ácidos fenólicos constituem o grupo dos fenólicos. A presença dos compostos fenólicos tem sido muito estudada por apresentarem atividades farmacológicas.
3.4. TANINOS
A palavra tanino é largamente usada, particularmente em literatura botânica, originalmente derivada do termo “tanante”. Os taninos são amplamente distribuídos dentro do reino vegetal sendo comum tanto em espécies gimnospermas como angiosperma. Geralmente, a maior concentração de taninos ocorre em partes que são atacadas por insetos, como as folhas e os frutos; sendo separados respectivamente de acordo com sua composição química podendo ser hidrolisáveisou condensados. 
(1) Taninos Hidrolisáveis que apresentam em sua estrutura básica, moléculas de ácido gálico (galotaninos) conectados em açúcares (D-glicopiranose) esterificadas com moléculas de ácido gálico, encontrados em abundância em folhas e frutos.
(2) Taninos Condensados possuem uma estrutura “polimérica” formados pela policondensação de duas ou mais unidades flavan-3-ol e flavan 3,4-diol essa classe também pode ser denominada proantocianidinas. 
Os taninos são considerados como metabólitos secundários e são compostos fenólicos possuindo a habilidade de formar complexos insolúveis em água com proteínas, gelatinas e alcaloides. Por serem fenólicos, os taninos são muito reativos quimicamente, formam pontes de hidrogênio, intra e intermoleculares um mol de taninos pode ligar-se a doze moles de proteínas; fundamentando-se nessa propriedade pode-se identificar taninos por teste de precipitação de gelatinas.
4.0. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
O Staphylococcus Aureus é uma bactéria esférica, são cocos Gram-positivos com aproximadamente 0,5 a 1,5 µm de diâmetro, imóveis, não-esporulados e geralmente não-encapsulados, frequentemente encontrada na pele e nas fossas nasais de pessoas saudáveis. Entretanto pode provocar diversas doenças piogenicas que causam abscessos onde vão desde uma simples infecção (espinhas, furúnculos e celulites) até infecções graves (intoxicação alimentar, pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico e outras). Destaca-se principalmente por ser produtora de coagulase (enzima que provoca a coagulação do plasma por ativar a protrombina). 
5.0. ESCHERICHIA E. COLI
E. Coli é uma bactéria Gram negativa da família Enterobacteriaceae, cuja espécie mais pesquisada mundialmente é a E. Coli, devido à sua importância para a saúde pública e à sua recorrência em doenças entéricas (doenças relacionadas ao intestino). É uma bactéria não esporulada, anaeróbica facultativa, fermentativa, em sua maioria móveis (flagelo peretríqueos) e pertence a microbiota entérica de mamíferos e aves abundante no cólon e nas fezes. Em meios de nutrientes sólidos as unidades formadoras de colônias (UFC) apresentam cerca de 1 a 3mm de diâmetro tanto com aspecto rugoso quanto liso, no entanto podem existir colônias intermediárias e mucóides. Colônias rugosas têm aspecto grosseiro e contornos irregulares, já as colônias lisas são convexas, brilhantes e com bordas regulares. A E. Coli possui três antígenos utilizados para identificar o organismo em investigações epidemiológicas; o antígeno O (somático), H (flagelar) e K (capsular) e é a principal causadora de infecções trato urinário, infecções sistêmicas e infecções no trato intestinal.
6.0. METODOLOGIA
6.1. COLETA E IDENTIFICAÇÃO DA PLANTA
As amostras da romã foram colhidas da localidade de Extrema-MG, e a confirmação da sua identidade foi realizada através da literatura especializada. O espécime utilizado (composto pelo epicarpo-casca, mesocarpo-mesófilo e endocarpo-epiderme interna), devem ser higienizadas por 15 minutos em solução de hipoclorito de sódio a 20 ppm. e enxaguadas com água destilada com a finalidade de reduzir a carga microbiana e de remover as sujidades, após separarão o fruto da casca e em um vidro de relógio serão pesadas na balança semi-analitica.
A epiderme externa após a separação com o mesófilo, deverá ser pesada e introduzida a estufa a 40°C para a secagem e desidratação completa. Depois a cada 1h devem ser realizadas novas pesagens, tendo a noção do teor de água intrínseco ao fruto, além de avaliar sua concentração ao extrato que se formará. Esse procedimento deve ser realizado até que não haja mais oscilação no peso da epiderme sinalizando que o fruto esta inteiramente desidratado.
 6.2. PRODUÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO
Para a preparação foi utilizado 10 gramas da casca já em pó no sistema quente/frio fechado Soxhlet, onde pequenos cristais foram adicionados juntos ao álcool (100mL) 92,8% (c/v) no balão de vidro, em cima do calentador/manta aquecedora. Já no dedal (tubo extrator), colocou-se uma camada de algodão seguida da matéria pulverizada e outra camada de algodão. Por fim, ligou-se a mangueira no tubo condensador para manter a constância do fluxo de água.
O processo realizado no sistema é o aquecimento constante no balão em aproximadamente 70°C, pela manta, ocasionando a evaporação do solvente que se move na fase gasosa em direção ao condensador, ao entrar em contato com a água, ocorre o resfriamento, ocasionando na conversão do líquido que goteja no cartucho.
6.3. TESTES DE IDENTIFICAÇÃO 
Foram realizados dois tipos de testes químicos com o intuito de identificação dos taninos, grupo funcional responsável pela maior parte da ação antimicrobiana do extrato.
6.3.1 GELATINA
Tem o objetivo de verificar a presença ou ausência de taninos na matéria-prima vegetal. Foi gotejado, utilizando a pipeta de Pasteur, duas gotas de ácido clorídrico (HCl) em 10mL (v/v) do extrato da romã, reservado em um tubo de ensaio. Após o poupamento da vidraria, foi feito uma gelatina (p/v) onde foram dissolvidos 1,25g de gelatina em 50ml de água. Posteriormente aos preparos individuais, foi adicionado, de maneira gota a gota, a solução de gelatina no extrato, levando em consideração que se ocorresse a precipitação, era o indício de que haveria-se o grupo funcional em questão. O resultado do teste foi a presença de taninos, analisados pela formação da precipitação na parte inferior do tubo.
6.3.2. CLORETO FÉRRICO
Tem o objetivo de classificar o tanino em relação a sua natureza. Para que fosse executado, foi triturado, manuseando com o graal e pistilo, uma pedra de cloreto férrico (PA), e em seguida pesados, em um vidro de relógio, 0,1g da substância, e em seguida diluído em 10mL de metanol (v/v). Para que fosse decorrido o processo, foi-se levado em consideração que a cor azul significava os taninos hidrolisáveis ou gálico, e a verde taninos condensados ou catéquico. Ao ser adicionado a solução férrica com o extrato, observou-se uma camada muito escura no nível superior do tubo, então em outra vidraria foi adicionado para observar melhor a cor em questão. O resultado foi a presença de taninos condensados, analisado pela coloração verde escura.
6.4. MEIO DE CULTURA
Para o cultivo das bactérias foi efetuado posteriormente ao preparo do Ágar Mueller Hilton, o controle de qualidade visual adotando as seguintes etapas:
(1) Aparência Desidratado: Pó é homogêneo, fluxo livre e bege. 
(2) Aparência Preparado: O meio preparado é translúcido e amarelo claro a médio. 
(3) Resposta Esperada de Cultivo: Preparo, inóculo e coloque os discos de papel filtro umedecido de acordo com o procedimento descrito pela CLSI (Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais). 1,8,9 As culturas listadas devem ter o diâmetro da zona média do tamanho da concentração testada.
(4) Após serem analisados os devidos critérios, foram executados os seguintes métodos:
· Aquecimento dos materiais em autoclave em 121°C durante 2h para garantir a esterilização.
· Suspensão de 38 g do meio em 1 litro de água purificada ou destilada.
· Aquecimento, agitação frequentemente e fervura por 1 minuto para a dissolução do completamente ao meio.
· Autoclave a 121°C por 15 minutos. Resfriamento até atingir a temperatura ambiente.
· O Ágar Mueller Hinton preparado deve ter pH final de 7,3 ± 0,1 a 25°C.
Para a inoculação da Escherichia Coli, foi utilizado o método de estriamento:
(1) Consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra. Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal desta técnica de semeadura é a obtenção do isolamento bacteriano.
 Parao preparo da Staphylococcus Aureus foi utilizado a técnica por esgotamento:
(2) Colocaram uma alíquota de água destilada numa lâmina com alça em anel. Semear o material ou a cultura microbiana com auxílio de uma alça de níquel cromo, fazendo sequências de estrias na superfície do meio de cultura da placa de Petri (Esgotamento Inicial). Fazer sequências de estrias de modo a obter o esgotamento do inoculo da alça (estrias do bordo para o centro da placa) e consequentemente permitir que os microrganismos se desenvolvam formando colônias isoladas. A flambagem da alça é realizada antes de entrar na estufa bacteriológica, e pós coleta na superfície da lâmina, levando em consideração que entre cada sequência de estrias aumenta a probabilidade de obtenção de colônias isoladas.
Independente do inóculo, para analisar a eficácia do tanino foi submetida a suposição do filtro de papel umedecido em diferentes concentrações do extrato pré estufagem, analisando a formação de halos inibitórios.
6.5. AUTOCLAVE - CUIDADOS NA ESTERILIZAÇÃO EM VAPOR SOB PRESSÃO 
(1) Cobrir as tampas dos frascos com papel alumínio ou papel Kraft e prender para proteção contra recontaminação e evaporação durante a estocagem posterior.
(2) Afrouxar as tampas dos frascos e tubos com tampa de rosca, para permitir a entrada do vapor.
(3) Não encher demasiadamente a autoclave a autoclave, para não interferir na exaustão de ar e entrada do vapor.
(4) Manter entre os frascos uma distância mínima de meia polegada (1,27 cm), em todas as direções.
(5) Não esterilizar frascos com volume de meio maior do que 3% e a 4% da capacidade da autoclave.
(6) A esterilização pelo calor úmido deve ser feita em autoclaves a vapor saturado, operando com o binômio tempo/temperatura de 121°C, mas o tempo de subida não deve ultrapassar dez minutos, a partir do início da exaustão de ar.
7.0. PLANEJAMENTO
	Planejamento
	 
	
	Projeto
	Introdução
	Desenvolvimento
	Testes
	Apresentação
	 
	Legenda
	20/mar
	23/mar
	-
	Ok
	-
	 
	Inicio
	Entregar para o Felipe 02/04
	17/abr
	22/abr
	-
	-
	 
	Término
	
	-
	-
	Verificar a ação dos taninos nas cepas mai/jun
	-
	 
	Datas pré marcadas
	-
	-
	1° versão
	-
	Prévia 15/10
	 
	Perguntar p/ o Felipe 
	-
	-
	2°versão
	-
	Prévia 29/10
	 
	
	-
	-
	3° versão 
	-
	Prévia 12/11
	 
	
	-
	-
	Final 22/10
	-
	Final
	
	
8.0. REFERÊNCIAS
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. (2004) Módulo IV Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos. Ed. 2004.
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