Aula+02_Metodologias+moleculares+de+análise+do+DNA+seção+1 3+(2021)

Prévia do material em texto

METODOLOGIAS MOLECULARES 
DE ANÁLISE DO DNA
Prof.ª: Lilian Medina
Email: lilian.medina@kroton.com.br
INTRODUÇÃO 
 As técnicas de biologia molecular são aquelas que utilizam os ácidos nucleicos –
ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) – provenientes de
amostras biológicas como matéria-prima para a realização dos mais variados
procedimentos.
O material genético dos organismos está localizado no interior da célula, disperso no
citoplasma, no caso dos procariotos, ou no núcleo e em organelas específicas
(mitocôndrias e cloroplastos) nos eucariotos.
Para a realização das análises moleculares com eficiência é necessária a separação
dos ácidos nucleicos do restante dos constituintes das células, utilizando técnicas de
extração de DNA ou RNA.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
• Amplificação do número de cópias do DNA em bilhões de vezes 
• Reação enzimática de polimerização do DNA in vitro – utiliza DNA polimerase em 
1985.
• Material: 
– Amostra de DNA
– DNA polymerase
– Primer Forward e Reverse 
– Tampão da enzima 
– MgCl2 
– dNTP
(AUSUBEL, et al., 2003; WEAVER, 2001)
https://www.youtube.com/watch?v=ViCYwjzBZGs
https://www.youtube.com/watch?v=ViCYwjzBZGs
PROCEDIMENTOS
TERMOCICLADOR-EQUIPAMENTO
(AUSUBEL, et al., 2003; WEAVER, 2001)
APLICAÇÕES DO PCR
 Detecção de doenças hereditárias
Construção de árvores filogenéticas (árvores de
relação entre espécies)
Clonagem de genes
 Transplantes
 Testes de paternidade
 Exames para detecção de agentes patogênicos
 Genoma humano
//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a1/Pcr_gel.png
//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a1/Pcr_gel.png
Eletroforese
 Gel de agarose e poliacrilamida - descrita pela primeira vez pelo bioquímico Arne Tiselius, 
em 1937 com o prêmio Nobel em 1948.
 – Visualização do tamanho do DNA – Qualidade do DNA x degradação – Permite extração do 
DNA após purificação do gel.
(NASCIMENTO et al., 1999; SOUZA, 2003
FONTE: http://www.prolab.com.br/produtos/equipamentos-para-laboratorio/cubas-de-eletroforese
FONTE: 
https://www.researchgate.net/figure/Figura-8-Eletroforese-em-gel-de-poliacrilamida-15-com-SDS-
SDS-PAGE-em-amostras-de_fig3_51997847
• Separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um
determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial.
• Os fragmentos da amostra separam-se de acordo com a diferença de
potencial e tamanho dos fragmentos.
• As matrizes utilizadas são: poliacrilamida e agarose.
Eletroforese
EQUIPAMENTOS
EQUIPAMENTOS
A QUIMICA DA SÍNTESE DE DNA 
 Transcriptase reversa (RNA), seguida de PCR .
 RNA molde e DNA.
 A partir do RNA - cadeia de DNA
complementar (cDNA –PCR convencional).
 Ao cDNA aplica-se a técnica de RT-PCR.
RT-PCR
Produção de cDNA
Como o RNA é muito instável, é
interessante produzir cDNA (DNA
complementar) a partir do mRNA.
Utiliza a enzima Transcriptase
Reversa que é capaz de realizar a
síntese de DNA a partir de um
molde de RNA.
Santos, 2004
PCR Real Time
Método quantitativo baseado no PCR 
Análise da fase exponencial do PCR
Santos, 2004
Santos, 2004
Intercalante de DNA dupla fita
Fluoróforo em suspensão
Inespecífico
Curva de dissociação ou melting
Não permite multiplex
SYBR® Green
Sistema TaqMan®
Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease
Trabalha com sondas que contém fluoróforos
Específico
Permite Multiplex
Não necessita curva de dissociação
Sonda: Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia
R Q5’ 3’
R Q5’ 3’
R
Q
Q
Q
R
R
Aplicações
 Todas as aplicações da PCR tradicional
 Quantificação de carga viral
 Quantificação de expressão gênica
 Testes de eficiência terapêutica
 Detecção de agentes infecciosos
 Caracterização de agentes 
(Genotipagem)
Detecta um DNA específico em uma
mistura
Uso de sondas marcadas (de DNA ou
RNA, complementar a sequencia de
interesse) que hibridizam com o DNA
de interesse
Técnica desenvolvida pelo biólogo
Edwin Southern pelo qual recebeu
o Prémio Lasker de 2005.
(AUSUBEL et al., 2003; HARWOOD, 1996; WEAVER, 2001)
FONTE: http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture23.html
Enzimas de Restrição
Werner Abner: descobriu a enzima de restrição (“tesouras moleculares”)
Estudo com bacteriófagos → bactérias digeriam o DNA viral
 Hamilton Smith: Descreve mecanismo de ação das enzimas de restrição
O corte gera um par de extremidades coesivas idênticas e as enzimas clivam as mesmas
sequências em qualquer DNA
Daniel Nathans: primeiro a mostrar a aplicação tecnológica
Enzimas de restrição : são produzidas naturalmente por bactérias como
mecanismo de defesa à infecção de DNA viral
(Watson, et al., 2009).
O uso das enzimas de restrição e ligases
permitem a mistura de sequências de DNA de
espécies diferentes ou modificação de genes da
própria espécie, sendo este processo chamado
de Tecnologia do DNA Recombinante, que
constitui a chamada área da Engenharia
Genética.
(Watson, et al., 2009).
Enzimas de Restrição
Vetores
Molécula de DNA usada como veículo
para transportar artificialmente um
material genético exógeno para outra
célula, onde ele pode ser replicado e/ou
expresso.
Um vetor contendo o inserto de DNA
exógeno é chamado DNA recombinante.
(BROWN, 2003; MARANHÃO, 2003a).
FONTE: 
http://bioinfo.iq.ufrj.br/graduacao/EQ/teoria/aulas/bl2/08%20Isolamento%20e%20Manipula%C3%A7%C3%A3o%20de%2
0um%20gene.pdf
Clonagem de DNA
(BROWN, 2003; NASCIMENTO et al., 1999).
Sequenciamento de DNA
Obter a sequência de
nucleotídeos de uma
molécula de DNA – década de
70;
Síntese de cópia do DNA de
interesse utilizando-se
nucleotídeos modificados
(AUSUBEL et al., 2003; NASCIMENTO et al., 1999)
Sequenciamento de Sanger automatizado
(Watson et al., 2009).FONTE: https://pt.esdifferent.com/difference-between-genotyping-and-sequencing
FONTE: http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture23.html
Este conjunto de técnicas e
análises, construído ao longo das
últimas décadas, levou a novas
possibilidades de pesquisas,
aumentando o conhecimento sobre
a organização e a regulação
genética dos organismos e
propiciou avanços tecnológicos
importantes em diferentes áreas.
Bons estudos!