Relatório Solubilidade de Proteínas

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Relatório
Experimento Solubilidade de Proteínas e Desnaturação
Assunto: Proteínas
Ana Cristina Prado RGM: 17282136
Douglas Alencar RGM: 17889057
Gilberto Manoel da Silva RGM: 17236771
Pablo de Carvalho Luiz RGM: 17834929
Ricardo Cerqueira Silva RGM: 17543622
Rodrigo Encontrão RGM: 17629721
Robson Barbosa da Silva RGM: 18224857
Karoline Diniz RGM: 16151623
Abril 2019
Experimento Solubilidade de Proteínas e Desnaturação
Assunto: Proteínas
Introdução
Proteínas são macromoléculas formadas por moléculas menores denominadas de aminoácidos. Essas moléculas são produzidas em nossas células e desempenham funções fisiológicas e estruturais essenciais à vida dos seres vivos.
Entre as importantes funções das proteínas destacamos a defesa, pela ação dos anticorpos, o transporte de gases, realizado pela hemoglobina, a pele, as unhas e os cabelos, como queratina, a contração muscular, pela ação da actina e a miosina, os catalisadores, pela ação das enzimas etc. Existem vinte tipos de aminoácidos que podem participar da formação das proteínas, sendo classificados como naturais – aminoácidos produzidos pelo organismo e essenciais ingeridos na dieta. 
Cada proteína tem uma estrutura específica, o que conseqüentemente, determina a sua especificidade de ação. A sequência de aminoácidos formadores de uma proteína é determinada pelos genes formadores dos cromossomos, sendo que o enrolamento na forma de uma hélice, que pode ou não torcer sobre si mesma, é responsável pela variedade de proteínas existentes nos organismos dos seres vivos. 
Porém, as proteínas podem sofrer modificações na sua sequência de aminoácidos, decorrentes de mutações, alterações na forma por variações de temperatura ou pH, desnaturação, deixando de realizar suas funções normais. Por outro lado, algumas proteínas podem retomar a sua ação, a partir do momento em que o meio retorne às suas condições normais.
Dentre os diferentes tipos de proteínas destacam-se as enzimas, que são proteínas importantes no controle das reações que ocorrem no interior dos organismos vivos, sendo extremamente específicas, isto é, atuam somente sobre determinado composto e efetuam sempre o mesmo tipo de reação. 
As enzimas têm ação específica e podem sofrer alterações, quando submetidas a diferenças de temperatura e pH. Tais alterações são fatores desfavoráveis, que podem influenciar na atividade metabólica das enzimas.
Entre as diversas e importantes enzimas presentes nos seres vivos, a catalise, produzida nas organelas membranosas denominadas de peroxissomos, tem um importante papel na degradação de um subproduto tóxico, o peróxido de Hidrogênio, obtido da oxidação de certas substâncias orgânicas. 
A desintoxicação pelo peróxido de Hidrogênio e outras desintoxicações por substâncias tóxicas, que ocorrem dentro dos organismos, acontecem no fígado, órgão rico em peroxissomos. 
Desnaturação protéica: é a perda da estrutura tridimensional da proteína, ou seja, ela perde a sua forma original. Os fatores que alteram a estrutura de uma proteína podem ser diversificados incluindo alteração na temperatura e no pH do meio, ação de solventes orgânicos, agentes oxidantes e redutores e ate mesmo agitação imensa. São classificados em agentes físicos e agentes químicos.
Objetivo
Estudar a solubilidade das proteínas frente a agentes desnaturantes (calor) e força iônica. 
Material e reagentes.
· 1 Béquer de 100 ml
· 4 Tubos de ensaio
· 1 Estante para tubo de ensaio
· 1 bastão de vidro
· 1 bico de gás
· 1 Tela de amianto
· Conta gotas (próximo aos reagentes)
· 1 Pipeta de 5 ml
· Pipetas de 1, 2 e 5 ml (próximo aos reagentes)
· Solução de ovoalbumina a 1%
· Álcool etílico absoluto
· Sulfato de amônia
· Solução saturada de Sulfato de Amônia
· Ácido tricloro acético
Experimento 
1. Colocar aproximadamente 100 ml de solução de albumina em um béquer.
2. Transferir com uma pipeta 2 ml de solução de ovoalbumina 1% em 4 tubo de ensaio.
3. Ao final de cada um dos passos a seguir, observar e anotar os resultados:
4. Aquecer o tubo 1 em banho maria fervente durante 15 minutos.
5. Adicionar álcool etílico (1 a 3 ml) no tubo 1 após aquecimento.
6. No tubo 2, sem aquecimento, adicionar (1 a 3 ml) de álcool etílico observar e comparar com o resultado do tubo 1.
7. No tubo 3, adicionar cerca de (2 a 3 ml) de ácido tricloro acético e observa.
8. No tubo 4, adicionar a solução de Sulfato de amônia gota a gota, até a total precipitação da proteína.
9. Adicionar 2 ml da solução saturada de sulfato de amônia no tubo 4.
10. Adicionar 4 a 5 ml de água destilada no tubo 4 e observa.
Resultados e Discussões
Nesse experimento foi mostrado que as proteínas podem possuir estruturas primárias, secundárias, terciárias e quaternárias. Muitas das funções dessas proteínas estão ligadas diretamente às suas estruturas. No entanto, elas podem perder suas estruturas secundárias, terciárias e até quaternárias, e, consequentemente, deixarem de ser ativas.
Quando essas conformações espaciais são alteradas ou destruídas, dizemos que a proteína foi desnaturada ou ocorreu uma desnaturação proteica, mantendo somente a estrutura primária, que é a própria cadeia peptídica, formada pela sequência de aminoácidos ligados entre si, como mostramos nos resultados abaixo.
	
Tubo 1
	
 No tubo 1, adicionamos 2ml da solução de ovoalbumina, após 15 min em banho Maria á uma temperatura de 96,9°C. Com a formação de precipitado ligeiramente branco e turvo.
	
Tubo 2
	
 
 No tubo 2, adicionamos 2ml da solução de ovoalbumina, acrescentou-se 3mL álcool etílico.
 Observamos formação de 2 fases, onde podemos observa a molécula de proteína na divisão de fase.
Em comparação ao tubo 1 não obteve a separação de fase.
	
Tubo 3
	
No tubo 3, adicionamos 2 ml da solução de ovoalbumina e 3 ml de ácido tricloro acético, obsevamos uma amostra branca e leitosa com a formação de precipitado.
	
Tubo 4
Tubo 5
	
No tubo 4, adicionamos 2 ml da solução de ovoalbumina, acrescentou solução de Sulfato de amônia gota a gota, até a total precipitação da proteína e 2 ml da solução saturada de sulfato de amônia.
Com a formação de 3 fases Ácidos fortes precipitam as proteínas, por seus valores elevados de pH. 
	
	
Tubo 5, adicionamos 2 ml da solução de ovo albumina e 5 ml de Sulfato de amônia. 
Formação amostra decantada e ligeiramente branca.
Questionário e conclusões
1 - Explique detalhadamente as suas observações, de acordo com o procedimento executado; 
Tubo de ensaio número 1: Desnaturação por temperatura
Adicionada a solução de albumina no tubo de ensaio, a mesma foi levada a um banho-maria fervente com a água á temperatura de 93,5°C, por um período de aproximadamente 15 minutos. 
Ao ser retirada do aquecimento, observou-se que a solução de albumina adquiriu um precipitado branco em sua composição, apresentando também uma coloração levemente amarelada e de aspecto ligeiramente turvo podendo-se assim constatar a desnaturação da proteína pela temperatura.
Tubo de ensaio número 2: Desnaturação por produto orgânico
No tubo de ensaio de número 2 com a solução de albumina, adicionou-se o álcool etílico e comparando com o tubo 1, nesse procedimento observou-se que houve separação de fases, apresentando a fase inferior da mistura uma coloração ligeiramente turva, a fase superior mantendo uma coloração translúcida e com a formação de um fio (anel) esbranquiçado separando ambas as fases, constatando-se assim a desnaturação da proteína por adição de produto orgânico.
Tubo de ensaio número 3: Desnaturação por alteração de pH
Após adicionada a solução de albumina no tubo de ensaio de número 3, adicionou-se o ácido tricloroacético e observou-se.
Após a adição do ácido tricloroacético, a mistura apresentou uma coloração esbranquiçada de aspecto turvo/leitoso. Constatou-se a desnaturação da proteína por alteração de pH.
Tubo de ensaio número 4: Desnaturação por alteração de pH
Após a adicionadaa solução de albumina no tubo de ensaio, adicionou-se de sulfato de amônia gota a gota até a sua precipitação e observou-se.
Após a adição do sulfato de amônia, a mistura apresentou separação em 3 fases: a fase inferior apresentando coloração levemente amarelada com aspecto translúcido, a fase do meio apresentando coloração esbranquiçada/turva e por fim, a fase superior apresentando coloração um pouco mais translúcida com leve precipitação. Constatou-se a desnaturação da proteína por alteração de pH.
Tubo de ensaio número 5: Desnaturação por concentração salina
Após adicionada a solução de albumina no tubo de ensaio número 5, adicionou-se uma solução de Sulfato de amônia e observou-se.
Após a adição da solução de Sulfato de amônia, a mistura apresentou aspecto translúcido, porém observou-se que ocorreu uma leve coagulação, apresentando a mistura uma separação de minúsculos flocos apenas vistos a olho nu. Constatou-se a desnaturação da proteína por concentração salina.
2 - Explique como se pode precipitar as proteínas. 
Precipitação por sais de metais pesados e por ácidos fortes
      Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do (pI), a carga líquida sobre a proteína é negativa, favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. 
 A precipitação abaixo do ponto isoelétrico pode ser feita, através da adição de ácidos fortes, quando a proteína está abaixo do seu (pI), a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o fosfotunguístico e pírico.
Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações do pH.
Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica)
      Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da força iônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre elas. Consequentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso
Precipitação por ação do calor (desnaturação)
      As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bem definida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, que causa desorganização das cadeias peptídicas, com consequente alteração conformal. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária.
      A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da proteína, levando à sua precipitação. Essa precipitação é máxima no ponto isoelétrico da proteína e pode sofrer alterações pela adição de sais.
Precipitação das proteínas por solventes orgânicos
      A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica.      
 A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação proteica.
3 - O que é salting out / salting in? 
Concentração aumentada de sal “Salting out” insolúvel. Tira água de solvatação, aumenta interação proteína-proteína (proteína- fica insolúvel)
Salting out: é a precipitação de proteína em solução por altas concentrações de sais. Os sais atraem as moléculas de água do meio, de modo a ficar menos água disponível para as moléculas proteicas o que acarreta na diminuição da solubilidade e precipitação. 
Concentração reduzida de sal “Salting in” – solúvel. Diminui interação proteína-proteína (proteína- fica solúvel)
Salting in: é o aumento da solubilidade de proteínas devido ao acréscimo de baixas concentrações de sais em solução. Os íons salinos interagem com as cargas iônicas das proteínas aumentando assim o número efetivo de cargas e a quantidade de moléculas de água fixadas à ionosfera proteica. 
4 - Cite três agentes desnaturantes.
Solventes orgânicos, pH e temperatura.
5 - Dê um exemplo de processo de desnaturação que ocorre no nosso dia a dia. 
Desnaturação é um processo que se dá em moléculas biológicas, principalmente nas proteínas, expostas a condições diferentes àquelas em que foram produzidas, como variações de temperatura, mudanças de pH, força iônica, entre outras. A desnaturação ocorre quando a proteína perde sua estrutura secundária e/ou terciária, ou seja, o arranjo tridimensional da cadeia polipeptídica é rompido, fazendo com que, quase sempre, perca sua atividade biológica característica.
Dois exemplos simples de desnaturação ocorrem:
Ao pingar gotas de limão no leite, o pH é alterado, causando a desnaturação das proteínas, que se precipitam na forma de coalho.
Ao cozinhar um ovo. O calor modifica irreversivelmente a clara, que é formada pela proteína albumina e água.
6 - Explique as forças que mantém a estrutura de uma proteína. 
Pontes de Hidrogênio: É também chamada de ligação de hidrogênio e ocorre quando o hidrogênio (H) se liga a um elemento eletronegativo, que podem ser oxigênio (O), nitrogênio (N) e o flúor (F) sendo esses os principais elementos encontrados.
Interações iônicas: Ocorre entre íons positivos que são os cátions e negativos que são os ânions, decorrendo em razão da força de atração eletrostática que existe ente eles.
Interações hidrofóbicas: É a interação molecular onde compostos apolares sofrem consequências das ações dinâmicas de compostos que são polares.
Interações de Van der Waals: É a soma de todas as forças atrativas ou repulsivas, que não sejam forças devidas a ligações covalentes entre moléculas ou forças devido á interação eletrostática de íons.
Ponte dissulfeto: Essas ligações formam-se entre os átomos de enxofre de dois resíduos de cisteína. Essa ligação é resultado da oxidação dos grupos sulfidrilo das cisteínas, resultando numa ligação covalente entre os átomos de enxofre. As pontes de dissulfeto fazem com que a proteína adquira formas específicas sendo assim ligações fracas.
7 - O que é enovelamento? 
Enovelamento: é quando a função de uma proteína está essencialmente relacionada ás conformações especiais que ala adota em solução aquosa, na forma funcional (dita nativa), essas conformações flutuam levemente em torno de um mínimo de energia livre, o processo pode também ser descrito como automontagem intramolecular, onde a molécula é dirigida para adquirir uma conformação especifica através de interações não covalentes, tais como ligação de Hidrogênio, coordenação de metal, forças hidrofóbicas, forças de Van Der Waals ou efeitos eletrostáticos.
8 - Explique as diferenças entre estrutura primária, secundária, terciária e quaternária de proteínas.
Estrutura primária: é a cadeia de aminoácidos formados pela ligação peptídica. Esse tipo de ligação ocorre sempre por meio da reação entre o grupo amina de um aminoácido e o grupo carboxila do outro. E é essa estrutura que vai determinar as demais estruturas.
Estrutura secundária: Resultante de ligações de hidrogênio que ocorrem entre o Hidrogênio do grupo – NH e o Oxigênio do grupo C ═ O. Assim, formam-se estruturas como as mostradas a seguir, que são parecidas com uma mola é como se ela estivesse enrolada entre si, mantidas pelas ligações de Hidrogênio.Estrutura terciária: Ocorrem quando as estruturas secundárias das proteínas se dobram sobre si mesmas formando um enovelado, elas dão origem a uma disposição espacial. Ela ocorre geralmente como resultado de ligações de enxofre, conhecidas como pontes dissulfetos. Mas podem ocorrer outras ligações espaciais também, como as realizadas por átomos de metais.
Estrutura quaternária: É a união de várias estruturas terciárias que assumem formas espaciais bem definidas. É o caso da hemoglobina que se une a quatro estruturas terciárias que estão unidas entre si.
Bibliografia
proteicolando.blogspot.com/2015/10/estruturas-das-proteinas.html?m=1
www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/...proteinas/precipitacao_proteinas.htm
https://prezi.com/fg3zx8shdtc3/enovelamento-de-proteinas/
http://lmdm.biof.ufrj.br/divulgacao/videos/enovelamento.html
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/quimica_vida/quimica7.php
http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:wHhW2XbMzugJ:www.unicamp.br/unicamp/unicamp_hoje/ju/marco2008/ju390pag06.html+&cd=1&hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br
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