Aula Ida PCR

Prévia do material em texto

Reação em Cadeia Da Polimerase (PCR)
Vinicius Ribeiro Flores
PPGBIOTEC INMETRO
DOUTORADO
Relembrando...
Relembrando...
Mas para qual finalidade?!
PCR!!!!
PCR
	 	 	
 A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método para amplificação “in vitro” de segmentos de DNA.
 	 	
 Esta técnica é baseada num processo cíclico que mimetiza a replicação do DNA, “in vitro” uma vez que o número de moléculas de DNA duplica após cada ciclo
PCR
Histórico
1985 -> Primeira publicação;
Cetus Corporation - R. Saki; F. Faloona;
G. Horn; H. Erlichand; N. Arhneim; K. Mullis.
Prêmio Nobel de Química 1993
PCR - O que precisa?
Adenina Timina 
Citosina Guanina
5’
5’
3’
3’
Como isso Ocorre?
Adenina Timina 
Citosina Guanina
5’
3’
5’
3’
25°C
Como isso Ocorre?
25°C
94°C
Desnaturação
Reagentes PCR
Tampão
Íons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros)
Detergentes (Tween 20, Triton X-100)
 Proteínas estabilizantes (BSA)
Substâncias que agem na denaturação da cadeia molde de DNA ( DTT = Dithiothreitol, β - mercaptanoethanol)
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Pequena sequência de DNA (entre 15-30 pb) complementar ao DNA molde sintetizada a fim de indicar o ponto de início de replicação do DNA na técnica de PCR. 
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Complementar a seqüência do DNA molde
15 a 30 pares de base
Normalmente sense e antisense/ Foward e reverse 
Atenção com DESNATURAÇÃO!
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Adenina Timina 
Citosina Guanina
5’
3’
5’
3’
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
Primers/Iniciadores/oligonucleotídeos
DNTP’s
DNTP’s
(dTTP, dGTP, dCTP, dATP) 
dNTP Mix
Atenção com a CONCENTRAÇÃO
Como isso Ocorre?
5’
3’
5’
3’
94°C
??
Tm
Melting temperature (Tm)
Temperatura onde o DNA se desassocia de dupla fita hélice para fita simples.
Todo primer possui uma Tm específica.
O percentual de C-G interfere nesta temperatura.
Melting temperature (Tm)
Melting temperature (Tm)
Como isso Ocorre?
25°C
94°C
40°C - 60°C
Anelamento
Enzima DNA polimerase
Enzima que possui a habilidade de inserir dNTP’s no DNA molde com o objetivo de sintetizar uma fita de DNA nova complementar. 
Enzima DNA polimerase
DNA polimerase I, que tem função corretora(de reparo do DNA), portanto pode ser endonucleásica ou exonucleásica. Ela também faz a retirada dos primers (iniciadores).
DNA polimerase II, que é uma polimerase alternativa de reparo, mas que também pode replicar DNA quando o filamento molde é danificado.
DNA polimerase III, responsável por não deixar o molde antes de ter sido concluído o processo.
Como isso Ocorre?
25°C
94°C
40°C - 60°C
Qual a temperatura ótima da DNA polimerase?
30°C - 36°C
Extensão
Taq polimerase
Thermus aquaticus (Taq) - 1969
Início dos estudos de Pcr com Taq polimerase - 1985
Patente da enzima TaqPolimerase - (1990)
Taq polimerase
Estável até 117°C
Síntese na direção 5’ - 3’
Íon Mg++ cofator da enzima
Não possui atividade corretiva
Como isso Ocorre?
25°C
94°C
40°C - 60°C
Qual a temperatura ótima da Taq polimerase?
72°C
Extensão
= 1 Ciclo
Como isso Ocorre?
25°C
94°C
40°C - 60°C
Qual a temperatura ótima da Taq polimerase?
72°C
Extensão
25-35 vezes
 (ciclos)
Porque tantos ciclos?!?!
Eletroforese?!?!?
Eletroforese?!?!?
Eletroforese?!?!?
Eletroforese?!?!?
Eletroforese?!?!?
eletroforese
A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. 
As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa.
eletroforese
Agarose x Acrilamida
Agarose -> Usada para tamanhos de DNA entre 0,2 kb e 50 kb
Usado comumente nos laboratórios. 
Acrilamida -> Usada para moléculas pequenas (proteínas),
 DNA < 1kb
Acrilamida - Neurotóxica
Mais custosa e laboriosa!!!
Gel de Agarose
Os poros da malha são interferidos pela concentração da agarose
0,6% - 2,0% 
Gel de Agarose
gel de agarose
Marcador de Pares de bases
Gel de Agarose
0,6%
1,0%
2,0%
Gel de Agarose
Tampão TAE ou TBE 
Tampão de Amostra
Tampão de amostra -> Corante + Glicerol
Porque 0 dna migra para o pólo positivo????
Como enxergar o DNA?!
Brometo de Etídio 
Sybr Green
Intercalantes de DNA
Nossa! Quanto trabalho!!!
http://www.blizard.qmul.ac.uk/images/LabManagement/7500.jpg
real time pcr
Como funciona?
Capacidade de identificar e quantificar as fitas sintetizadas através de fluorescência emitida destas novas fitas. 
Probe (TaqMan)
Sybr Green
Probe
5’
3’
Adenina Timina 
Citosina Guanina
real time pcr
real time pcr
real time pcr
Precisão - quantitativo
Segurança 
Rápido
Alto custo