Imunologia Pratica - Teste de ELISA

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Julia Silva 
IMUNOLOGIA PRÁTICA - TESTE DE ELISA 
 
Teste de ELISA (ou teste de imunoensaio ou imunoensaio enzimático) é um 
teste de ligação primária onde não é observado o efeito 2º da ligação 
antígeno-anticorpo. A reação antígeno-anticorpo é observável, PORÉM ela não 
exerce nenhum efeito visível quanto a formação do imunocomplexo. 
Para analisar se o anticorpo estudado está presente ou não, é usado um 
conjugado que é um anticorpo quimicamente ligado a uma enzima peroxidase 
(o anticorpo na região FC está ligado a uma enzima). Quando o conjugado 
reage com o substrato, a enzima consome esse substrato e vira um produto 
que pode ser alguma coisa colorida ou um precipitado, entre outros, para 
permitir a visualização do conjugado. ​*​Quem permite a visualização é a enzima 
e não o anticorpo! 
Em geral, os testes de ELISA que acontecem em meio líquido geram um 
produto que altera o pH do meio e, consequentemente, muda a cor da reação. 
Ou seja, se ficar colorido significa que o conjugado está presente (​positivo​), se 
ficar incolor é ​negativo​. ​*​A enzima peroxidase reage com o peróxido (H​2​O​2​), 
quebrando-o e liberando H​2​O e O​2​. O ​O​2​ (íon) deixa o meio alcalino​. 
A reação em ​pH alcalino fica ​azul​. No final da reação, para parar a reação 
enzimática é adicionado um ácido que vai desnaturar a enzima fazendo com 
que ela pare de consumir o substrato. A reação em ​pH ácido fica ​amarelo​. 
Após a reação, lê-se no espectrofotômetro a intensidade de cor e a 
absorbância para saber a concentração daquilo que está sendo medido. 
A partir do conjugado é possível detectar qualquer coisa que se possa produzir 
um anticorpo contra qualquer microrganismo, patógeno, bactéria, entre outros. 
Ou seja, qualquer coisa capaz de gerar uma resposta imune contra ela para 
obtenção de anticorpos e liga-los com enzima, para detectar essas 
substâncias. 
Os conjugados detectam: 
▪ Drogas (na urina) 
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▪ Toxinas 
▪ Hormônios 
▪ Microrganismos 
▪ Anabolizantes 
Na medicina veterinária, o principal uso de ELISA é no diagnóstico de 
doenças infecciosas. 
METODOLOGIA: 
O eleitor de ELISA se lê por debaixo da solução. 
A primeira coisa a se fazer é colocar o ​diluente ​de ​amostra que é uma solução 
estabilizadora da reação com pH 7,2 (tampão fosfato). É pipetado 200 
microlitros de tampão fosfato em cada pocinho. Em seguida, é colocado o soro 
controle negativo e positivo. O soro controle negativo é um soro que não tem 
anticorpo anti-trypanosoma cruzi. É pipetado 10 microlitros de soro controle 
negativo no 1º pocinho. 
No 2º pocinho, é colocado 10 microlitros de soro controle positivo. No 3º 
pocinho em diante é colocado soro teste e feito uma diluição para observar que 
esse soro teste muda de cor de acordo com sua concentração. (Em cada 
pocinho é colocado uma solução que vai decrescendo à medida que vai 
avançando nos pocinhos: 20 microlitros, 10 microlitros, 5 microlitros, 2 
microlitros e 0 microlitros). 
A reação do soro com o antígeno presente na placa é marcada por 25 minutos 
a 37ºC. 
Tipos de ELISA: 
1. ELISA direta: ​detecta antígeno 
 
➢ Pega-se uma amostra com suspeita de parvovirose e extrai o 
extrato líquido. Nesse extrato líquido, se for positivo, conterá o 
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parvovírus. Isso vai para a placa com os pocinhos e depois para a 
estufa a 37ºC. 
 
➢ Se o resultado for positivo, o vírus estará presente na placa. (O 
plástico poliestireno tem afinidade com substâncias orgânicas, ex: 
proteína, por isso não pode ser reaproveitado, é sempre 
descartado​). 
 
➢ Na sequência, é adicionado um tampão com salina fosfatada e o 
anticorpo anti-parvovírus, e depois adiciona o conjugado. Se tiver 
o vírus na placa, o conjugado se liga no vírus. A placa é lavada 
para retirar o conjugado livre (aquele que não se ligou em 
nenhum anticorpo), retirando o sobrenadante. Essa lavagem é 
feita por 5x. 
 
➢ Se tiver vírus, o conjugado estará ligado com o antígeno. Caso 
contrário, será achado todo o conjugado livre. Com o conjugado 
ligado é adicionado o substrato onde a enzima peroxidase vai 
consumir o substrato e gerar uma cor. ​→ ​Se ficar colorido, a 
reação é positiva. 
 
➢ Quando a enzima consome o substrato todo, a cor permanece 
constante. Mesmo que a concentração de conjugado seja alta ou 
baixa, sempre consome todo o substrato. A concentração da 
enzima determina se a reação demora ou não. 
 
2. ELISA indireta: ​detecta​ ​anticorpo 
 
➢ Na placa contém o antígeno, é adicionado 250 microlitros de 
tampão, em seguida, é colocado o anticorpo. Se o soro der 
positivo para o ​trypanosoma​, vai se ligar. É lavado a placa para 
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eliminar o que não estiver ligado. Logo após é adicionado o 
conjugado anti-globulina (anticorpo anti-anticorpo), ou seja, o 
anticorpo do corpo contra o anticorpo do estudado. -Em seguida, 
é colocado o substrato e a enzima ao consumi-lo produzirá uma 
cor. Se tem cor, tem anticorpo, é ​positivo​. Incolor é negativo. 
 
OBS: A diferença entre ELISA direta e indireta é que, na direta se detecta 
antígeno e usa conjugado anti-antígeno. Já o indireto detecta anticorpo e usa o 
conjugado anti-anticorpo. 
 
3. ELISA sanduíche (imunocaptura): ​detecta​ ​antígeno 
 
➢ Na placa está presente o anticorpo e na amostra tem o antígeno, 
o conjugado é o mesmo anticorpo que está na placa só que com 
a enzima peroxidase. 
 
➢ A imunocaptura significa que o anticorpo que está na placa 
captura o antígeno que está na amostra, prendendo-o na placa. 
Em seguida, é colocado o conjugado para identificar a presença 
do antígeno. 
 
Qual a vantagem do ELISA sanduíche em relação a ELISA direta? R: A 
ELISA direta, é colocada a amostra na placa e seca, deixando tudo o que 
estava na amostra na placa. Mas se caso na amostra conter uma quantidade 
pequena, pode ser que a parte que fica grudada na placa não tenha o antígeno 
que está sendo procurado. No caso da ELISA indireta, o antígeno que estiver 
na amostra o anticorpo irá capturar, aumentando a sensibilidade do teste pois é 
possível detectar o antígeno mesmo em pequenas quantidades. 
O que amplifica a reação para ser observada mesmo com pouco 
antígeno? ​R: A enzima peroxidase, porque, enquanto houver substrato a 
enzima vai estar ativa. 
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4. ELISA por competição (ou competitivo): detecta anticorpo 
 
➢ O antígeno e o conjugado preenchem completamente todos os 
sítios de ligação do antígeno que está presente na placa. Porém, 
esse conjugado possui baixa afinidade que significa que se tiver o 
anticorpo contra esse antígeno, o anticorpo tira o conjugado do 
sítio de ligação para se ligar no lugar dele. Portanto, quanto mais 
anticorpo estiver na amostra, mais conjugado ele vai remover. 
 
➢ Resultado positivo: incolor/reação fraca. 
 
➢ O anticorpo é específico para o antígeno, sendo considerado de 
alta afinidade. Já o conjugado é de baixa afinidade. Com isso, o 
anticorpo da amostra tem mais avidez do que o conjugado. Então, 
o anticorpo da amostra irá competir com o conjugado pelo sítio de 
ligação com o antígeno, retirando o conjugadodo sítio de ligação 
e se colocando no lugar dele, deixando o conjugado livre. Quando 
lavar a placa, o conjugado livre sairá e a reação não possuirá cor. 
 
➢ Vantagem: alta sensibilidade, porque qualquer mudança de cor 
indica que o anticorpo removeu o conjugado do sítio. 
 
Qual a diferença na interpretação do resultado com o exame que detecta 
o antígeno para um exame que detecta um anticorpo? R: No exame que 
detecta antígeno, caso der positivo, indica que o antígeno está presente, logo o 
animal é ​portador da doença. Já no exame que detecta anticorpo, dependendo 
do tipo de anticorpo e da concentração ele pode já ter contraído a doença ou 
está com a doença. 
No teste de ELISA, a leitura do resultado é sempre fruto de uma reação 
enzimática. 
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A reação enzimática tem limitação em casos de concentrações extremamente 
baixas (abaixo de micrograma), podendo não ter sensibilidade suficiente para 
ser observado mudanças de cor em substâncias. 
A radioatividade pode emitir respostas detectáveis mesmo em concentrações 
baixas. Com isso, ao invés de colocarem o conjugado com enzima, colocaram 
com iodo radiativo (125) e inventaram o ​radioimunoensaio​. 
➢ Vantagem​: detecta tudo em concentrações extremamente baixas. 
Consegue detectar tanto anticorpo quanto antígeno. 
 
➢ Desvantagem​: devido a radiação, o ambiente deve ser equipado 
adequadamente e a radiação ao longo do tempo perde força, 
sendo necessário recalcular tudo devido à perca de energia. Lixo 
radioativo. 
 
➢ Caiu em desuso. 
Imunoensaio quimioluminescente (ou bioluminescência​): reação química que 
imita luz. Quando o composto reage com o conjugado, ele emite luz. Acabou 
substituindo o radioimunoensaio, com grandes vantagens: não tem 
decaimento, não tem lixo radioativo, pode ser feito em qualquer sala e possui 
alta sensibilidade, PORÉM, não é barato e não é possível ver a reação. 
Como na quimiluminescência não é possível observar, é utilizado 
fluorescência​. Então, o conjugado ao invés de radioativo, enzimático ou 
luminescente, ele é fluorescente. ​A substância fluorescente é aquela que 
quando incide radiação UV, ela emite luz. A mais comum é a fluoresceína. 
Um boi morreu numa fazenda com sintomatologia nervosa, o médico recolhe o 
cérebro, corta-o em 1cm², pega uma lâmina de microscópio e faz um imprint do 
cérebro na lâmina. Em seguida, fixa a lâmina usando o fogo e incube na lâmina 
um conjugado anti-virusrabico ligado com fluoresceína e fica 20 min sacudindo. 
20 min depois, retira e lava a lâmina com o tampão de lavagem e deixa secar. 
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Logo após secar, coloca a lâmina no microscópio de epifluorescência onde 
observa um imagem preta e, aonde tiver vírus rábico, vai apresentar luz verde. 
Imunocomb​: é um teste de ELISA indireto para diagnóstico de cinomose. Ele 
detecta anticorpos contra a cinomose. Era usado para identificar a janela 
imunológica materna dos filhotes se já estava na hora de vacinar. 
➢ Nesse exame, ao invés de fazer a reação na plaquinha com o meio 
líquido, os reagentes vêm em um estojo e o antígeno vem grudado num 
pente de plástico. Então era só furar o pocinho, pôr a amostra e o pente. 
 
➢ Tem 3 bolinhas, 1 bolinha é controle positivo e o outro é o teste. A 
intensidade de cor da bolinha é proporcional à concentração de 
anticorpo. 
 
➢ Vantagens​: pode usar tanto soro quanto sangue total. 
 
➢ Fica ​azul​, significa que tem anticorpo anti-cinomose. Para parar a ação 
da enzima coloca ácido e fica ​amarelo​. ​Em seguida, pega a placa, 
coloca no leitor de ELISA, o leitor emite um feixe de luz, lê a quantidade 
de luz absorvida na amostra e dá o resultado de absorbância. 
 
Qual a diferença entre o amarelo quase invisível para o amarelo mais 
perceptível? R: Todos os testes que são qualitativos são definidos nos pontos 
de corte. O ponto de corte é a absorbância que indica se o indivíduo é positivo 
ou negativo. Normalmente, o ponto de corte é informado pelo fabricante. 
 
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