Métodos biofísicos de análise

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1 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
 
 
 
 
 
 
Separação de partículas pela força centrífuga 
 
• Ultracentrifugação – 700.000 g a 
1.000.000 g 
 
• Modelos variam quanto: 
└ velocidade de centrifugação 
└ tamanho do equipamento 
└ tamanho e número de tubos de 
amostra 
└ controle de temperatura 
└ presença e ausência de vácuo 
└ automatização do processo 
 
Balanceamento das amostras 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Elementos de separação 
 
• Células 
• Organelas 
• Macromoléculas 
└ proteínas inteiras 
└ subunidades proteicas 
└ DNA 
└ RNA 
└ lipossomos 
 
 
 
Partículas precipitadas e sobrenadantes são 
definidas pela força centrífuga relativa (em 
g) e tempo de centrifugação 
 
Métodos biofísicos de análise 
CENTRIFUGAÇÃO 
 
2 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
Força centrífuga relativa ou Força G 
 
RCF = 
r𝜔2
g
 
 
• RCF (g) 
• r é o raio (m) 
• 𝜔 é a velocidade angular (radianos por 
segundo) 
• g é a força gravitacional (9.8 m.s-2) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RCF = 1,12 x R x (RPM/1000)2 
 
R – raio em milímetros 
 
Separação por centrifugação 
 
 
 
Centrifugação simples 
 
• Separação por peso 
 
 
 
• 3000g por 10 minutos 
 
Centrifugação diferencial 
 
• Sedimentação por tamanho e 
densidade 
 
 
 
• 2 fases 
└ precipitado (pellet) – partículas 
maiores e mais densas 
└ sobrenadante (fração líquida) – 
partículas menos densas 
 
• Aumento da velocidade e/ou tempo de 
centrifugação para isolar 
sobrenadante (pode ser repetido 
diversas vezes) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
rmax 
Força centrífuga Força centrípeta 
 
3 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
Centrifugação por gradiente 
de densidade 
 
 
 
• Amostra dissolvida em solução 
concentrada de substância densa e 
de rápida difusão (pequena massa 
molecular) 
└ centrifugação realizada em alta 
velocidade 
 
• Centrifugação isopícnica – 
separação de partículas de tamanho 
similar, mas densidades diferentes 
 
• Centrifugação zonal – separação de 
partículas com densidades similares e 
massas diferentes 
 
• Exemplos de substâncias: sacarose, 
CsCl, Cs2SO4 
 
 
 
 
 
 
 
Centrifugação com gradiente 
de densidade isopícnica 
 
 
 
• Formação de gradiente de 
densidade pelo soluto de baixa 
massa molecular, devido ao alto 
campo centrifugal 
└ componentes se posicionam em 
regiões onde sua densidade é igual à 
densidade da solução 
 
• Fracionamento ao final da 
centrifugação – separação dos 
componentes 
 
• Tempo de centrifugação não interfere 
└ partícula atinge seu ponto de 
equilíbrio e permanece na região 
 
• Exemplo: separação de ácidos 
nucleicos em gradiente de cloreto de 
césio (CsCl) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
Centrifugação com gradiente 
de densidade zonal 
 
 
 
• Amostra macromolecular colocado em 
solução com gradiente de densidade 
previamente preparada 
 
• Gradiente estabiliza as bandas e 
fornece um meio de densidade e 
viscosidade crescentes 
└ objetivo – permitir a passagem 
suave pelas zonas, diminuindo a 
mistura das soluções 
 
• Separação de macromoléculas com 
formas semelhantes com base em 
suas massas moleculares 
 
• Tempo interfere 
└ centrifugação interrompida assim 
que as partículas forem separadas 
 
• Exemplo de aplicação: isolamento de 
subunidades ribossomais em um 
gradiente de sacarose 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Centrifugação com 
extração líquido-líquido 
 
 
 
• Dois solventes imiscíveis, a água e um 
solvente orgânico (ex: fenol) 
 
• Fase de maior densidade embaixo 
(nem sempre a orgânica) 
 
• Os solutos (inicialmente na fase 
aquosa) após a extração estarão 
divididos entre as fases de acordo 
com suas propriedades de 
solubilidade 
 
• Exemplo de extração de separação de 
proteínas e ácidos nucleicos em uma 
solução de fenol e água 
└ fenol altamente tóxico