Eletroforese - Métodos biofísicos de análise

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1 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
 
 
 
 
 
 
Separação de moléculas baseado na 
migração em um gel quando expostas a um 
campo eletromagnético 
 
• Extremidade com polo positivo e 
extremidade com polo negativo 
• Separação por carga e tamanho 
(forma) 
• Muitas vezes ocorre apenas pelo 
tamanho e forma 
 
 
 
• Migram em velocidades diferentes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Cuba de eletroforese: onde o gel é 
preparado. 
└ vertical ou horizontal. 
 
• Fonte de eletroforese: fornece a 
corrente necessária para uma corrida 
uniforme 
 
• Solução tampão: permite a passagem 
da corrente 
 
• Gel: onde a biomolécula irá migrar 
 
• Canaletas: local de aplicação de 
amostras e marcadores 
Métodos biofísicos de análise 
ELETROFORESE ESTRUTURA DO APARATO 
 
2 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
• Ciência forense 
• Genética 
• Microbiologia 
• Bioquímica 
• Análises clínicas 
 
 
 
• DNA – carga líquida negativa 
• Gel de agarose 
• Corante brometo de etídio 
• Fragmentos maiores, maior 
intensidade 
• Fragmentos mais concentrados, 
maior intensidade 
• Fragmentos mais compactos migram 
mais rápido 
• Carga não influencia 
• Fragmentos menores migram mais 
rápido 
• Marcador de tamanho – número de 
pares de bases (bp), de modo a 
comparar os fragmentos da amostra 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Enzimas de restrição: clivagem de 
moléculas de DNA 
• Cromossomos – eletroforese em gel 
de campo pulsado 
 
 
 
 
 
• Semelhante à eletroforese de DNA 
• Gel desnaturante, devido estruturas 
secundárias que podem influenciar 
 
 
 
 
APLICAÇÕES 
ELETROFORESE DE DNA 
PLASMÍDEO SUPERCOILED x PLASMÍDEO 
CIRCULAR x PLASMÍDEO LINEAR 
ELETROFORESE DE DNA 
ELETROFORESE DE RNA 
SOUTHERN BLOT x NORTHERN BLOT 
 
3 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
 
 
• Proteínas, oligopeptídeos e 
aminoácidos possuem cargas variadas 
 
• Eletroforese direta 
• SDS-PAGE 
• Focalização isoelétrica 
• Eletroforese bidimensional 
• Western blot 
 
 
 
 
• Gel de poliacrilamida 
• Corante mais utilizado – Coomasie 
billiant blue 
└ outros: silver stain, SYPRO e 
Fluorescamine 
• Peso molecular em kilodaltons (kDa) 
• Tamanho, forma e carga líquida 
influenciam 
 
 
 
• SDS emulsificante (detergente) 
• Proteínas são desnaturadas 
• Separação por peso molecular 
 
 
 
 
Eletroforese direta 
• Proteínas íntegras 
• Mantém função 
• Carga da proteína 
• Separação por tamanho, forma e carga 
 
SDS-PAGE 
• Proteínas desnaturadas 
• Perda de função 
• Carga negativa 
• Separação por tamanho 
 
 
 
• Separação por pontos isoelétricos 
• Gel com gradiente de pH – migração do 
meio mais básico (negativo) para o 
meio mais ácido (positivo) 
• Anfólitos (eletrólitos anfotéricos) 
responsáveis pelo gradiente de pH 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS 
ELETROFORESE DIRETA 
SDS-PAGE 
ELETROFORESE DIRETA x SDS-PAGE 
FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA 
 
4 Rafaela Thais Mendes Sonntag I Biofísica Veterinária 
 
 
 
 
• Focalização isoelétrica verticalmente 
• SDS-PAGE horizontalmente 
• Separação por ponto isoelétrico e 
peso molecular 
 
 
 
 
 
• Immunoblot 
• Anticorpo específico para proteína 
 
1) Proteínas separadas por 
eletroforese são transferidas para 
membrana de nitrocelulose 
2) Sítios desocupados na 
nitrocelulose bloqueados com 
caseína 
3) Anticorpo adicionado 
4) Segundo anticorpo ligado a uma 
enzima é adicionado, 
especificidade para o primeiro 
anticorpo 
5) Precipitado colorido formado na 
banda contendo a enzima de 
interesse 
 
 
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 
WESTERN BLOT