AULA PRÁTICA 5

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AULA PRÁTICA 5 – PROVAS BIOQUÍMICAS
I. Introdução
Cada espécie de organismo apresenta um conjunto de características em comum. Quando se tem uma determinada amostra em um laboratório é de costume realizar determinados testes afim de reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para o diagnóstico. Esses testes são de extrema importância por isso, um teste mal executado pode prejudicar e até mesmo confundir todo o processo de identificação.
Existem alguns atributos próprios do microrganismo que são essenciais para a sua caracterização, são esses: a correta caracterização cultural do microrganismo e a execução e interpretação da coloração de Gram.
A verificação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias e/ou leveduras, através das transformações químicas que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo. Cada espécie de bactéria irá possuir um desempenho diferente em cada teste, no final o conjunto de resultados irá auxiliar na determinação da espécie em questão.
Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento.
Na realização da prática utilizou-se 5 provas bioquímicas para as bactérias que eram Gram negativas: utilização do citrato como única fonte de carbono, prova da motilidade, prova da produção de indol, teste do meio TSI, prova da lisina descarboxilase e prova da produção de urease.
A única prova bioquímica realizada para bactérias Gram positivas foi a produção de catalase.
Testes para bactérias Gram negativas:
· Utilização do citrato como única fonte de carbono: Alguns microrganismos não possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da célula não conseguindo, portanto crescer no meio contendo como única fonte de carbono, o citrato, embora possuam as enzimas intracelulares que degradam o citrato. A prova é feita semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilização pela enzima citrato liase (citrase ou citratase), resultando na formação de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato, há a formação de carbonatos que alcalinizam o meio de modo que a cor do indicador é alterada para azul. Na prova negativa o meio não se altera (continua verde), pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo, a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de nutrientes do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos.
· Prova da Motilidade: A prova da motilidade indica indiretamente a produção de flagelos, ou seja, verifica se a bactéria é móvel ou imóvel. Não é uma prova bioquímica, e sim fisiológica, mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada inoculando-se em linha reta, através da técnica de semeadura em profundidade, que utiliza uma agulha para inocular um determinado microrganismo, até cerca de 2/3 de um meio semi-sólido. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. A prova é negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem, contudo, turvar o meio. Geralmente utiliza-se o ágar semi-sólido (SIM) para a inoculação. Deve-se realizar o procedimento com agulha bacteriológica, fazendo uma picada central até 2/3 da profundidade do tubo. 
· Prova da lisina descarboxilase: A descarboxilação é a remoção de um grupo carboxila de uma molécula orgânica. As bactérias que crescem num meio líquido descarboxilam aminoácidos mais ativamente quando as condições são anaeróbias e ligeiramente ácidas. A descarboxilação de aminoácidos, como a lisina, resulta na produção de uma amina e de dióxido de carbono. As bactérias que produzem a enzima descarboxilase da lisina podem descarboxilar a lisina e usar as aminas como percursoras para a síntese de outras moléculas. Adicionalmente, quando certas bactérias fazem fermentação são produzidos produtos ácidos que tornam o meio ácido e, portanto hostil. Assim, muitas descarboxilases são ativadas por um pH baixo, pois ao remover os grupos ácidos dos aminoácidos produzem aminas que aumentam o pH do meio que fica mais adequado. A descarboxilação da lisina pode ser detectada semeando a bactéria num meio de cultura contendo esse aminoácido, glicose e um indicador de pH (púrpura de bromocresol). Antes da incubação deve ser colocado óleo mineral no caldo para impedir o oxigênio de atingir as bactérias e inibir a reação. Os ácidos produzidos pelas bactérias a partir da fermentação da glicose vão inicialmente baixar o pH do meio e causar a mudança de cor do indicador de pH de púrpura para amarelo. O pH ácido ativa então a enzima que causa descarboxilação da lisina a aminas e a subsequente neutralização do meio, que muda de amarelo para púrpura outra vez. 
O caldo lisina descarboxilase possui peptonas, extrato de levedura e glicose que favorecem o crescimento bacteriano. A fermentação da glicose abaixa o pH e este fica amarelo. Se ocorrer atividade da enzima lisina descarboxilase - LDC o pH aumentará, devido a transformação da lisina em uma amina primária: a cadaverina, e o meio voltará a apresentar uma coloração roxa. O meio com cor amarelada é prova negativa para a enzima lisina descarboxilase. O meio com tonalidade de roxo é prova positiva para a enzima lisina descarboxilase. Especialmente útil para diferenciar Salmonella spp. (positivas) de Proteus spp. (negativas); Enterobacter cloacae (negativa) de Klebsiella pneumoniae (positiva). A ativação da enzima LDC ocorre em pH ácido. Portanto, inicialmente a bactéria deve utilizar a glicose, produzindo ácidos, o que torna o meio amarelo. Em uma segunda etapa, se a bactéria produz a enzima LDC esta é ativada e promove a descarboxilação da lisina e conseqüente alcalinização do meio, retornando à cor original (púrpura) e indicando prova positiva. Caso a bactéria não produza esta enzima só ocorrerá a fermentação da glicose e o meio permanecerá amarelo, indicando prova negativa. 
· Prova da produção de Indol: O indol é resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase. A prova é realizada inoculando-se o microrganismo em um meio contendo excesso de triptofano. Após a incubação, deve-se colocar 0,5 mL (5 gotas) do reagente ou reativo de Kovacs ou o reativo de Ehrlich (solução aquosa ou alcoólica de p-dimetil aminobenzaldeído, respectivamente) através da parede interna do tubo. A prova é positiva quando na porção superior na interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rósea dentro de no máximo 5 minutos. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído em meio ácido, formando o composto colorido. A prova é negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom). O indol reage com o reagente, formando um composto colorido róseo. Geralmente utiliza-se o meio semi-sólido (SIM) para a inoculação. A produção de triptofanase leva a metabolização do triptofano, liberando indol, e este é revelado com o reativo de Kovacs, sendo possível a observação da formação de um anel rosa na superfície do meio.
· Prova da produção de uréase: A urease é uma enzima que degrada a ureia em duas moléculas de amônia e uma de anidrido carbônico (ureia => 2NH3 + CO2 + H2O). A prova consiste em transferir uma porção do crescimento bacteriano com uma alça para o meio contendo ureia, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. Após o crescimento, a prova é revelada positiva quando a urease ataca a ureia alcalinizando o meio, que toma a coloração rosa choque. O meio deve conterureia para que a verificação da produção da enzima urease seja realizada de forma adequada. Na prova negativa não há alteração da cor do meio. Os organismos do gênero Proteus são urease positivos diferentemente da maioria das enterobactérias. A inoculação é realizada a partir de uma cultura bacteriana em ágar que se deseja testar.
· Teste do meio TSI: O meio TSI (tríplice sugar and iron) fornece uma série de reações bioquímicas que dão uma visão geral do metabolismo bacteriano. Por esse motivo, vamos apresentar esse meio e as transformações que ocorrem. 
O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de tal maneira, que o mesmo deve apresentar uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. O meio é inoculado com agulha, por semeadura em profundidade na base e estrias na superfície. Após o crescimento da bactéria, pode-se observar os seguintes resultados: 
- A bactéria não fermenta qualquer dos açúcares, ficando inalterado o meio, ou até mesmo utiliza os aminoácidos metabolizando-os com produção de aminas que alcalinizam o meio; 
- A bactéria fermenta somente a glicose de tal forma que os ácidos formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a inclinação vermelha, por metabolização dos aminoácidos, alcalinizando a mesma e neutralizando a pequena quantidade de ácidos, pois a concentração de glicose é baixa - assim o resultado é expresso como K/A (inclinação alcalina e base ácida); 
- A bactéria fermenta a lactose ou a sacarose com mudança do indicador de todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinação permanecem ácidas, pois os álcalis produzidos na inclinação são facilmente neutralizados pela grande quantidade de ácidos produzidos na base, tendo em vista que a concentração desses açúcares é dez vezes maior que a da glicose - o resultado é expresso como A/A (inclinação e base ácidas). 
Neste último caso, existe a possibilidade de se detectar gases resultantes da degradação do ácido fórmico em hidrogênio e gás carbônico, se a bactéria possuir o sistema hidrogênio fórmico liase. Os gases são indicados ou visualizados indiretamente, por levantar ou fragmentar o meio, e o resultado é representado como A/A com gás. Há também a possibilidade da bactéria produzir H2S, por respirar anaerobiamente o tiossulfato - captando elétrons através da tiossulfato redutase, resultando em gás sulfídrico (sulfeto de hidrogênio) e sulfito. O sulfeto de hidrogênio, na presença de sais de ferro, forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolúvel - desta forma o resultado é dado como A/A com gás e H2S. 
Deste modo, pode-se observar em um único meio os processos fermentativos, respiração aeróbia e anaeróbia. A utilização dos açúcares e aminoácidos na inclinação se dá apenas por respiração aeróbia, enquanto que na base os processos são realizados por fermentação (incluindo também putrefação, quando da utilização dos aminoácidos básicos, sulfurados, triptofano, com produção de gás sulfídrico, mercaptanas, aminas, dentre outras). Já a utilização do tiossulfato ocorre por respiração anaeróbia, gerando também gás sulfídrico (sulfeto de hidrogênio). 
Teste para Gram positiva:
· Produção de catalase - A prova da catalase se destina a verificação da presença da enzima catalase. A prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, pois este possui catalase, levando a resultados falso positivos. Esta enzima atua sobre a água oxigenada (peróxido de hidrogênio 10 a 30%) desdobrando-a em oxigênio e água. A prova é feita colocando-se uma gota de solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 10-30% numa lâmina e, em seguida, com uma alça de platina, coloca-se uma porção do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando 0,5 mL da mesma solução a uma cultura em meio líquido ou em ágar inclinado. A prova é considerada positiva quando há borbulhamento ou efervescência devido à liberação do gás oxigênio. Na ausência de catalase, não há decomposição do peróxido. A catalase é produzida por muitos microrganismos, e é usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que são catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase positivos.
II. Objetivo
Realizar os testes de provas bioquímicas interpretando assim os seus resultados e suas transformações metabólicas. Perceber a importância dos testes para diferenciação das diferentes espécies de bactérias.
III. Aparelhagem e material utilizado
· Suspensões bacterianas e/ou colônias em meio sólido; 
· Meios de triagem - SIM, TSI, citrato, ureia; caldo lisina; 
· Reagente ou reativo de Kovacs; 
· Lamparina e/ou bico de Bunsen; 
· Fósforo; 
· Alça de platina e agulha; 
· Estante para tubos; 
· Tubos falcon; 
· Tubos de Durhan; 
· Caneta marcadora de retroprojetor; 
· Papel filme – PVC; 
· Estufa microbiológica. 
IV. Procedimento
· Inoculou-se as suspensões microbianas com agulha microbiológica em 5 tudo de triagem: TSI, SIM, Citrato, Ureia e Lisina. No meio SIM foram realizados tanto os testes de motilidade quanto o da prova da produção de indol. As suspensões foram inoculadas de forma diferente em cada tubo.
· Incubou-se os tubos na estufa biológica por 24 horas.
· Procedeu-se o teste da Catalase com a amostra-bactéria de número 7.
· Após o crescimento, interpretou-se os resultados observados e comparou-os com a tabela de identificação.
V. Resultados e discussões
Como a bactéria-amostra de número 1 é Gram positiva (este resultado fui concluído na prática 4), o único teste a se realizar é o da produção da Catalase. O resultado da produção de Catalase deu negativo como mostra a imagem 1.
Imagem : teste da procução da catalase
A tabela dada pela professora com as bactérias de cada amostra (com a numeração não identificada). Mostrou que duas amostras possuem bactérias gram positivas. As bactérias são: Enterococcus Faecalis e Staphylococcus Aureus. A única bactéria dentro do grupo que apresenta o teste de produção da Catalase negativo é a Enterococcus Faecalis. Com isso conclui-se que a bactéria amostra de número 1 é Enterococcus Faecalis.
Com a finalidade de obter conhecimento e prática, os testes utilizados para a bactéria Gram negativos foram feitos com a bactéria amostras de número.....
Foram obtidos como resultado após 24 horas de incubação a imagem ....
Imagem: Provas bioquímicas 
Observação: Os testes de produção de indol e motilidade foram realizados juntos no meio SIM.
-Metabolização de lactose em meio ágar MacConkey - Negativo 
A bactéria tornou o meio marrom, indicando que não houve metabolização de lactose. 
- Produção de uréase; desconsiderado
O meio de cultura não foi preparado como deveria, e por isso todos os testes feitos nesse meio estavam dando resultado negativo.
TSI - Negativo 
O meio permaneceu laranja, sem rompimento, e sem precipitação. Bactérias que fermentam glicose provocam acidificação apenas na base, que torna-se amarela. Bactérias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam o meio por completo. A formação de gás é evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produção de H2S se manifesta pleo escurecimento do meio. Consideram-se então negativos os resultados de todos os testes realizados no meio TSI. 
SIM - Desconsiderado; Positivo para indol 
O meio SIM é um ágar semi-sólido. A presença de crescimento fora do local da picada indica a produção de flagelos. A presença de precipitado preto indica a produção de ácido sulfídrico por redução do tiossulfato. O meio SIM utilizado encontrava-se líquido, o que impossibilitou a verificação da mobilidade. Não houve formação de ácido sulfídrico (esse resultado não pode ser aproveitado, uma vez que o estado líquido do meiopode ter interferido). 5.4.1. Indol - Negativo A degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase gera o indol. Este complexa-se com o aldeído em meio ácido, formando um anel de coloração rosa. Não houve formação de anel de coloração rosa, indicando que não há enzima triptofanase. 
Utilização do Citrato como única fotne de carbono- Positivo 
Bactérias que possuem a permease do citrato o transportam para o interior da célula, onde é metabolizado como fonte de carbono pela enzima citrase. Esse processo torna o meio alcalino, indicado por coloração azul pelo azul de bromotimol. Nesse teste, o meio tornou-se azul na parte superior, indicando que houve consumo de citrato. 
Lisina - Positivo 
O caldo lisina descarboxilase (roxo) possui peptonas, extrato de levedura, glicose e o indicador de pH púrpura de bromocresol. A fermentação da glicose reduz o pH, tronando o meio amarelo. Bactérias que possuem a enzima descarboxilase da lisina podem descarboxilar a lisina, liberando aminas e aumentando o pH, tornando o meio novamente roxo. O meio utilizado neste ensaio apresentou coloração roxa, indicando um resultado positivo para a enzima.
Os resultados encontrados para as provas bioquímicas não condizem com o de nenhuma enterobactéria entre as da tabela. Por conta de dois meios que não puderam ser válidos e também pode ter ocorrido contaminação durante a inoculação .A bactéria-amostra foi identificada com a ajuda da professora como Pseudomonas aeruginosa. 
VI. Conclusão
Ao final da prática pode ser percebido a importância das provas bioquímicas, para se obter características específicas, de uma determinada bactéria, o que auxilia na sua identificação. A prática foi realizada de modo satisfatório para este grupo, foi ao final dela e com a auxílio da tabela, a bactéria amostra de número 7 pode ser identificada. Já para as amostras Gram negativa, a identificação foi dificultada pelo fato de dois testes não estarem funcionando.
VII. Bibliografia
Tortora
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