Técnicas de Biologia Molecular

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Técnicas de Biologia Molecular 
 
• Gene Reporter – Luciferase 
 
Por meio deste método, é possível avaliar atividades específicas de promotores e 
indutores com vistas a regulação mediante fatores de transcrição. O gene repórter 
codifica proteínas que são facilmente detectadas, quantificadas e diferenciadas 
das proteínas endógenas. Normalmente se utiliza esta técnica para o estudo de 
promotor, este é clonado ligado a um gene de uma proteína (nesse caso a 
luciferase). A quantidade de proteínas expressa é proporcional a atividade do 
promotor. A proteína luciferase quando sofre a ação da luciferina, catalisa uma 
reação bioluminescente que pode ser quantificada. 
 
• EMSA 
 
Baseia-se no fato de que a mobilidade eletroforética de um ácido nucléico se altera 
quando uma proteína a ele se liga. A proteína de interesse, ou uma preparação de 
proteínas obtida de um determinado tipo celular sob estudo, é incubada com 
segmentos de DNA de fita dupla marcados radioativamente, as sondas, para 
permitir a formação de um complexo. A mistura é, então, submetida à eletroforese 
sob condições não desnaturantes. O complexo DNA/proteína formado apresenta, 
em geral, uma mobilidade eletroforética mais lenta (Shift) quando comparada 
àquela exibida pela sonda livre e as bandas correspondentes ao DNA ligado à 
proteína e ao DNA livre são visualizadas por autorradiografia. 
 
• Footprinting 
 
Técnica que se baseia na ligação de uma proteína a uma fita de DNA protegendo-
a contra ação de clivagem de um agente químico ou de uma enzima. Assim, 
quando uma fita de DNA marcada em uma das extremidades sofre a ação 
degradante de uma substância química ou enzima de maneira controlada (as 
condições da reação são estabelecidas para que ocorra preferencialmente apenas 
um ataque por molécula de DNA), uma série de fragmentos de diversos 
comprimentos é gerada. Todos estes fragmentos terão uma extremidade comum, 
por outro lado, se a ligação de uma proteína a esta fi9ta de DNA produzir um ou 
mais pontos de proteção contra o ataque, fragmentos de uma determinada faixa de 
comprimento não serão produzidos quando a reação de clivagem for precedida por 
incubação da fita de DNA com esta proteína nuclear. Quando produtos de 
clivagem gerados na presença e na ausência de proteína ligadora de DNA são 
resolvidos lado a lado numa eletroforese em condições desnaturantes, poderão ser 
observadas falhas na linha correspondente ao DNA incubado com a proteína. 
Estas falhas são os footprints (pegadas, em inglês) da proteína em questão. Para 
esta técnica podemos utilizar DNase I (enzima que se liga à curvatura menor da 
dupla hélice do DNA e corta a ligação fosfodiéster de ambas as fitas 
independentemente), do radical hidroxila ( por ser muito menor do que a molécula 
de DNase I é capaz de se difundir e de acessar bases da molécula de DNA 
inatingíveis pela DNase I ) e de íons permanganato (reconhece especificamente 
DNA de fita simples e pode ser utilizado para localizar regiões de DNA cuja dupla 
hélice foi desfeita, como por exemplo região promotoras em atividade. 
 
• Ensaios de interferência 
 
Objetiva-se a identificação das bases essenciais no contato do DNA com a 
proteína, e se baseia no fato de que as bases de uma determinada sequência de 
DNA podem ser modificadas quando esta é incubada com alguns agentes 
químicos. Se a modificação ocorrer em bases essenciais para a interação do DNA 
com um fator nuclear esta ligação deixará de ocorrer. Uma sonda marcada é 
tratada com um agente químico. Cada molécula recebe apenas uma modificação, 
assim, uma série de sondas marcadas que carregam uma modificação em uma de 
suas bases é gerada. 
Em seguida estas sondas parcialmente modificadas são incubadas com proteína 
purificada ou extrato nuclear e submetidas à eletroforese em condições muito 
semelhantes às do EMSA. As sondas cujas modificações nos nucleotídeos não 
interferiram na sua ligação com proteína formarão complexos DNA-proteína que 
migrarão como uma banda retardada. As sondas que sofreram alterações em 
bases críticas para a ligação proteica não formarão complexos e migrarão como 
sondas livres. 
 
Microarray 
 
Consiste num arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA 
genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma superfície 
sólida carregada positivamente. 
Os microarrays são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucleicos 
(RNAm na forma de cDNA ou DNA genômico) provenientes de amostras 
biológicas, as quais são postas para hibridar com o DNA fixado 
no array (hibridação por complementariedade de bases). A detecção é possível 
pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos. 
Necessária a geração de uma imagem de hibridação, que é obtida por meio de 
leitores (scanners) a laser (para os fluorocromos) ou leitores de fósforo (para o 
isótopo 33-P). O uso mais freqüente dos microarrays é na determinação da 
expressão gênica. O uso mais freqüente dos microarrays é na determinação da 
expressão gênica. 
Um DNA-microarray (microarranjo de DNA) é uma coleção de pontos microscópios 
formados por sequências de DNA fixados em uma superfície sólida constituída de 
vidro, plástico ou silicone. Estes segmentos microscópicos são chamados de 
sondas. Milhares delas são ligadas ao suporte, formando um pequeno chip que 
será utilizado como plataforma para a realização de reações de hibridização que 
possibilitarão a detecção da sequência ou sequências-alvo no material analisado. 
As sequências de DNA (ou cDNA) a serem analisadas são marcadas com 
corantes fluorescentes e colocadas para reagir com as sequências fixadas na 
superfície do microarranjo. Ao final, o sistema é lavado, as amostras não 
hibridizadas são removidas e a concentração de DNA é medida pela intensidade 
da emissão de fluorescência. Um ou dois fluoróforos são utilizados, dependendo 
da plataforma utilizada, sendo geralmente o Cy3 e Cy5 usados para marcar DNA. 
Os DNAs marcados são analisados num microarray scanner para a visualização 
da fluorescência após excitação com um raio laser de comprimento de onda 
definido. 
A tecnologia de hibridização em microarranjos tem o potencial para permitir a 
detecção simultânea de múltiplas infecções causadas por diversos patógenos, viral 
ou não-viral. A primeira aplicação do método para diagnóstico na virologia foi para 
o sequenciamento do HIV, buscando mutações associadas à resistência às drogas 
antirretrovirais. Este ensaio foi muito útil também na caracterização do vírus da 
SARS (severe acute respiratory syndrome) como um novo coronavírus. 
 
 
Ensaio de FISH 
 
É uma técnica citogenética usada para detectar e localizar a presença ou a 
ausência de determinadas sequências de DNA em cromossomos. Utiliza sondas 
fluorescentes que se ligam somente às partes do cromossomo a que eles 
apresentem um elevado grau de complementaridade de sequência. 
A FISH pode também ser usada para detecção e localização de alvos específicos 
de RNA em células circulantes, células tumorais ou amostras de tecido. 
 
 
CHIP – Imunoprecipitação da cromatina 
 
Identificar as proteínas associadas a uma região específica do genoma e 
inversamente, identificar diferentes regiões do genoma associadas a uma proteína 
particular. O princípio da técnica é utilizar um anticorpo para identificar a presença 
de proteínas específicas (e se for o caso com modificações estruturais) associadas 
às regiões de DNA em estudo. As células são incubadas com um agente fixador, 
promovendo ligação covalente do DNA com suas proteínas, em seguida, a 
amostra é fragmentada por sonicação o lisado celular é centrifugado, promovendo 
debris celulares insolúveis. O lisado é incubado com o anticorpo e os complexos 
antígeno anticorpo são capturados com bilhas de sefarose.