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1 LI 2 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 6 2 MORFOLOGIA, CONSTITUINTES E CRESCIMENTO BACTERIANO ................. 7 2.1 Genética bacteriana ............................................... Erro! Indicador não definido. 2.1.1 Organização do material genético bacteriano .................................................... 7 2.1.2 Mutação .............................................................................................................. 8 2.1.3 Recombinação genética ..................................................................................... 9 2.1.4 Transferência de DNA em bactérias................................................................... 9 3 MORFOLOGIA BACTERIANA ............................................................................. 12 3.1 Células procarióticas ........................................................................................... 12 3.2 Morfologia e arranjos bacterianos ....................................................................... 14 4 CRESCIMENTO BACTERIANO .......................................................................... 17 5 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA ......................... 20 6 BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS .................................... 20 6.1 Bactérias gram-negativas .................................................................................... 21 6.2 Bactérias gram-positivas ..................................................................................... 22 7 COLORAÇÃO DE GRAM .................................................................................... 23 8 BACTÉRIAS ÁLCOOL-ACIDORRESISTENTES ................................................. 24 9 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN ................................................................... 26 9.1.1 Outras técnicas de colorações de bactérias ..................................................... 27 10 MICROBIOTA NORMAL E MICROBIOMA .......................................................... 30 10.1 Microbiota normal .............................................................................................. 30 10.1.1 Sítios de colonização da microbiota normal ................................................... 31 10.1.2 Propriedades patogênicas dos microrganismos ............................................. 34 10.1.3 Infecções oportunistas .................................................................................... 35 10.1.4 Relações harmônicas com fungos.................................................................. 38 10.2 Microbioma e sua relação com a saúde humana .............................................. 39 11 MEIOS DE CULTURA E CARACTERÍSTICAS BACTERIANAS ......................... 41 11.1 Meios de cultura ................................................................................................ 42 11.2 Ágar-sangue ...................................................................................................... 44 11.3 Ágar MacConkey ............................................................................................... 45 11.4 Ágar-chocolate .................................................................................................. 45 3 11.5 Ágar Thayer-Martin chocolate ........................................................................... 46 11.6 Ágar SS............ ........................................................................................... ......46 11.7 Ágar Löwenstein-Jensen ................................................................................... 46 12 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ............................................. 47 12.1 Prova da catalase .............................................................................................. 50 12.2 Prova da coagulase ........................................................................................... 50 12.3 Teste da novobiocina ........................................................................................ 50 12.4 Teste da bacitracina .......................................................................................... 51 12.5 Teste da optoquina ............................................................................................ 51 12.6 Ágar bile-esculina .............................................................................................. 51 12.7 Ágar citrato Simmons ........................................................................................ 52 12.8 Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) .......................................................... 52 12.9 Fermentação de carboidratos ............................................................................ 52 12.10 Descarboxilação de lisina e ornitina ................................................................ 52 12.11 Produção de indol............................................................................................ 53 12.12 Teste de motilidade ......................................................................................... 53 12.13 Fenilalanina desaminase ................................................................................. 53 12.14 Prova de oxidase ............................................................................................. 54 12.15 Prova de urease .............................................................................................. 54 13 TÉCNICAS DE SEMEADURA ............................................................................. 54 13.1 Semeadura em meio líquido .............................................................................. 56 13.2 Semeadura em meio sólido inclinado ou em placa............................................ 56 13.3 Semeadura em meio semissólido em tubo (picagem profunda) ........................ 56 13.4 Semeadura em meio sólido em placa (semeadura por esgotamento) ............... 56 13.5 Semeadura em profundidade (pour-plate) ......................................................... 57 13.6 Semeadura para quantificação .......................................................................... 57 14 INTRODUÇÃO AO ESTUDO DOS ANTIMICROBIANOS .................................... 58 14.1 História dos antimicrobianos .............................................................................. 59 14.2 Classificação dos antimicrobianos..................................................................... 61 14.3 Inibidores da síntese de parede celular ............................................................. 63 14.4 Inibidores da síntese proteica ............................................................................ 64 14.5 Inibição da síntese de ácidos nucleicos ............................................................ 65 14.6 Danos à membrana plasmática ......................................................................... 65 4 14.7 Inibição da síntese de metabolitos essenciais ................................................... 65 14.8 Resistência bacteriana ...................................................................................... 66 14.9 Mecanismos de resistência ............................................................................... 67 14.10 Inativação enzimática do fármaco ................................................................... 67 14.11 Modificação do sítio alvo do fármaco .............................................................. 68 14.12 Efluxo do antibiótico ........................................................................................ 68 14.13 Redução na permeabilidade do antibiótico ...................................................... 69 14.14 Uso inadequadode antibióticos ...................................................................... 69 15 ANTIBIOGRAMA.................................................................................................. 70 15.1 Antibióticos utilizados em antibiogramas ........................................................... 71 15.2 Normas do CLSI para antibiograma .................................................................. 79 15.3 Teste de disco-difusão (método Kirby-Bauer) ................................................... 79 15.4 Testes quantitativos de sensibilidade aos antibióticos ...................................... 83 15.5 Bactérias diferenciadas por antibiogramas ........................................................ 83 15.5.1 Diferenciação de Staphylococcus spp. por antibiogramas ............................. 84 15.5.2 Diferenciação de Streptococcus spp. por antibiogramas ................................ 84 15.5.3 Diferenciação de bacilos gram-negativos não fermentadores por antibiogramas ............................................................................................................ 85 15.5.4 Identificação de bactérias multirresistentes por antibiogramas ...................... 85 16 MICROBIOTA DE OROFARINGITE E NASOFARINGITE ................................... 87 16.1 Características de bactérias da microbiota normal e patogênicas na orofaringe e nasofaringe......... ....................................................................................................... 87 16.2 Infecções por alimentos e água contaminados versus infecções transmitidas por via fecal-oral....... ....................................................................................................... 88 16.3 Métodos diagnósticos para as infecções do trato gastrintestinal ....................... 90 17 PROCEDIMENTO EM UROCULTURA ................................................................ 91 17.1 Microbiota comensal dos potenciais patógenos do sistema urinário ................. 92 17.2 Infecção por contaminação fecal: transmissão sexual ...................................... 94 17.3 Métodos diagnósticos em urocultura e sua associação com exame qualitativo de urina................ ..................................................................................................... 95 18 TESTES DE IDENTIFICAÇÃO DE ESTREPTOCOCOS E ENTEROCOCOS ..... 97 18.1 Características dos estreptococos e enterococos ............................................. 98 18.1.1 Morfologia e hemólise .................................................................................... 98 5 18.1.2 Classificação de Lancefield ............................................................................ 99 18.1.3 Reações bioquímicas ................................................................................... 100 18.2 Principais locais de infecção desses microrganismos ..................................... 103 18.3 Testes de identificação de cocos..................................................................... 107 18.3.1 Microbiológicos ............................................................................................. 107 18.3.2 Sorológicos ................................................................................................... 109 19 INFECÇÕES BACTERIANAS SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS ................. 110 19.1 Bactérias responsáveis por infecções sexualmente transmissíveis ................ 110 19.1.1 Gonorreia ..................................................................................................... 110 19.1.2 Sífilis ............................................................................................................. 111 19.1.3 Uretrite não gonocócica ................................................................................ 112 19.1.4 Doença inflamatória pélvica ......................................................................... 114 19.1.5 Linfogranuloma venéreo ............................................................................... 115 19.1.6 Caracterização morfológica do Treponema pallidum ................................... 116 19.2 Métodos de diagnóstico laboratorial ................................................................ 117 19.2.1 Gonorreia ..................................................................................................... 118 19.2.2 Sífilis ............................................................................................................. 118 19.2.3 Diagnóstico laboratorial de clamidioses ....................................................... 120 20 TESTES DE IDENTIFICAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS ..................................... 121 20.1 Morfologia de cocos gram-positivos ................................................................ 121 20.2 Locais de infecção dos estafilococos .............................................................. 123 20.3 Identificação de estafilococos .......................................................................... 126 21 HEMOCULTURA ............................................................................................... 130 21.1 Sepse e choque séptico .................................................................................. 130 21.1.1 Agentes etiológicos na sepse ....................................................................... 133 21.2 Metodologia e aspectos da hemocultura ......................................................... 134 21.2.1 Procedimentos e técnicas de hemocultura ................................................... 136 21.3 Métodos automatizados de diagnóstico por hemocultura ................................ 140 21.3.1 Método de lise-centrifugação ....................................................................... 140 21.3.2 Método semiautomatizado ........................................................................... 140 21.3.3 Método automatizado ................................................................................... 141 22 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 143 6 INTRODUÇÃO Prezado aluno! O Grupo Educacional FAVENI, esclarece que o material virtual é semelhante ao da sala de aula presencial. Em uma sala de aula, é raro – quase improvável - um aluno se levantar, interromper a exposição, dirigir-se ao professor e fazer uma pergunta, para que seja esclarecida uma dúvida sobre o tema tratado. O comum é que esse aluno faça a pergunta em voz alta para todos ouvirem e todos ouvirão a resposta. No espaço virtual, é a mesma coisa. Não hesite em perguntar, as perguntas poderão ser direcionadas ao protocolo de atendimento que serão respondidas em tempo hábil. Os cursos à distância exigem do aluno tempo e organização. No caso da nossa disciplina é preciso ter um horário destinado à leitura do texto base e à execução das avaliações propostas. A vantagem é que poderá reservar o dia da semana e a hora que lhe convier para isso. A organização é o quesito indispensável, porque há uma sequência a ser seguida e prazos definidos para as atividades. Bons estudos! 7 1 MORFOLOGIA, CONSTITUINTES E CRESCIMENTO BACTERIANO As bactérias e os microrganismos procariontes estão amplamente espalhados nos mais variados tipos de ambiente, seja em alimentos, animais ou, até mesmo, em humanos. Existem inúmeras espécies bacterianas, cada uma com suas próprias características. É extremamente importante, para o microbiologista, saber os conceitos mais básicos da bacteriologia, desde a estrutura celular bacteriana, até a composição e a organização genética, a morfologia, a forma de reprodução e o crescimento (SOUZA, 2019). 1.1 Organização do material genético bacteriano O genoma procariótico bacteriano carrega toda a informação hereditária da bactéria,ou seja, é nele que estão armazenadas as informações genéticas que se expressam em diferentes funções estruturais e fisiológicas e que podem ser transmitidas para as gerações seguintes, sendo o DNA o elemento fundamental de hereditariedade. O genoma procariótico é constituído pelo conjunto de todos os genes da bactéria que podem estar presentes em seu cromossomo ou em elementos genéticos extracromossômicos (plasmídeos, bacteriófagos e transposons). Em sua grande maioria, as bactérias são haploides, isto é, elas têm apenas um cromossomo (consequentemente, cada gene tem apenas uma cópia), o qual está organizado em uma única molécula de DNA circular (MURRAY et al., 2004). O DNA está normalmente organizado em fita dupla, que se pareia complementarmente por meio de bases nitrogenadas adenina (A) e timina (T) e guanina (G) e citosina (C), respectivamente (A-T; G-C), por intermédio de pontes de hidrogênio (dupla e tripla ligação, respectivamente). Além das bases nitrogenadas o DNA ainda é constituído pela pentose desoxirribose e pelo fosfato (sendo o conjunto desses três compostos chamados de nucleotídeo). Os nucleotídeos ligam-se à fosfo- 2’-desoxirribose (ligação fosfodiéster), formando um esqueleto de DNA (BROOKS et al., 2014). 8 2.1.2 Mutação As mutações gênicas são aquelas que causam alterações herdáveis e permanentes na sequência de bases do DNA. As mutações no genótipo podem ser vantajosas, prejudiciais ou até mesmo letais, mas normalmente são neutras e não apresentam efeitos nos organismos. As bactérias têm eficientes sistemas de reparo que minimizam os danos no DNA, porém, elas se dividem e crescem exponencialmente, ocasionando um acúmulo de mutações não reparadas que, juntamente com eventos de recombinação gênica, tornam possível a evolução (MADIGAN et al., 2016). Segundo Levinson, 2016; Tortora; Funke; Case, 2017, é possível classificar as mutações de DNA de acordo com as seguintes bases moleculares: • substituição; • adição/inserção; • deleção. • Substituição de bases: também chamada de mutação pontual ou polimorfismo de nucleotídeo único (do inglês single nucleotide polimorphism), ocorre quando um único par de base é substituído por outro. Esse evento pode ocorrer durante a replicação do DNA, por um erro da enzima DNA-polimerase ou por um agente mutagênico que interage com o DNA. Se uma base purina é substituída por outra purina (A por G, ou G por A), ou uma base pirimidina é substituída por outra pirimidina (C por T ou T por C), esse evento é chamado de transição. Caso uma base purina seja substituída por uma pirimidina ou vice- versa, chama-se esse evento de transversão. O evento de substituição de bases pode trazer consequências diferentes nas sequências de aminoácidos das proteínas, após a tradução do mRNA em proteína. Quando ocorre troca de códon, mas que codifica para o mesmo aminoácido, denomina-se como mutação silenciosa (ou mutação com sentido ou sinônima), sendo que não há a alteração do fenótipo do organismo. Em caso de troca de códon que codifica para um aminoácido diferente na proteína sintetizada, dá-se o nome de mutação de troca de sentido (do inglês missense), sendo que essa mutação pode ser neutra (aminoácido substituído tem função similar ao igual, por 9 exemplo, valina substituindo a alanina) ou pode produzir uma proteína de forma inativa ou com função alterada (aminoácido substituído tem função diferente do original). Já a mutação sem sentido (do inglês nonsense) ocorre quando a substituição de base origina um códon de término, que interrompe prematuramente a síntese da proteína e, na maioria das vezes, a proteína se torna sem função (LEVINSON, 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). • Adição/inserção e deleção de bases: também chamadas de mutações INDEL, elas ocorrem quando um ou mais pares de bases nitrogenadas são, respectivamente, inseridos ou removidos no DNA. Esses eventos podem ocorrer espontaneamente durante a replicação do DNA, por um erro da enzima DNA-polimerase, ou induzidas por agentes mutagênicos físicos (por exemplo, calor, luz ultravioleta e raio X) ou químicos (por exemplo., 5-bromouracil, brometo de etídio, derivados da acridina e ácido nitroso). Uma consequência é a mutação de troca de fase de leitura (do inglês frameshift), em que a fase de leitura do mRNA é alterada, já que o agrupamento de três nucleotídeos (códons) é lido de forma errada pelo tRNA (RNA de transferência), resultando na incorporação de aminoácidos errados e em proteínas truncadas ou inativas (SOUZA, 2019). 2.1.3 Recombinação genética A recombinação genética é o fenômeno no qual ocorre troca de genes entre duas moléculas de DNA, formando novas combinações de genes em um cromossomo. É possível classificar essa recombinação em dois tipos: recombinação homóloga, que acontece quando os dois segmentos de DNA pareados têm sequências praticamente idênticas, ou recombinação não homóloga, quando as sequências do DNA são diferentes, requerendo que sejam catalisadas por enzimas especializadas em recombinação (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016). 2.1.4 Transferência de DNA em bactérias Constantemente, as bactérias trocam genes entre si, aumentando notavelmente as diversidades genética e metabólica e o surgimento de novas cepas. 10 A transferência de DNA em bactérias pode trazer inúmeras vantagens adaptativas, como resistência a antibióticos, por exemplo. O DNA pode ser integrado ao cromossomo da bactéria receptora ou mantido como um elemento extracromossômico independente. A transferência de DNA dentro das células bacterianas pode ocorrer por plasmídeos, bacteriófagos, transposons e por rearranjos programados (MADIGAN et al., 2016; MURRAY et al., 2004). As bactérias podem transmitir o DNA para os seus descendentes, fenômeno chamado de transferência vertical de genes, ou lateralmente para outras bactérias que não são descendentes diretas (transferência horizontal de genes). A transferência horizontal de DNA entre bactérias pode ocorrer por três mecanismos: conjugação, transformação e transdução (MADIGAN et al., 2016). É importante que você conheça e entenda cada um desses mecanismos, que serão explicados a seguir e estão representados na Figura 1. • Transformação: é o mecanismo em que a bactéria capta DNA livre (desnudo) estranho ou exógeno, proveniente de outra bactéria, incorporando novos marcadores genéticos em seu genoma. Esse processo pode ocorrer naturalmente em algumas espécies (p.ex., Acinetobacter, Bacillus, Haemophilus, Neisseria e algumas linhagens de Staphylococcus e Streptococcus), apesar de a maioria das linhagens e espécies bacterianas não ser capaz de realizar transformação de forma natural ou poder ser induzida em laboratórios por métodos químicos ou eletroporação (uso de pulsos de alta voltagem), sendo a incorporação de plasmídeos extracelulares induzida em laboratório fundamental na engenharia genética (BROOKS et al., 2014; MADIGAN et al., 2016). • Transdução: é o mecanismo em que o DNA de uma bactéria (doadora) é transferido para outra (receptora) por meio de um bacteriófago. Caso o bacteriófago incorpore acidentalmente em seu capsídeo, sendo o DNA da bactéria doadora proveniente de uma região genômica qualquer, dá-se o nome, a esse processo, de transdução generalizada. Agora, se o bacteriófago incorporar genes específicos da bactéria doadora, chama-se de transdução especializada (MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). • Conjugação: considerado um acasalamento bacteriano, este é o mecanismo de troca de material genético (transferência de plasmídeo ou de cromossomo) de uma bactéria para outra por intermédio da formação do pílus sexual. É necessário que haja 11 contato direto entre uma bactéria doadora e uma bactéria receptora, sendo que a primeira tem o plasmídeo de fertilidade (p.ex., plasmídeo F produzidopela bactéria Escherichia coli que está relacionado com a formação do pílus sexual) e a segunda não (MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Figura 1. Mecanismos de transferência horizontal de genes. As bactérias podem transferir genes para outras bactérias horizontalmente por transformação, transdução ou conjugação. Fonte: Madigan et al. (2016, p. 300). 12 2 MORFOLOGIA BACTERIANA 2.1 Células procarióticas Uma célula bacteriana constitui uma bactéria, portanto, trata-se de organismos unicelulares, procarióticos e pequenos que interagem com outras células e com o meio circundante de forma dinâmica (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). As estruturas típicas das células procarióticas bacterianas estão representadas na Figura 2. Figura 2. Estrutura de uma célula procariótica e seus componentes. Fonte: Adaptada de Emre Terim/Shutterstock.com Todas as bactérias têm membrana plasmática, constituída principalmente de fosfolipídios e proteínas, cujas funções incluem separar o meio intracelular (citoplasma) do ambiente extracelular, funciona como uma barreira de permeabilidade seletiva e transporta solutos e elétrons. O citoplasma é um meio aquoso espesso que se encontra dentro das células, sendo a sua composição de 80% água e o restante de proteínas, carboidratos, lipídios e íons orgânicos. Misturados ao citoplasma, estão os ribossomos e o nucleoide. Os ribossomos são as únicas organelas citoplasmáticas presentes nas células procarióticas e que são responsáveis pela síntese de proteínas (SOUZA, 2019). Os ribossomos dos procariotos são estruturalmente diferentes dos ribossomos eucarióticos, sendo um alvo potencial para alguns antibióticos (MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). 13 O nucleoide é o material genético das células procarióticas que é constituído de ácidos nucleicos. Ele consiste em uma única molécula circular de DNA, arranjada em forma de cromossomo, que não está envolto por membrana nuclear, como acontece em células eucarióticas. É no nucleoide que estão armazenadas todas as informações genéticas da bactéria, sendo, portanto, essencial para coordenar a síntese de proteínas estruturais e funcionais (LEVINSON, 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). A membrana plasmática da maioria das bactérias está envolta pela parede celular, que é relativamente permeável e tem a função de conferir resistência estrutural à célula. A parede celular é rígida, pois contém peptidoglicano, que é um polímero de aminoácido e açúcares encontrado exclusivamente em células procarióticas (LEVINSON, 2016; MADIGAN et al., 2016). Algumas bactérias contêm cápsula externamente à parede celular, composta, na maioria das espécies, de polissacarídeo. Essa estrutura permite a invasão celular de bactérias patogênicas, uma vez que as bactérias encapsuladas não são fagocitadas, ou seja, a cápsula é um fator de virulência bacteriana. As fímbrias e os pili são apêndices proteicos filamentosos que estão presentes na superfície celular, sendo mais finos, curtos e retos em relação ao flagelo e tendo a aparência de pelos. As fímbrias têm capacidade de adesão das células em superfícies e participam da formação de biofilmes. Já os pili (também chamado de pílus) são estruturas semelhantes às fímbrias, no entanto, são mais longos, estão presentes em menor quantidade e estão envolvidos na motilidade celular e na transferência de DNA pelo processo de conjugação (MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Algumas bactérias têm um ou mais flagelos, que são apêndices proteicos finos e longos. Os flagelos permitem que a bactéria se locomova em busca de nutrientes e outros fatores atrativos (quimiotaxia), portanto, as bactérias com flagelos adquirem a capacidade de motilidade. As bactérias sem flagelo são chamadas de atríquias. Os flagelos são classificados como peritríquios (Figura 3a), se estão distribuídos ao redor da bactéria, ou como polares (Figura 3b), caso estejam localizados em uma ou em ambas as extremidades da bactéria. Os flagelos polares com apenas um único flagelo em um polo da célula são chamados de monotríquios (Figura 3b), ao passo que os lofotríquios são os flagelos em forma de tufo, que podem ser localizados em um polo 14 da célula (Figura 3c), e os anfitríquios são aqueles que têm flagelos em ambos os polos (Figura 3d) (BROOKS et al., 2014; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Figura 3. Arranjos flagelares bacterianos. (a) flagelo peritríquio; (b) flagelo monotríquio e polar; (c) flagelo lofotríquio e polar; (d) flagelo anfitríquio e polar. Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 77). 2.2 Morfologia e arranjos bacterianos As principais formas bacterianas são: cocos, bacilo, vibrião, espirilo e espiroqueta. Em geral, os cocos têm formato esférico, mas também podem ser ovais, alongados ou achatados em uma das extremidades. Quando ocorre divisão bacteriana, os cocos podem permanecer unidos, formando diferentes arranjos bacterianos: diplococos (Figura 4a), quando estão agrupadas em um par (por exemplo, Neisseria gonorrhoeae e Streptococcus pneumoniae); estreptococos (Figura 4a), quando formam uma cadeia (por exemplo, Streptococcus pyogenes); estafilococos (Figura 4d), quando se agrupam em cachos (por exemplo, Staphylococcus aureus); tétrades (Figura 4b), quando se dividem em dois planos e permanecem ligados em grupos de quatro (por exemplo, Pediococcus); sarcinas (cocos em cubos) (Figura 4c), quando se dividem em três planos e permanecem ligados em grupos de oito (por exemplo, Sarcina) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). 15 Figura 4. Arranjos dos cocos: (a) a divisão em um único plano produz diplococos e estreptococos; (b) a divisão em dois planos produz tétrades; (c) a divisão em três planos produz sarcinas; (d) a divisão em múltiplos planos produz estafilococos. Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 74). Os bacilos (ou bastonetes) geralmente têm formato de bastão, mas também podem ter formas de lanças, outras com extremidades arredondadas ou retas. A maioria dos bacilos não se agrupa com outros, sendo estes chamados de bacilo único (Figura 5a). Quando se dividem, os bacilos podem formar diferentes arranjos bacterianos: diplobacilos (Figura 5b), quando estão agrupadas em um par (por exemplo, Diplobacillus variabilis); estreptobacilos (Figura 5c), quando formam uma cadeia (por exemplo, Bacillus cereus); cocobacilos (Figura 5d), quando são ovais e se assemelham aos cocos (por exemplo, Haemophilus influenzae) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). 16 Figura 5. Arranjos dos bacilos: (a) bacilo único; (b) diplobacilos; (c) estreptobacilos; (d) cocobacilos. Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 74). 17 Figura 6. Bactérias espirais: (a) vibrião; (b) espirilo; (c) espiroqueta. Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 75). Também existem bactérias em forma de espirais: o vibrião (Figura 6a), que é rígido e tem forma de bastão curvo, como uma vírgula (por exemplo, Vibrio cholerae); o espirilo (Figura 6b), que é rígido e tem forma helicoidal, como um saca-rolhas (por exemplo, Helicobacter pylori); e a espiroqueta (Figura 6c), que é flexível e tem forma helicoidal, como uma espiral (por exemplo, Treponema pallidum) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). 3 CRESCIMENTO BACTERIANO Apesar do que o nome sugere, o crescimento bacteriano não é o aumento de tamanho celular, mas, sim, o aumento do número de células, as quais se acumulam em colônias, que podem ser visualizadas em meios de cultura mesmo sem o uso de microscópio. O crescimento começa pelo aumentoda soma de todos os componentes celulares, que culmina na divisão celular (reprodução), gerando duas células-filha a partir de uma célula-mãe — processo chamado de fissão binária (ou divisão binária). Para crescerem, as bactérias necessitam de fatores físicos (temperatura, pH e pressão osmótica) e químicos (fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, oxigênio, elementos-traço e fatores orgânicos de crescimento) adequados, sendo que as condições ótimas de crescimento variam entre as espécies (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008; MADIGAN et al., 2016). Pelo processo de fissão binária, uma célula bacteriana origina duas células- - filha, dessa forma, a cada geração, uma célula-filha recém gerada vai formando mais duas, o que caracteriza um crescimento exponencial ou crescimento logarítmico. De uma maneira matematicamente simplificada, é possível considerar que o crescimento bacteriano ocorre em progressão geométrica de quociente 2, por intermédio da fórmula onde: • N é o número final de células bacterianas; 18 • N0 é a quantidade de bactérias no tempo inicial; e • n é o número de gerações formadas durante um tempo t (minutos, horas ou dias) de crescimento exponencial (SOUZA, 2019). Segundo TORTORA et al. (2017), o N deve ser convertido para escala logarítmica de base 10 (log 10), para se representar graficamente, ou então usar a seguinte fórmula: log N = log N0 + n log 2 (observação: log 2 = 0,301). Conhecendo o n e o tempo de crescimento exponencial (t), pode-se determinar o tempo de geração (g) da população que é definido como o tempo que uma célula bacteriana precisa para se dividir em duas, dobrando a população por meio da equação g = t/n. As diferentes espécies bacterianas crescem em tempos distintos (diferentes velocidades), podendo ser do tipo crescimento rápido ou lento. A maioria das bactérias se divide formando uma nova geração a cada 1 a 3 horas, enquanto outras necessitam de mais de 24 horas para completarem a divisão (MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). É possível representar graficamente o crescimento de bactérias inoculadas em meio de cultura líquido de composição adequada e incubadas em temperaturas ideais por intermédio da curva de crescimento exponencial bacteriano, sendo necessário fazer a contagem em intervalos regulares. O ciclo de crescimento das bactérias apresenta quatro fases distintas, conforme mostrado na Figura 7 e explicado a seguir (SOUZA, 2019): • Fase de latência ou fase lag: período em que as bactérias estão se adaptando ao novo ambiente e ocorre intensa atividade metabólica (produção de enzimas e outras moléculas). Nesse período, porém, há pouca ou nenhuma divisão celular. O tempo de latência pode variar e, às vezes, nem existir, dependendo de alguns fatores, como condições de crescimento, se o inóculo provém de uma cultura velha ou de um meio totalmente diferente (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). • Fase exponencial ou fase log: período em que ocorre intensa divisão celular, com crescimento exponencial e tempo de geração (velocidade) constante. Este é o período de maior atividade metabólica (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). • Fase estacionária: fase em que a velocidade de crescimento diminui gradualmente, já que, com o intenso crescimento celular da fase exponencial, os 19 nutrientes vão se esgotando, ocasionando o acúmulo de resíduos tóxicos, a mudança de pH e a ausência de O2. Dessa forma, há a diminuição do crescimento bacteriano e um equilíbrio entre células novas e células mortas, mantendo o número de bactérias constante (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). • Fase de morte ou fase logarítmica de declínio: fase em que o número de células mortas é superior ao das células vivas, ocorrendo, portanto, um declínio no número de bactérias viáveis (vivas), até que a maioria das células, ou todas, morra (BROOKS et al., 2014; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Figura 7. Curva de crescimento exponencial bacteriano. O crescimento bacteriano passa por quatro fases: (1) fase de latência ou lag, (2) fase exponencial ou log, (3) fase estacionária e (4) fase de morte ou logarítmica de declínio. Fonte: Brooks et al. (2014, p. 57). Na prática, as fórmulas matemáticas descritas acima e a curva de crescimento exponencial têm várias aplicações, como, por exemplo, descrever o número de bactérias em uma população e determinar o efeito em cultura de um novo conservante de alimentos (ou seja, se o conservante alimentar inibe o crescimento bacteriano no alimento). O crescimento bacteriano pode ser medido por diversos métodos (diretos ou indiretos), como: contagens microscópicas das células, contagem em placas (ou contagem de células viáveis), espectrofotometria, filtração, método do número mais provável e turbidimetria (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). 20 4 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA A identificação de espécies bacterianas faz parte da rotina de laboratórios de bacteriologia clínica. Dessa forma, diferentes técnicas de coloração são utilizadas para que seja possível observar as bactérias em microscopia de campo claro, já que os corantes aumentam o contraste e facilitam a visualização (SOUZA, 2019). 5 BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS A maioria das bactérias têm uma parede celular, composta por peptidoglicano (também chamado de mureína ou mucopeptídeo), que circunda a membrana plasmática. Além de conferir rigidez e a forma da célula, a parede celular também tem como funções a proteção, o que evita que a célula se rompa (lise celular) quando a pressão osmótica dentro da célula é maior que a do meio externo, e a ancoragem para os flagelos (LEVINSON, 2016). As bactérias podem ser classificadas como gram-positivas ou gram-negativas. Essa classificação é feita de acordo com a resposta à coloração de Gram em diferenças estruturais nas paredes celulares (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). É muito importante saber as diferenças estruturais entre as bactérias gram-negativas e gram-positivas, as quais estão representadas na Figura 8 e serão explicadas ao longo do capítulo. Figura 8. Diferenças estruturais entre bactérias gram-negativas e gram-positivas. Uma das diferenças mais marcantes é a quantidade de camadas de peptidoglicano (uma ou poucas nas bactérias gram- negativas e várias nas gram-positivas). Outra diferença importante é que somente as bactérias gram- 21 negativas têm uma membrana externa, a qual é constituída de lipopolissacarídeos (LPSs). Fonte: Adaptada de Designua/Shutterstock.com. 5.1 Bactérias gram-negativas As paredes celulares das bactérias gram-negativas têm uma ou poucas camadas de peptidoglicano, mas são mais complexas estrutural e quimicamente em relação às gram-positivas. Somente as gram-negativas têm uma membrana externa, que é constituída de LPSs, lipoproteínas e fosfolipídios. As funções da membrana externa incluem manter a estrutura bacteriana, conferir defesa celular e funcionar como uma barreira de permeabilidade a grandes moléculas (por exemplo, metais pesados, enzimas digestórias, como a lisozima, e antibióticos) e moléculas hidrofóbicas (por exemplo, detergentes). A membrana externa, porém, permite uma permeabilidade seletiva por intermédio das proteínas da membrana — chamadas de porinas —, as quais formam canais que permitem a passagem de determinadas moléculas, como nucleotídeos, dissacarídeos, peptídeos, aminoácidos, vitamina B12 e ferro (SOUZA, 2019). O espaço periplásmico das bactérias gram-negativas compreende a área entre a superfície externa da membrana citoplasmática e a superfície interna da membrana externa e é constituído pelo periplasma, um fluido semelhante a um gel que contém várias enzimas de degradação e proteínas de transporte. Algumas espéciesde bactérias gram-negativas têm enzimas β-lactamases no espaço periplásmico, que degradam antibióticos da classe β-lactâmicos, como, por exemplo, a penicilina, podendo ser, portanto, naturalmente resistentes a essa classe de antibióticos. O LPS, constituinte da membrana externa, é uma molécula grande, anfipática (extremidades hidrofóbicas e hidrofílicas) e complexa. O LPS é uma endotoxina extremamente tóxica, sendo considerado um potente estimulador de respostas imunológicas no hospedeiro, podendo causar febre, choque e outros sintomas graves (SOUZA, 2019). O LPS é constituído por três unidades distintas: • lipídio A — responsável pelos efeitos tóxicos; • cerne polissacarídeo — formado por cinco açúcares ligados ao lipídio A, tem a função estrutural de estabilidade; 22 • polissacarídeo O (ou antígeno O) — composto por moléculas de açúcar, tem a função de antígeno, sendo útil para diferenciar espécies bacterianas gram- negativas, já que existe grande variabilidade entre espécies e cepas bacterianas. Algumas bactérias gram-negativas, como Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae e H. ducreyi, não têm LPS na membrana externa, mas têm uma molécula semelhante, o lipo-oligossacarídeo, que é um importante fator de virulência causador de febre e outros sintomas. Outros exemplos de bactérias gram-negativas são Escherichia coli, Salmonella enterica e Pseudomonas aeruginosa (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016; MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). 5.2 Bactérias gram-positivas As paredes celulares das bactérias gram-positivas são mais espessas e rígidas em comparação às das gram-negativas, pois têm várias camadas de peptidoglicano. O espaço periplásmico também está presente, porém, nas bactérias gram- -positivas, há uma camada granular composta por ácido lipoteicoico (SOUZA, 2019). Apenas as bactérias gram-positivas contêm ácidos teicoicos (presente na maioria das espécies de bactérias gram-positivas), que são polímeros hidrossolúveis de poliol fosfatos situados na camada externa da parede celular. Quando estão ligados à camada de peptidoglicano, são classificados como ácidos teicoicos da parede, porém, quando atravessam a camada de peptidoglicano, ligando- -se aos lipídios da membrana citoplasmática, são classificados como ácidos lipoteicoicos (têm um ácido graxo). Os ácidos teicoicos são antígenos de superfície das bactérias gram-positivas que favorecem a ligação com outras bactérias e receptores específicos de células de mamíferos (fenômeno patogênico chamado de aderência), podendo ser utilizados na diferenciação de sorotipos bacterianos. Além disso, os ácidos teicoicos são importantes fatores de virulência, pois são capazes de induzir choque séptico no hospedeiro. Alguns exemplos de bactérias gram-positivas são: Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae e Bacillus anthracis (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016; MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). 23 6 COLORAÇÃO DE GRAM Agora que já estudou as características e as diferenças estruturais das paredes celulares das bactérias gram-positivas e gram-negativas, você irá aprender sobre a técnica de coloração de Gram, a qual é amplamente utilizada para visualizar e classificar as bactérias nesses dois grupos. A coloração de Gram leva o nome do seu descobridor: Hans Christian Gram — um médico histologista dinamarquês que tentava corar bactérias em tecidos infectados. Em 1884, ele desenvolveu a técnica ao perceber que, de acordo com o corante utilizado, as bactérias adquiriam cores diferentes, o que permitia classificá- -las em dois grupos diferentes: as que se coravam de azul/roxo e as que se coravam de vermelho/rosa (gram-positivas e gram-negativas, respectivamente) (BROOKS et al., 2014). Durante as primeiras etapas da coloração o corante cristal de violeta e o iodo são incorporados ao citoplasma das bactérias, entretanto, ao adicionar um descorante, algumas bactérias se tornam incolores, sendo então denominadas gram- negativas, enquanto outras permanecem coradas de azul/púrpura, sendo estas chamadas de gram-positivas. Tendo em vista que as bactérias gram-negativas se tornam incolores depois da descoloração, é necessário que elas sejam, então, coradas para que possam ser visualizadas no microscópio de campo claro, para isto, utilizam-se os corantes vermelho safranina ou fucsina (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). A retenção, ou não do corante cristal de violeta é explicada devido a algumas diferenças estruturais das paredes celulares das bactérias gram-positivas e gram- negativas. As bactérias gram-positivas têm uma parede celular mais espessa em relação às gram-negativas, a qual é composta por várias camadas de peptidoglicano, enquanto somente as bactérias gram-negativas têm LPSs na parede celular. O cristal de violeta e o iodo penetram facilmente nas células das bactérias, formando um complexo insolúvel de cristal violeta-iodo, que é maior do que a molécula de cristal que entrou na célula (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Quando as células são lavadas com álcool ou solução álcool-acetona podem ocorrer duas situações: 24 • as bactérias gram-negativas conseguem eliminar o complexo cristal violeta- iodo, que atravessa uma camada fina de peptidoglicano, uma vez que o álcool penetra e rompe a camada externa de LPSs; • as bactérias gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo, já que esse complexo não consegue ultrapassar a espessa camada de peptidoglicano. A coloração de Gram é, portanto, considerada uma técnica diferencial, haja vista que as bactérias gram-positivas são coradas de azul/púrpura, enquanto as gram- negativas ficam na tonalidade rosa/vermelho (LEVINSON, 2016; MADIGAN et al., 2016). 7 BACTÉRIAS ÁLCOOL-ACIDORRESISTENTES Algumas bactérias, como as dos gêneros Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia (este último gênero compreendendo somente as espécies patogênicas), têm algumas peculiaridades em suas paredes celulares. As paredes celulares dessas bactérias contêm alta concentração (60%) de um lipídio céreo hidrofóbico, denominado ácido micólico, o qual é unido ao peptidoglicano por um polissacarídeo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). A micobactéria causadora da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) tem grandes quantidades de ácido micólico, e sua parede celular está representada na Figura 9. A consistência cerosa e com propriedade hidrofóbica causada pelo ácido micólico tornam essas bactérias resistentes a muitos produtos químicos, como detergentes, ácidos fortes e alguns corantes, por essa razão, os corantes utilizados na coloração de Gram não conseguem penetrar e corar essas bactérias (a não ser que a parede de ácido micólico seja removida, corando-se, então, pelo método de Gram como gram-positivas). Apesar disso, elas podem ser coradas por carbol-fucsina, um corante de cor vermelha que penetra facilmente na parede celular depois do aquecimento. Após a penetração do corante carbol-fucsina, essas bactérias não são descoloradas por adição de álcool-ácido, já que esse corante tem mais solubilidade no ácido micólico. Devido a essa propriedade, essas bactérias são chamadas de bactérias álcool-acidorresistentes (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016). 25 Figura 9. Estrutura da parede celular da Mycobacterium tuberculosis. Uma das principais peculiaridades é a presença de ácido micólico. Fonte: Barros, Machado e Sprinz (2013, p. 67). As micobactérias (por exemplo, M. tuberculosis e M. leprae) têm forma de bacilo, sendo comumente denominadas como bacilos álcool-acidorresistentes (BAARs). As micobactérias crescem lentamente, duplicando-se a cada 18 h. O crescimento lento das micobactérias dificulta a cultura de amostras clínicas, pois é necessário que elas sejam incubadas em meio especial (por exemplo, meio de Löwenstein-Jensen)por 6 a 8 semanas, para só então serem consideradas negativas, se não houver crescimento bacteriano durante esse tempo. Dessa forma, é essencial realizar um esfregaço da amostra clínica (exame direto) antes de esperar as bactérias crescerem e, em seguida, corar a lâmina para observar a presença e contar os BAARs em microscópio óptico (exame chamado de baciloscopia), pois isto auxilia o diagnóstico clínico de micobactérias de forma mais rápida, o que demonstra a importância da etapa de coloração (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016). 26 8 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN Você acabou de aprender sobre as peculiaridades das bactérias álcool- acidorresistentes e entendeu o porquê elas não são usualmente coradas pela coloração de Gram, então, a partir de agora, você vai aprender, com mais detalhes como as bactérias álcool-acidorresistentes são coradas para que possam ser visualizadas em microscopia de campo claro. A técnica mais utilizada em laboratórios de bacteriologia clínica para corar as bactérias álcool-acidorresistentes é a coloração de Ziehl-Neelsen. A primeira etapa dessa coloração consiste na adição do corante vermelho carbol-fucsina na lâmina contendo o esfregaço previamente fixado, sendo necessário aplicar calor para aumentar a penetração e a retenção do corante. Após a lavagem com água, a lâmina é descolorada com álcool-ácido, nessa etapa, as bactérias álcool-acidorresistentes permanecem coradas com o corante vermelho, no entanto, as outras bactérias que não têm o ácido micólico em sua parece celular acabam sendo descoloridas (SOUZA, 2019). Dessa forma, um contracorante (coloração de contraste) deve ser adicionado (geralmente o azul de metileno) para corar as bactérias que se não são álcool- acidorresistentes. No microscópio óptico, as bactérias álcool-acidorresistentes se apresentam com cor rosa/vermelha, enquanto o fundo da lâmina e os outros microrganismos não acidorresistentes apresentam a cor do contracorante (geralmente azul) (BROOKS et al., 2014; MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Para corar as bactérias álcool-acidorresistentes, inicialmente se confecciona um esfregaço em lâmina do material clínico, que deve ser fixado pelo calor. Após, realiza-se a técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, que consiste nas etapas descritas a seguir. 1. Adição de carbol-fucsina (ou fucsina fenicada) na lâmina e aquecimento em chama até a emissão de vapores. 2. Após a lâmina esfriar, lavagem com água corrente ou deionizada. 3. Descoloração da lâmina com álcool-ácido 3% (etanol 95% e ácido clorídrico 3,0%), até que haja uma coloração rosa suave. 4. Lavagem com água corrente ou deionizada. 5. Adição do azul de metileno. 27 6. Lavagem com água corrente ou deionizada e secagem natural. Esta é uma coloração diferencial, já que coram somente as bactérias que contêm ácido micólico nas paredes celulares. Os patógenos com maiores demandas laboratoriais que necessitam ser corados por essa técnica são as micobactérias M. tuberculosis e a M. leprae, que são os agentes causadores das doenças tuberculose e hanseníase, respectivamente (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Fontes: Brasil (2013) e Brooks et al. (2014). 9.1.1 Outras técnicas de colorações de bactérias Além das colorações Gram e Ziehl-Neelsen, que são as mais rotineiramente realizadas, existem outras que também são utilizadas para corar bactérias em situações específicas. A coloração de Kinyoun é usada para diferenciar as espécies álcool-acidorresistentes (Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia) das não álcool-acidorresistentes, sendo uma opção quando se coram fracamente pelo método de Ziehl-Neelsen. Na realidade, a coloração de Kinyoun é uma modificação do teste de Ziehl-Neelsen, no qual se acrescenta uma etapa prévia ao adicionar uma fórmula contendo fucsina básica, fenol, etanol e água destilada (BROOKS et al., 2014). Os corantes podem ser utilizados individualmente em soluções aquosas ou alcoólicas para visualizar as bactérias de forma destacada e determinar a morfologia e arranjo. Como exemplos, destacamos os corantes azul de metileno, carbol-fucsina, cristal violeta e safranina (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Algumas bactérias (por exemplo, Klebsiella pneumoniae) produzem cápsula externamente à parede celular, o que é considerado um fator de virulência. A coloração negativa para cápsulas é um método utilizado para verificar se a bactéria em análise tem cápsula. O princípio da técnica é que a maioria dos corantes não consegue corar as cápsulas bacterianas, pois estas são solúveis em água, mas cora o restante do material, dessa forma, o fundo fica escuro e as cápsulas são visualizadas como halos incolores. É possível utilizar o corante, tinta da Índia, ou nigrosina, mas existem outros protocolos possíveis (por exemplo, método de Welch, que utiliza cristal violeta e sulfato de cobre) (BROOKS et al., 2014; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Algumas bactérias por exemplo, Bacillus cereus) produzem endósporos, que são estruturas dormentes intracelulares que conferem resistência bacteriana em 28 condições ambientais adversas, como calor extremo, radiação, produtos químicos fortes, dessecamento e carência nutricional. A maioria dos corantes (como os utilizados no Gram) não consegue penetrar na parede dos endósporos, não sendo, portanto, corados por eles, porém, existe uma técnica capaz de corar e detectar se a bactéria analisada tem endósporo, a qual é chamada de coloração de endósporo (Schaeffer-Fulton). Nessa técnica, aplica-se o corante verde malaquita com fixação em calor, o que ajuda a sua penetração na parede do endósporo, além de um contracorante (safranina) que cora as porções celulares que não são endósporos. Assim, o endósporo adquire uma cor verde, enquanto o restante adquire cor vermelho/rosa (MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Os flagelos, estruturas que conferem motilidade celular, são encontrados em algumas bactérias (por exemplo, Salmonella enterica). A detecção da presença de arranjos flagelares pode auxiliar no diagnóstico, entretanto, os flagelos são muitos finos, o que impede que sejam visualizadas no microscópio óptico sem uma coloração adequada. Existe um protocolo para coloração do flagelo, no qual se utiliza um mordente (suspensão coloidal de sais de ácido tânico) que aumenta o diâmetro do flagelo, seguido da aplicação do corante carbol-fucsina, sendo então possível a sua visualização em microscópio óptico (BROOKS et al., 2014). O Quadro 1 traz um resumo das diferentes técnicas de coloração utilizadas na área da Bacteriologia Clínica. Quadro 1. Principais colorações utilizadas na Bacteriologia Clínica 29 Fonte: Adaptado de Tortora, Funke e Case (2017). 30 9 MICROBIOTA NORMAL E MICROBIOMA O homem abriga em seu corpo uma variedade imensa e complexa de microrganismos, os quais buscam benefícios, como alimentos e ambiente ideal para o seu crescimento. Na maioria das vezes, esses microrganismos não trazem qualquer prejuízo à saúde humana, podendo, inclusive, beneficiá-la, como o fato de ajudar na proteção contra microrganismos patogênicos e na estimulação do sistema imune. Entretanto, sabe-se que, em algumas situações, esses microrganismos podem causar infecções oportunistas, ou até mesmo outros tipos de doença, o que demonstra a importância de se estudar esse ecossistema (SOUZA, 2019). 9.1 Microbiota normal O ser humano convive com muitos microrganismos permanentemente em seu corpo, desde o nascimento até a morte, sem que necessariamente causem doenças. Eles estão presentes na pele, nas mucosas e em outros locais do corpo humano, usufruindo dos nutrientes, da temperatura, da umidade, da pressão osmótica e do pH do hospedeiro para utilizarem como fonte de energia e se multiplicarem.Essa população de microrganismos são comensais (relação simbiótica), pois colonizam o ser humano sadio de forma harmônica em busca de benefícios, normalmente não trazendo problemas. Além disso, são denominados como microbiota normal ou flora normal, fazendo parte milhares de espécies de bactérias, arqueas, fungos, vírus e protozoários. Muitos deles podem, inclusive, trazer benefícios ao ser humano, como proteção contra infecções causadas por organismos patogênicos, digestão de alimentos, produção de vitaminas e estimulação da imunidade. Em termos evolutivos, os microrganismos que compõem a microbiota normal são mais adaptados ao homem do que aqueles microrganismos extremamente patogênicos, pois estes podem levar a óbito, o que não é vantajoso para o microrganismo (MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Além dos microrganismos que formam a microbiota normal (de forma permanente), existem alguns que colonizam o homem de forma transitória (permanecem por horas, dias ou semanas) e normalmente não são patogênicos, os quais são chamados de microbiota transitória (BROOKS et al., 2014). 31 10.1.1 Sítios de colonização da microbiota normal Durante a vida uterina, o feto humano vive em um ambiente estéril, ou seja, não é exposto nem é colonizado por microrganismos. Quando nasce, o recém-nascido fica exposto a diversas populações de microrganismos provenientes da mãe e do ambiente, sendo então colonizado gradativamente. Caso o parto seja normal, a pele do recém-nascido é colonizada pela microbiota fecal da mãe, que contamina o canal do parto, porém, se o parto for por cesariana, não há contato com a microbiota fecal, o que torna a colonização da pele mais tardia. Uma questão importante do parto normal é o risco de infecção por Streptococcus agalactiae, que pode causar meningite bacteriana e sepse neonatal. Os recém-nascidos nascidos por parto normal podem adquirir essa infecção um pouco antes ou durante o parto, caso as mães sejam portadoras dessa bactéria em seu trato genital, ou posteriormente, devido ao contato com a mãe colonizada e com a equipe de profissionais da saúde da maternidade ou por outras fontes. Essa infecção pode ser prevenida. Se a mãe for portadora, realiza- se uma profilaxia com os antibióticos ampicilina ou penicilina durante o parto (KASPER; FAUCI, 2015; MADIGAN et al., 2016; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Após a colonização da pele do recém-nascido pela microbiota normal, há a colonização da cavidade oral e dos tratos respiratório superior e gastrintestinal por meio do aleitamento. A microbiota intestinal dos bebês que se alimentam pelo leite materno é diferente das que se alimentam por mamadeira, sendo que os primeiros têm maior número de estafilococos e bifidobactérias e menor quantidade de clostrídeos, enterococos, Klebsiella e Enterobacter, além de menor frequência de E. coli portadoras de antígeno K1, que pode causar bacteremias e meningite no recém- nascido. Ainda sobre o aleitamento, a prática do aleitamento cruzado (quando uma mulher amamenta o filho de outra) representa sérios riscos ao bebê, pois pode transmitir doenças infectocontagiosas (como HIV — vírus da imunodeficiência humana — e Hepatite B), sendo contraindicado pela OMS (Organização Mundial de Saúde). É importante ressaltar que o Banco de Leite Humano (BLH) não traz riscos ao bebê, pois o leite materno da doadora é pasteurizado (BOECHAT, 2019; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Ao longo da vida, as populações da microbiota normal vão se alterando, podendo ser influenciados por fatores como estado de saúde, idade, hormônios, dieta, 32 higiene pessoal, estresse, clima, estilo de vida, uso de antibióticos, entre outros. A diversidade da microbiota é muito grande, inclusive varia entre os sítios (locais) de colonização no corpo humano e mesmo entre diferentes indivíduos (MADIGAN et al., 2016). Alguns tecidos humanos são naturalmente estéreis, exceto pela passagem de microrganismos transitórios ou nas situações em que há uma doença infecciosa. Os sítios estéreis são: trato respiratório inferior (traqueia, brônquios e pulmões), Sistema Nervoso Central (SNC), sangue, baço, fígado, rins e bexiga (LEVINSON, 2016). Por outro lado, existem sítios não estéreis que são colonizados pela microbiota normal. O Quadro 2 traz as principais bactérias da microbiota normal e suas localizações (sítios não estéreis), mas você deve levar em consideração que podem existir outras espécies bacterianas nesses sítios (além de algumas espécies de fungos e protozoários), os quais nem sempre estão presentes em todos os indivíduos (MURRAY et al., 2004). Quadro 2. Bactérias da microbiota normal e sua localização Fonte: Adaptado de Murray et al. (2004). 33 A microbiota normal da pele é bem diversificada e a sua composição depende da área anatômica. A bactéria Staphylococcus epidermidis é a bactéria predominante da pele, mas outras também importantes, como outros estafilococos coagulase negativos, Staphylococcus aureus, os difteroides (por exemplo, Corynebacterium e Propionibacterium), Acinetobacter, entre outros. Além disso, a pele facilmente abriga uma microbiota transitória, já que constantemente está em contato com o ambiente externo (BROOKS et al., 2014). A microbiota da cavidade oral tem uma diversidade complexa, já que contém um ambiente propício para o crescimento de microrganismos (é úmida, quente e constantemente tem a presença de alimentos). As bactérias podem estar presentes na língua, nos dentes, na bochecha e na gengiva, como, por exemplo, várias espécies de Streptococcus, Actinomyces, Lactobacillus e Corynebacterium. Apesar de a saliva conter nutrientes microbianos, ela é composta por algumas substâncias que funcionam como antimicrobianos (por exemplo, a enzima lisozima), o que a torna não muito ideal para o crescimento bacteriano (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Ao contrário do trato respiratório inferior de pessoas sadias, que é geralmente estéril, o trato respiratório superior (nasofaringe, cavidade oral, laringe e faringe) não é estéril, tendo uma microbiota normal diversificada. O nariz produz secreções nasais que podem matar ou inibir o crescimento de alguns microrganismos e ainda podem removê-los pela ação mecânica de expectoração do muco e do movimento ciliar, entretanto, alguns microrganismos sobrevivem. A microbiota normal do nariz é composta, principalmente, por Streptococcus e Staphylococcus, sendo de grande importância as espécies Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. Já as bactérias mais encontradas na microbiota normal da garganta são: Streptococcus viridans, Streptococcus mutans, S. epidermidis e algumas espécies de Neisseria (LEVINSON, 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). As microbiotas dos ouvidos externos são compostas, principalmente, pelo Staphylococcus coagulase negativo. Eles também podem ser colonizados por microrganismos encontrados normalmente na pele e outros potencialmente patogênicos, como Pseudomonas aeruginosa e Streptococcus pneumoniae (MURRAY et al., 2004). As conjuntivas dos olhos têm uma microbiota semelhante à da pele, sendo alguns exemplos as bactérias Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium e 34 Micrococcus. As lágrimas e o ato de piscar ajudam na eliminação ou na inibição do crescimento de alguns microrganismos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). O estômago produz o ácido clorídrico, que é muito ácido (pH 2), o que dificulta o crescimento de muitos microrganismos, entretanto, algumas bactérias sobrevivem a esse ambiente ácido, como Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria e Fusobacteria (MADIGAN et al., 2016). A porção do duodeno do intestino delgado contém uma microbiota normal, semelhante à do estômago, já que também é muito ácida. Já a porção do íleo (pH se torna menos ácido) tem uma maiorvariedade e mais bactérias, sendo principalmente colonizada pelas bactérias Peptostreptococcus, Porphyromonas e Prevotella (MADIGAN et al., 2016). O colo do intestino grosso é um ambiente extremamente rico para muitas bactérias, já que elas utilizam os nutrientes provenientes da digestão alimentar. Assim, é o sítio do corpo com o maior número de microrganismos, sendo a maioria composta por bactérias anaeróbias (96 a 99%). Como exemplos de microbiota normal do intestino grosso, é possível citar as bactérias Bacteroides fragilis e Bifidobacterium e a família Enterobacteriaceae por exemplo, Escherichia coli, Klebsiella e Proteus) (BROOKS et al., 2014). Em relação às microbiotas do trato urogenital, ao contrário dos rins e da bexiga, que são sítios normalmente estéreis em pessoas saudáveis, a parte proximal da uretra e a vagina têm microbiota normal. A urina ajuda na eliminação mecânica de diversos microrganismos, além desta e da ureia serem antimicrobianos naturais devido aos seus pHs. A uretra anterior de ambos os sexos é colonizada, principalmente, por Lactobacillus, Staphylococcus coagulase negativo e Streptococcus. Já a vagina é colonizada principalmente pelos Lactobacillus, os quais ajudam na manutenção do pH normal vaginal, inibindo o crescimento de microrganismos patogênicos quando há equilíbrio. Outras espécies também encontradas são Staphylococcus, Streptococcus e Gardnerella vaginalis (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). 10.1.2 Propriedades patogênicas dos microrganismos Segundo Tortora, Funke e Case (2017), a patogenicidade é a capacidade que os microrganismos têm de causar doenças ao superarem o sistema imunológico do 35 hospedeiro, enquanto a virulência se refere ao grau ou à extensão da patogenicidade (refere-se a uma capacidade quantitativa). Existem algumas propriedades que indicam que um microrganismo tem potencial de patogenicidade. • Adesão (ou aderência ou fixação) é a capacidade de as bactérias se aderirem às células epiteliais do hospedeiro ou a superfícies, formando biofilmes. Esta é uma etapa importante para causar infecção, pois, caso contrário, a bactéria pode ser eliminada do organismo. Existem alguns fatores de adesão que podem estar presentes na bactéria, como proteínas de aderência, ácido lipoteicoico, cápsula, fímbrias, pili e flagelos (BROOKS et al., 2014; MADIGAN et al., 2016). • Invasão é a capacidade que o microrganismo tem de penetrar nas células ou nos tecidos do hospedeiro, de forma a permitir a sua disseminação e a propagação da doença (BROOKS et al., 2014; MADIGAN et al., 2016). • Toxicidade é a capacidade que o microrganismo tem de produzir a toxina que causa doença no hospedeiro. Os microrganismos podem produzir exotoxinas, que são as proteínas tóxicas liberadas pelos patógenos enquanto eles crescem (por exemplo, enterotoxinas produzidas pelas bactérias Clostridium perfringens e Bacillus cereus que causam intoxicação alimentar) ou podem produzir endotoxinas — que são os lipopolissacarídeos (LPS) tóxicos que causam febre, hipotensão e choque séptico —, as quais são produzidas somente pelas bactérias gram-negativas, já que somente elas têm LPS em suas membranas externas (BROOKS et al., 2014; MADIGAN et al., 2016). • Resistência a antimicrobianos e a desinfetantes: microrganismos com resistência a antimicrobianos e desinfetantes comumente utilizados são mais virulentos e têm maior potencial de causar doença (BROOKS et al., 2014). 10.1.3 Infecções oportunistas Conforme você aprendeu acima, existem microrganismos que podem colonizar o homem de forma permanente (microbiota normal) ou de forma transitória (microbiota transitória), normalmente não causando doenças em indivíduos sadios. Entretanto, há algumas situações (por exemplo, baixa imunidade) em que determinados microrganismos podem causar uma doença infecciosa ou tóxica no ser humano, os 36 quais podem ser considerados patógenos estritos ou patógenos oportunistas (LEVINSON, 2016; MURRAY et al., 2004). Patógenos estritos são aqueles microrganismos que sempre estão associados à doença quando estão presentes no homem, como, por exemplo, a Mycobacterium tuberculosis — agente patogênico da tuberculose —, e a Neisseria gonorrhoeae, que é o agente patogênico da gonorreia (LEVINSON, 2016; MURRAY et al., 2004). Por outro lado, os patógenos oportunistas são aqueles microrganismos que dificilmente causam infecções em hospedeiros imunocompetentes (i.e., em indivíduos saudáveis), mas podem causar infecções oportunistas graves em pacientes imunocomprometidos (indivíduos com baixa imunidade), como, por exemplo, pacientes com câncer, pacientes transplantados (os quais utilizam medicamentos que induzem a imunossupressão), ou com síndrome da imunodeficiência adquirida (aids, em inglês acquired immunodeficiency syndrome). Esses microrganismos podem fazer parte da microbiota normal ou não. Quando ocorre um desequilíbrio no corpo do hospedeiro, esses microrganismos podem se multiplicar de maneira descontrolada, ou serem introduzidos em locais que são estranhos do seu hábitat normal, ou mesmo em sítios estéreis, causando uma infecção oportunista. A bactéria E. coli, por exemplo, faz parte da microbiota normal do intestino grosso. Em geral, ela não causa doença em indivíduos saudáveis nesse local, porém, caso consiga migrar para outros locais do corpo, pode causar infecção (por exemplo, no trato urinário, ela causa infecção urinária, ao passo que, em feridas da pele, causa abscessos). Um outro exemplo é a bactéria S. epidermidis, que faz parte da microbiota normal da pele e nesse local normalmente não gera doença em indivíduos saudáveis, apesar disso, ela causa doença infecciosa se migrar para as válvulas cardíacas artificiais ou para as articulações prostéticas (LEVINSON, 2016; MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Um dos principais benefícios que a microbiota normal confere ao hospedeiro é a proteção contra infecções causadas por microrganismos potencialmente patogênicos. Esse benefício acontece quando há um equilíbrio entre a microbiota normal e os microrganismos potencialmente patogênicos, ou seja, a microbiota normal impede o crescimento excessivo desses microrganismos ao competirem por nutrientes e oxigênio, ao produzirem substâncias prejudiciais aos microrganismos invasores e ao alterarem o pH do local (fenômeno chamado de antagonismo 37 microbiano ou exclusão competitiva). Entretanto, existem situações que causam um desequilíbrio entre a população da microbiota normal e dos microrganismos potencialmente patogênicos, sendo que esses últimos se multiplicam de maneira descontrolada, podendo resultar no aparecimento de uma doença infecciosa (MADIGAN et al., 2016). O uso de antimicrobianos pode inibir o crescimento ou reduzir as bactérias normais, favorecendo o crescimento de microrganismos potencialmente patogênicos e, consequentemente, a instalação de infecções oportunistas. As bactérias Lactobacillus, por exemplo, fazem parte da microbiota normal da vagina e, por manterem um pH ácido, são essenciais para conservar o equilíbrio entre a microbiota normal e os microrganismos potencialmente patogênicos. O uso de antimicrobianos pode eliminar os Lactobacillus da vagina, tornando o pH vaginal neutro, situação em que os microrganismos oportunistas crescem e se tornam predominantes, o que causa infecções oportunistas, como a bactéria Gardnerella vaginalis, que provoca a vaginose bacteriana (BROOKS et al., 2014; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). Um conceito médico importante que você deve conhecer é o estado de portador, no qual um indivíduo abriga um patógeno em potencial sem apresentar sintomas clínicos (a presença da bactéria Chlamydia trachomatis pode ser assintomática em algumas pessoas), ou quando o indivíduo se curou de uma doença infecciosa ativa, mas ainda carrega o patógeno em seu corpopor um tempo. Por não saber que está infectado ou porque o patógeno ainda está em seu corpo mesmo após o fim da doença infecciosa ativa, o portador pode transmitir o patógeno para outro indivíduo e causar, neste, uma doença sintomática (LEVINSON, 2016; MURRAY et al., 2004). O Quadro 3 traz exemplos sobre as bactérias oportunistas ou patogênicas estritas mais comuns e as respectivas localizações em que causam infecções. 38 Quadro 3. Bactérias oportunistas ou patogênicas estritas e sua localização. Fonte: Adaptado de Murray et al. (2004). 10.1.4 Relações harmônicas com fungos O equilíbrio da microbiota normal não ocorre apenas entre espécies bacterianas, como os exemplos vistos anteriormente, mas também entre bactérias e fungos, que normalmente convivem em uma relação harmônica. Quando ocorre um desequilíbrio da microbiota normal, podem ocorrer infecções oportunistas causadas por fungos (BROOKS et al., 2014). Muitas vezes, a infecção oportunista causada pelo fungo ocorre quando há uma outra doença pré-existente grave comprometendo a imunidade do indivíduo. A C. albicans, por exemplo, também faz parte da microbiota normal da pele e pode ser introduzida na corrente sanguínea por intermédio da perfuração da pele com agulha (por exemplo, uso de cateteres ou de fármacos intravenosos), o que causa infecção sistêmica em pacientes imunocomprometidos (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016). 39 9.2 Microbioma e sua relação com a saúde humana O homem convive de forma harmônica com trilhões de microrganismos que habitam o seu corpo, conforme você aprendeu nos tópicos anteriores. O número de bactérias que habitam o corpo humano supera, em aproximadamente 10 vezes, o número de células humanas. O conjunto de todas as comunidades de microrganismos que habitam o corpo humano é definido como microbioma humano (TURNBAUGH et al., 2007). Em 2007, foi lançado o Projeto Microbioma Humano (HMP, do inglês Human Microbiome Project), que é uma associação internacional de grupos interdisciplinares de pesquisas, cujos objetivos principais incluem caracterizar todos os microrganismos que compõem o microbioma humano e entender o papel desse ecossistema com relação à saúde e às doenças humanas. Esse projeto foi lançado como uma extensão do Projeto Genoma Humano, já que é possível dizer que a composição genética humana engloba não só o genoma humano, mas também os genomas de todos os microrganismos que o habitam (TURNBAUGH et al., 2007). A Microbiologia tradicional não consegue isolar a maioria dos microrganismos que compõem o microbioma humano, pois eles precisam de condições de crescimento muito específicas e difíceis de serem reproduzidas em laboratório. Com o avanço de novas tecnologias que permitem o sequenciamento de DNA em larga escala, os cientistas do HMP conseguiram analisar a coleção de genomas de todos os microrganismos que compõem o microbioma humano (análise metagenômica). Eles analisaram amostras da pele, da cavidade oral, da cavidade nasal e dos tratos urinário e gastrintestinal de 300 indivíduos adultos saudáveis (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH COMMON FUND, 2019; TURNBAUGH et al., 2007). Nesses estudos, observou-se que o microbioma humano é muito mais complexo do que o previsto no início do projeto. Um dos principais achados do HPM é que o microbioma varia muito em número e composição de espécies entre diferentes indivíduos, inclusive entre os saudáveis. Essas diferenças podem ser explicadas por diversos fatores, como ambiente, dieta, grupo étnico, genética do hospedeiro e exposição microbiana precoce, entre outros. Mesmo depois do anúncio de que completaram o mapeamento do microbioma humano, em 2012, ainda são realizados 40 estudos epidemiológicos que demonstram a importância do entendimento desse ecossistema na saúde humana (HUTTENHOWER et al., 2012; NELSON et al., 2010). Uma das associações mais compreendidas a partir do HPM foi a associação entre a microbiota do trato gastrintestinal humano e as doenças inflamatórias intestinais, como a colite ulcerativa e a doença de Crohn. A bactéria Clostridium difficile faz parte da microbiota normal do intestino grosso e normalmente não causa doença em situações normais, já que outras bactérias da microbiota competem por nutrientes e produzem bacteriocinas, o que inibe o seu crescimento, entretanto, o uso de antibióticos pode matar as outras bactérias e causar um desequilíbrio na microbiota gastrintestinal, com consequente crescimento da C. difficile. O estudo de Li et al. (2012) observou que indivíduos com colite ulcerativa continham C. difficile de forma mais predominante em sua microbiota intestinal em comparação aos indivíduos saudáveis. Esses achados sugerem que o desequilíbrio da microbiota intestinal (fenômeno chamado de disbiose) é a causa da doença colite ulcerativa. Algumas pesquisas envolvendo camundongos demonstraram que a composição da microbiota gastrintestinal é diferente entre os animais magros e os obesos, principalmente na composição de bactérias dos filos Bacteroidetes e Firmicutes e de arqueias metanogênicas (Figura 10). Outros estudos demonstraram que a transferência da microbiota fecal de roedores obesos para roedores magros gera um aumento de gordura corporal nesses últimos, o que indica que a composição da microbiota gastrintestinal pode influenciar a porcentagem de gordura corporal e o ganho de peso. Também foram realizadas pesquisas com humanos, as quais demonstraram que existe uma forte associação entre a obesidade e a microbiota intestinal humana, já que desvios na composição de microrganismos associados à composição corporal magra estão relacionados ao aumento da massa corporal gorda e a doenças metabólicas. Apesar disso, ainda não está claro se a alteração da microbiota gastrintestinal é uma causa ou uma consequência da obesidade (MADIGAN et al., 2016; MARUVADA et al., 2017). Outros estudos têm focado na relação entre o microbioma humano e o câncer. Alguns demonstraram que os metabólitos tóxicos produzidos por alguns microrganismos que compõem o microbioma humano podem contribuir para o surgimento do câncer ou a progressão tumoral, mesmo em sítios distantes de seu hábitat, ou ainda que esses microrganismos podem migrar para outros locais e iniciar 41 o processo de carcinogênese. Por outro lado, há pesquisas que correlacionaram o desequilíbrio da microbiota intestinal com desordens inflamatórias e vários tipos de câncer. A bactéria Helicobacter pylori, presente na mucosa gástrica na metade da população mundial, por exemplo, induz uma gastrite crônica que pode progredir para o carcinoma gástrico (RAJAGOPALA et al., 2017). Figura 10. Diferenças nas comunidades microbianas gastrintestinais entre camundongos magros e obesos. Os camundongos obesos têm menos bactérias do filo Bacteroides, mais bactérias do filo Firmicutes e mais arqueias metanogênicas em relação aos camundongos magros. Fonte: Madigan et al. (2016, p. 690). Muitos outros estudos têm sido realizados para que seja possível entender o papel desse ecossistema na saúde humana, como, por exemplo, a associação do microbioma com o desenvolvimento do diabetes tipo 2 e a relação da mudança da microbiota vaginal durante a gravidez com os partos prematuros e os abortos. A diversidade do microbioma é um ponto fundamental para se entender o papel desses microrganismos na saúde e no desenvolvimento de doenças. Com os resultados que o estudo do microbioma humano têm demonstrado, o monitoramento e a manipulação do microbioma humano para melhorar a saúde humana pode ser uma realidade na Medicina do futuro (PETERSON et al., 2009). 10 MEIOS DE CULTURA E CARACTERÍSTICAS BACTERIANAS Uma das práticas mais rotineiras de um laboratório de bacteriologia clínica é o cultivo de bactérias em meios de cultura. Os meios de cultura
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