Histologia- Introdução

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Histologi�
-É o estudo das células e dos tecidos do corpo e de como essas estruturas se organizam para
constituir os órgãos.
-seu estudo é realizado com auxílio de microscópios;
hystos= tecidos Logos= estudo
-estudo dos tecidos;
Quais são os níveis de organização para estudo?
-Tecidos= conjunto de células especializadas que atuam de modo integrado,
desempenhando funções definidas;
formados por : Células + Matriz Extracelular ( MEC)
-Mec - produzidos pelas células - tem uma grande interação com elas - por isso é uma
unidade contínua;
-Tecidos fundamentais : são formados por várias células características daquele tecido;
diferenciando do tipo de célula, estruturas, funções;
-Órgãos : Formados pelas associações de vários tecidos;
➔ Métodos de Estudo em Histologia
➔ Preparação de Tecidos ou Espécimes1 para Exame Microscópico
-pequena dimensão das células e dos componentes da MEC faz com que a histologia
dependa do uso de microscópios;
- procedimento mais usado >> Microscópio de Luz >> preparação de cortes histológicos;
-conhecimento dos instrumentos > fundamental;
-Microscópio Óptico >> imagem se forma a partir dos raios luminosos de um feixe de luz
que atravessou uma estrutura;
-por, na maioria, os tecidos e órgãos serem espessos > não possibilitam a passagem
adequada do feixe de luz para formação da imagem >> devem ser fatiados em secções ou
cortes histológicos muito delgados que são colocados sobre lâminas de vidro >>
Micrótomos ;
antes os tecidos e órgãos necessitam passar por uma série de tratamentos até ir para o
Microscópio óptico
★ Tipos de preparação
➢ A fresco : observação ao microscópio de células, pequenos organismos vivos ou
fragmentos de tecidos vivos, num meio líquido o mais próximo possível do meio
natural desses organismos.
finalidade >>> é permitir a observação de estruturas “in vivo”, de modo a poder
observar manifestações funcionais.
➢ Permanente : feitos para durarem muitos anos, dependendo de como foram tratados
os objetos (fatias, células etc.) da lâmina;
★ ETAPAS
fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte em fatias finas), coloração e
montagem de lâminas
1. COLETA do material ou amostra
- remover amostras de tecido de um determinado organismo.
-Biópsia: Coleta realizada por meio de cirurgia, quando o animal está vivo.
- Necrópsia: Coleta realizada após a morte do animal.
- Vivissecção: é o ato de dissecar um animal vivo com o propósito de realizar
estudos >> CRUELDADE;
1 amostra;
2. FIXAÇÃO
-Deve ser realizada o mais rápido possível, após a retirada da amostra;
-paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os tratamentos
posteriores
-o agente fixador usado deve:
*Evitar a autólise > digestão dos tecidos por enzimas presentes nas próprias células;
*Endurecer as células para que elas resistam melhor as etapas seguintes da técnica;
*preservar em grande parte a estrutura e a composição molecular dos tecidos
*Impedir a atividade e proliferação de bactérias;
-fixação física: através de calor ou frio rápido (congelamento) >> usado criostato para
corte h.;
usados em hospitais > peças cirúrgicas > resultados rápidos;
possibilita a preparação rápida de cortes sem passar pelo longo procedimento de
desidratação e inclusão descrito anteriormente >> habitualmente utilizado em hospitais
para que seja possível analisar, em poucos minutos, espécimes obtidos durante
procedimentos cirúrgicos;
útil para o estudo histoquímico de enzimas e de outras proteínas em cortes
histológicos (não inativa a maioria das enzimas e mantém muitas proteínas em suas
conformações naturais e em seus locais originais)
-fixação química: obtida quando se utilizam substâncias químicas capazes de formar
reações com os sítios das biomoléculas, estabilizando-as e impedindo a alteração
tecidual, tanto química quanto física >> usado o micrótomo p/ corte h.; mais comum;
Como demora algum tempo para que o fixador se difunda de maneira rápida e
completa pelo interior dos fragmentos, fragmento deve ser cortado em outros menores
antes de ser imerso no fixador >> torna-se mais fácil a penetração do fixador no
fragmento e garante-se melhor preservação da sua estrutura;
volume de fixador empregado deve ser 20 a 30 vezes maior que o volume da amostra;
ex. formol tamponado 4% ou 10% durante no mínimo 24 horas(mais
usado/formaldeído); glutaraldeído2;
-microscópio eletrônico : em virtude da alta resolução oferecida > necessário um
cuidado muito maior na fixação para mais bem preservar detalhes da ultraestrutura
das células e da matriz > necessário uma fixação dupla, usando uma solução de
glutaraldeído tamponado, seguida por uma segunda fixação em tetróxido de ósmio,
que preserva e fornece contraste aos lipídios e proteínas;
2 r reagem com os grupos amina (NH2 ) das proteínas;
3. INCLUSÃO OU EMBEBIÇÃO
-após a fixação, tecido deve ser infiltrado com substâncias que lhes proporcionem uma
consistência rígida p/ realizar os cortes delgados;
-são usados utilizados para esse fim a parafina líquida (microscopia óptica) e algumas
resinas de plástico (M. Óptica e eletrônica);
-precedido por 2 etapas: desidratação e clareamento
necessário p/ que a parafina consiga se infiltrar no tecido porque a parafina é um lipídio
e não é solúvel em água, por isso é necessário tirar a água do tecido primeiro para que
ela se infiltre nele (desidratação) através de banhos de etanol 70% até 100% (há o
tempo certo para ficar em cada % de álcool)
depois da desidratação deve-se usar uma substância3 que seja miscível tanto no meio
de inclusão( parafina ou resina ) quanto no álcool; essa substância deixa o tecido
transparente por substituir o álcool (clareamento ou diafanização);
Para a inclusão em parafina: xilol e o toluol;
material em seguida, tecidos são colocados em recipientes contendo parafina líquida a 56 a
60ºC é colocado em estufa na mesma temperatura >> parafina derrete >> calor causa a
evaporação do solvente orgânico, e os espaços existentes dentro dos tecidos tornam-se
preenchidos com parafina;
Depois de os fragmentos serem retirados da estufa, a parafina solidifica a T° ambiente e
eles se tornam rígidos junto com o tecido formando blocos;
-blocos de parafina que contêm os tecidos são então levados a um micrótomo, onde são
seccionados por uma lâmina de aço ou de vidro, de modo a fornecer cortes de 1 a 10
micrômetros de espessura
3 geralmente um solvente orgânico;
-Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar sobre uma superfície de
água aquecida > BANHO MARIA
(distendidos em água aquecida a 56º C em aparelho aquecedor com termostato para evitar
micro dobras no material)
tem que prestar atenção na identificação
prestar atenção na posição do corte
4. PESCAGEM da amostra
-Consiste em mergulhar a lâmina na água e coletar o material esticado sobre a lâmina.
-Em seguida a lâmina é colocada na estufa para que seja feita a secagem, e a parafina
derreter para o tecido se colar mais na lâmina, a fusão da parafina impregnada no tecido e
evitar o aparecimento de micro dobras;
5. COLORAÇÃO
-antes precisa hidratar de novo para que consiga corar;
- vai ser usado xilol (5 minutos cada/limpam a parafina p/ retirar do tecido) e álcoois de %
decrescente (3 minutos cada), depois a hidratação com água corrente (10 minutos), corante
(Hematoxilina 45 segundos a 1 minuto e tirar 3 segundos antes de fechar o tempo), lavagem
em água corrente(5 minutos), corante (eosina 25 segundos e tirar 3 segundos antes),
lavagem (em água parada) e álcool pós eosina (6 segundos tirando e botando), depois botar
5 minutos no álcool absoluto pós eosina, e dps deixar o tecido 5 minutos em cada
quantidade de xilol (3 frascos) e depois pegar a resina e pingar na lamínula e deixar secar e
pegar o tecido e pingar na lâmina e deixar secar (pingar na parte do tecido pra cima/se tiver
alguma bolha no tecido vai apertando com delicadeza para retirá-la)
-tecidos são incolores >> devem ser coradas;
-métodos de coloração que tornam evidentes os vários componentes dos tecidos, das
células e da MEC;
-Muitoscorantes4 se comportam como substâncias de caráter ácido ou básico e tendem a
formar ligações eletrostáticas (salinas) com componentes ionizados dos tecidos;
- Corantes ácidos: possuem carga elétrica negativa (-), com afinidade por componentes
básicos do tecido (carga +);
tecidos ou estruturas que se coram com corantes ácidos > acidófilos
ex. citoplasma e matriz extracelular ; corante ácido é a eosina (rosada); orange G; fucsina
ácida; mitocôndrias , grânulos de secreção , proteínas citoplasmáticas e colágeno;
-Corantes básicos: possuem carga elétrica positiva (+) com afinidade por componentes
ácidos dos tecidos (-);
-tecidos que se coram com corantes básicos > basófilos
4 compostos orgânicos aromáticos e coram seletivamente os componentes teciduais, como as células
e a matriz extracelular;
ex. núcleo; corante básico hematoxilina(azul); azul de toluidina; azul de metileno;
ácidos nucleicos , glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas;
-combinação de hematoxilina e eosina (HE) > mais usada;
-hematoxilina > cora em azul ou violeta o núcleo das células e outras estruturas ácidas (tais
como porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz extracelular da cartilagem hialina )
-eosina > cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa;
-tricrômicos (p. ex., os corantes de Mallory e de Masson) > mostram muito bem o núcleo e o
citoplasma, ajudam a diferenciar colágeno de músculo liso;
-Em muitos procedimentos (ver Imunocitoquímica) os resultados de uma reação são
evidenciados por um precipitado ou por um corante fluorescente, mas as células e os seus
limites não são visíveis
(usado um contracorante – corante aplicado a um corte apenas para tornar possível a
visualização das células ou dos núcleos)
-Coloração pela prata ou metal – Algumas substâncias intra e extracelulares promovem a redução
do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras reticulares dos
linfonodos, por exemplo;
(muito usado para estudar tecido nervoso);
6. MONTAGEM
-Após a coloração, coloca-se uma gota de resina sintética (Entellan) sobre o corte ou sobre
uma lamínula >> Esta é então, colocada e comprimida sobre o corte, de modo a espalhar-se
a resina em fina camada entre a lâmina e lamínula;
-Após a secagem, as lâminas podem ser observadas ao microscópio de luz;
se eu quiser ver outra estrutura e ela ta corada não serve
eu pego outro bloco corto faço os processos e coloro com outra substância de acordo com a
estrutura que vc quer ver
➔ Microscopia de luz
-preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa o espécime (transiluminação);
-composto de partes mecânicas e ópticas;
-ópticas: lentes condensadoras, objetivas e oculares;
-condensador concentra a luz de uma lâmpada e projeta um feixe luminoso sobre o espécime;
- objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma imagem aumentada do espécime em
direção à ocular;
-ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta na retina, em uma tela, em uma câmera
fotográfica ou em um detector eletrônico;
-ampliação total: aumento da objetiva x aumento da ocular;
➢ poder de resolução:
-menor distância entre duas partículas ou entre duas linhas, distância essa que possibilita que elas
sejam vistas como dois objetos separados;
-permite a obtenção de uma imagem aumentada e com muitos detalhes;
-poder máximo do m.óptico é de aproximadamente 0,2 μm;
-torna possível a obtenção de boas imagens aumentadas até 1.000 a 1.500 vezes;
(Objetos menores ou mais delgados que 0,2 μm (como, por exemplo, a membrana da célula ou um
filamento de actina ) não podem ser distinguidos com esse instrumento)
o que determina a riqueza de detalhes da imagem é o limite de resolução de um sistema óptico, e
não seu poder de aumento
-depende essencialmente da objetiva;
(ocular apenas aumenta a imagem)
➢ Microscopia de contraste de fase e de contraste diferencial de interferência
-usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes;
-possibilitam a observação de células e cortes não corados;
(difíceis de serem observados com detalhes, pois todas as partes da amostra têm quase a mesma
densidade óptica5)
-transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade
luminosa;
-estruturas celulares apareçam na fase positiva ( escuras ) ou na fase negativa ( claras );
5 quantidade de matéria presente;
➢ Microscopia Confocal
-combina a microscopia de fluorescência com a análise eletrônica de imagens para obter imagens
com contrastes e detalhes aumentados;
-Infelizmente a imagem fornecida pelos microscópios não costuma ser composta de um único plano
>> há superposição de vários planos >> causando certo grau de deterioração da imagem;
-torna possível focalizar um plano muito delgado do espécime.
- forma-se uma imagem nítida do plano focalizado e, simultaneamente, a ela está superposta à
imagem "borrada" dos outros planos da célula;
-O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito;
-A imagem coletada do espécime deve passar por um orifício muito pequeno;
- definição do objeto focalizado torna-se melhor e a localização de componentes do espécime pode
ser feita com muito mais precisão que ao microscópio de luz;
(1) a iluminação é provida por uma fonte de laser;
(2) como esta fornece um ponto de iluminação muito pequeno, o feixe deve ser varrido sobre o
espécime para possibilitar a observação de uma área maior;
(3) o componente do espécime que é de interesse deve ser marcado com uma molécula fluorescente
(isso significa que uma secção rotineira não pode ser estudada);
(4) a luz usada para formar uma imagem é aquela porção que é refletida pelo espécime; (5) a luz
refletida é capturada por um detector, em que o sinal é amplificado eletronicamente para ser visto em
um monitor.
-Como somente um plano focal muito delgado é focalizado de cada vez (também chamado de
secção óptica), é possível depois reunir os vários planos de um espécime e reconstruí-los em um
objeto tridimensional;
➢ Microscópio de Interferência
-baseia-se em princípios semelhantes aos do microscópio de fase, porém tem a vantagem de
fornecer resultados quantitativos.
-as variações de fase podem se refletir em mudanças de cor tão acentuadas que as células vivas
parecem coloridas.
- tipo especial é o chamado microscópio de Nomarski, no qual um raio de luz único atravessa o
material e a objetiva e, em seguida, se divide em dois raios que interferem entre si por meio de um
prisma birrefringente. Também são usados filtros que atuam como polarizadores e analisadores e
um prisma compensador situado no condensador. A imagem resultante apresenta um relevo
característico >> particularmente útil para o estudo das células vivas durante a mitose.
➢ Microscopia de fluorescência
-usado para o estudo da distribuição intracelular de moléculas;
-Quando algumas substâncias são irradiadas por luz de um determinado comprimento de onda, elas
emitem luz com um comprimento de onda mais longo >> Fluorescência;
-as secções são iluminadas por uma fonte de luz de mercúrio sob alta pressão.
-um corante fluorescente é uma molécula que absorve luz em um comprimento de onda e emite luz
em um segundo comprimento de onda >> usado para marcar a molécula de interesse dentro de
células fixadas ou vivas >> Substâncias fluorescentes que tenham afinidade por moléculas
encontradas nas células ou na matriz extracelular podem ser usadas como corantes fluorescentes;
-essa fluorescência é detectada pela iluminação da amostra com luz no comprimento de onda que
excita o corante, seguida do uso de filtros adequados para detectar o comprimento de onda
específico que o corante emite.
- as substâncias fluorescentes são observadas como objetos brilhantes e coloridos;
ex. de corantes fluor. - alaranjado de acridina, que pode combinar-se com o DNA e o RNA.
-Outra aplicação importante resulta da combinação química de substâncias fluorescentes com
moléculas que se ligam especificamente a componentes das células e dos tecidos, tornando possível
assim a identificação desses componentespor meio da fluorescência que eles irão emitir;
ex. isotiocianato de fluoresceína – FITC;
-um avanço dela foi o uso de proteína fluorescente verde ( GFP ) para visualizar proteínas dentro de
células vivas sem precisar corar e fixar a célula;