Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
INTRODUÇÃO À HISTOLOGIA - histologia é o estudo dos tecidos - as células não têm cores - avaliação de um tecido - o que conseguimos ver em um microscópio - a histo é importante na medicina - correlacionar a morfologia com a fisiologia - histologia: compreender a microanatomia das células, dos tecidos e dos órgãos e correlacionar as estruturas com as funções TECIDO BIOLÓGICO → COLETA obtenção de uma amostra significativa do órgão a ser analisado - biópsia preparação para obtenção de cortes suficientemente finos para poderem ser observados ao microscópio → FIXAÇÃO E PROCESSAMENTO imediatamente após a coleta interromper o metabolismo celular evitar digestão do tecido por enzimas presentes nas próprias células (autólise) endurecer o fragmento preservar estrutura e composição molecular dos tecidos impedir crescimento de bactérias, fungos e vírus 1. métodos químicos - fixadores: formaldeído, glutaraldeído 2. métodos físicos - congelamento: CO2 e nitrogênio → DESIDRATAÇÃO banhos em concentrações crescentes de etanol (70 → 100%) remoção da água contida nos tecidos → CLAREAMENTO banho em solventes orgânicos xilol e tolueno (miscíveis em água e parafina) preparam o tecido para inclusão → INCLUSÃO parafina ou resina plástica → coloca-se em uma temperatura alta (52 - 60°C) para ficar líquida e preencher os espaços que antes eram preenchidos por água 56 - 60°C → evaporação do solvente orgânico espaços existentes no tecido preenchidos pela parafina/resina temperatura ambiente → solidificação → COLORAÇÃO → AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA obs. CONGELAMENTO RÁPIDO - CO2, nitrogênio, isopentano - ausência de desidratação e inclusão - análise mais rápida do material biológico → 10 minutos - pode ser usado em cirurgias, por exemplo CORTE - cortes do material biológico → 1 a 10 µm (1µ= 10- 6m) - criostato - aparelho frio - para não causar o descongelamento (para não lesar as estruturas), também faz o corte - micrótomo - corte COLORAÇÃO - a maioria dos tecidos biológicos são incolores → coloração - seletividade - para não corar tudo de uma vez → CORANTES - formam ligações eletrostáticas com componentes do tecido CORANTES BÁSICOS estruturas que são coradas por corantes básicos → basofilia coram componentes basófilos (ácidos) dos tecidos CORANTES ÁCIDOS estruturas que são coradas por corantes ácidos → acidofilia coram componentes acidófilos (básicos) dos tecidos - corantes básicos reagem com componentes ácidos da célula (ácidos nucleicos - núcleo, glicosaminoglicanos e glicoproteínas ácidas) → hematoxilina - cora o núcleo roxo/azul → azul de toluidina → azul de metileno obs. associações de dois corantes para poder ver as estruturas diferentes - corantes ácidos reagem com componentes básicos da célula (algumas organelas - mitocôndrias, grânulos de secreção, proteínas do citoplasma e colágeno) → eosina - rosa → orange G → fucsina ácida obs. artefato de lâmina - alguns espaços “em branco” → a fixação do material não foi boa → durante o processamento: retração das céls (desidratação/inclusão) → espaços “não preenchidos” → podem apresentar estruturas histológicas → método de congelamento evita esse processo HEMATOXILINA E EOSINA → HE - coloração de rotina em histologia HEMATOXILINA (corante básico) azul ou violeta núcleo da célula → regiões de eucromatina - DNA mais descondensado - núcleo menos corado → heterocromatina - DNA mais condensado - núcleo mais corado estruturas ácidas do citoplasma (RNA e matriz de cartilagem hialina) EOSINA (corante ácido) cor-de-rosa citoplasma colágeno - ácinos (pâncreas) → células produzem muita proteína - não só o núcleo fica roxo, como seu entorno (ribossomos) → parte rosa - grânulos de secreção obs. grânulos de secreção mucosos - não têm afinidade com HE, ficam “pálidos” muco tem bastante proteína COLORAÇÃO PAS (Ácido Periódico-Reativo de Schiff) afinidade por carboidratos muco, células ricas em glicogênio, membrana basal, glicocálice rosa bem forte METACROMASIA - ocorre geralmente em estruturas celulares e teciduais com altas concentrações de sulfato e fosfato ionizados - desvio da cor normal do corante: azul → vermelho ou púrpura HISTOLOGIA - o procedimento, desde a fixação até a observação ao microscópio de luz, pode demorar de 12h a 2 dias - tamanho do tecido - fixador - meio de inclusão - congelamento rápido: 10 minutos MICROSCOPIA MICROSCÓPIO ÓPTICO/LUZ - fonte de luz - absorção/refração - condensador - para a luz não dispersar, para passar corretamente pela lâmina → concentra a luz de uma lâmpada e emite um feixe luminoso sobre o tecido - lentes objetivas - recebe o feixe de luz e projeta uma imagem aumentada para a ocular → geralmente 4x, 10x, 40x, 100x - lente ocular - amplia a imagem formada pela objetiva, que pode ser observada pela rotina - ampliação total - aumento da objetiva x aumento da ocular (fixo - ampliação de 10 vezes) - em azul → componentes mecânicos - suporte - em laranja → sistema óptico - poder de resolução → menor distância entre as partículas, que possibilite que elas sejam vistas como dois objetos separados (individualizados) → depende essencialmente da lente objetiva → poder de resolução máximo de microscópios ópticos: 0,2 µm - aumento de 1000 a 1500x → objetos menores que 0,2 µm ou que estejam numa distância menor que 0,2 µm não podem ser individualizados por esse equipamento obs. ampliação é diferente de resolução (ex. foto só aumentada - perde a resolução) o microscópio amplia com resolução → o aumento só tem valor prático se for acompanhado de resolução PROBLEMAS NA INTERPRETAÇÃO DE CORTES PLANOS DE CORTE - estruturas são tridimensionais, mas as amostras observadas em microscópios são bidimensionais OUTROS MICROSCÓPIOS MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE - estudo de células vivas (diferente das coradas, que geralmente morrem) - ex. observação de uma fagocitose - sem uso de corantes - produz imagens visíveis de objetos quase transparentes - diversas estruturas celulares possuem densidades diferentes → interferem de modos diferentes na passagem da luz MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA - uso de corantes fluorescentes - radiação ultravioleta excitadora - filtro 1: comprimento de onda que excita o agente fluorescente - filtro 2: comprimento de onda que o agente fluorescente emite - permitem a visualização de estruturas mais específicas - ex. arranjo do citoesqueleto, filamentos de actina, microtúbulos... MICROSCÓPIO CONFOCAL - uso de molécula fluorescente - somente a imagem originada do plano focalizado alcança o detector - imagens de outros planos são bloqueadas - imagens mais nítidas - como somente um plano focal é focalizado por vez (por mais fina que seja a espessura, há várias camadas de células em sobreposição), é possível reunir os vários planos de um objeto e reconstrui-los tridimensionalmente MICROSCOPIA ELETRÔNICA → DE TRANSMISSÃO (MET) - utilização de feixe de elétrons no lugar de feixe de luz, e bobinas magnéticas para focar o feixe, em vez de lentes de vidro - sem uso de corantes - preparação para que as células sejam submetidas a um feixe de elétrons - objeto de estudo deve ser colocado no VÁCUO → impossibilita análise de células vivas - resolução de 3 nm - ampliação de 120 mil - 400 mil vezes - estruturas elétron-densas: os e- não atravessam → não sensibiliza a placa - região fica mais escura ex. núcleo - regiões mais escuras - heterocromatina - DNA mais compactado - emprego de feixe de elétrons: → elétrons desviados por estruturas celulares que não contribuem para formação da imagem → estruturas elétron-densas - componentes celulares que desviam somente uma pequena quantidade de elétrons formarão imagens em escalasde cinza - cortes de 40 - 90 nm - cortes com navalha de diamante - fixadores - tetróxido de ósmio/glutaraldeído - inclusão - resina epóxi DE VARREDURA (MEV) - também emite elétrons, mas a diferença é que o material é colocado inteiro, sem cortes - objeto de estudo (sem cortes) é recoberto por um filme fino de metal pesado - elétrons não atravessam o espécime - são refletidos pelos átomos do metal - não é possível enxergar o interior, só a superfície IMUNOCITOQUÍMICA/IMUNOHISTOQUÍMICA - localização intracelular de proteínas específicas - reações imunológicas que envolvem anticorpo + antígeno - coloca na célula um anticorpo que irá se ligar à proteína que se deseja descobrir - esse processo de ligação termina com a emissão de uma luz/precipitado - visualização no microscópio → tecido A: saudável - sem nenhuma marcação → tecido D: comprometido FRACIONAMENTO CELULAR - obtenção de organelas (individualizadas) - centrifugação de um homogeneizado de células em que as membranas plasmáticas são rompidas e os constituintes celulares dispersos num líquido contendo sacarose - depende do coeficiente de sedimentação das organelas - centrifugação fracionada/diferencial - centrifugações seriadas com velocidades diferentes CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS - estudo de células vivas - microscópio de contraste de fase/uso de corantes vitais (HE são tóxicos) - meios de cultura - aminoácidos, glicídios, sais minerais, vitaminas e fatores de crescimento - temperatura e umidade adequados - estudo de fármacos - estudo do comportamento celular - poupa vida de animais
Compartilhar