microscopia e amostra

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Microscopia
escala micrométrica
angstrom
10⁻¹⁰m
Å nm μm mm 
nano
10−9m
micro
10-6m
microscópio de luz, 
óptico ou campo claro
lentes 
oculares tubo ou 
canhão
revolver 
ou tambor
lentes 
objetivas
braço, coluna 
ou estativa
platina 
ou mesa
parafuso 
macrométrico
parafuso 
micrométrico
fonte de luz 
ou espelho
charriot
pé ou base
condensador 
ou diafragma
• lente ocular: amplia a imagem das objetivas
• revolver: gira lentes objetivas, de menor para maior aumento
• lente objetiva: amplia e corrige cores (raios errados)
• platina: onde se bota lâmina, pode ser fixa, móvel ou giratória 
horizontalmente
• fonte de luz: ilumina o conteúdo da mesa, pode ter espelho 
semicôncavo
• condensador: converge os raios da fonte
• charriot: peça opcional para movimentar a lâmina na mesa
• parafuso macrométrico: focaliza grosseiramente
• parafuso micrométrico: focalização mais limitada e fina
ampliação ou magnificação: medida de quanto maior um objeto pode 
ser mostrado na microfotografia
resolução: a distância a qual 2 pontos podem ser separados e 
vistos como distintos. menor a distância, maior o poder de 
resolução. é afetada pela barreira por difração
microscópio simples (1 lente) ou composto (2+)
: microscopia com luz refratada de amostras 
pouco contrastantes (analisa sais na urina e bactérias 
espiroquetas)
microscópio de 
fluorescência
• tecidos com substância 
fluorescente
• emissão de LUZ UV
• localiza moléculas excitadas
microscópio de contraste
• transforma diferentes fases de 
raios em diferentes 
luminosidades
• +denso = +escuro (menor 
índice de refração)
• análise de células vivas
• sem corante
• modifica o típico de fase
• visualiza superfície (aspecto 
3D)
microscópio confocal
• Adaptado do fluorescente (usa-se substância)
• Emissão de laser
• Excita uma área de interesse específica e 
bloqueia raios emanantes de outras
microscópio polarizado
• usa 2 filtros de polarização entre luz e lâmina
• analisa materiais biorrefringentes (minerais...)
microscópio eletrônico
• usa feixe de elétrons ao invés do 
de luz
• resolução muito elevada (500x o 
de luz)
• eletromicrografias
• examina organelas
• células mortas (exemplar fixado e 
no vácuo)
• tipos: de varredura (MEV -
imagens 3d) e de transmissão (MET 
- alta resolução)
mili
10-3m
óptico
contraste 
de fase
contraste de 
interferência
eletrônico
polarizado
500x resolução do olho humano
Amostras
coleta
• organismo vivo: em biópsias, em cirurgias; fatias finas e frescas
• post mortem: necrópsia; fatias grossas possíveis
organização
• É preciso numerar a amostra e conter uma ficha com pedido de 
análise histológica (patológica seria uma visão macro)
• ficha técnica do paciente e do órgão caso seja vivo
• ficha da eutanásia com data, órgãos colhidos e procedimentos 
realizados caso seja de animais experimentais, além de registro no 
comitê de ética da instituição de pesquisa
fixação
• etapa que interrompe o metabolismo celular, degradante (como 
autólise post mortem), estabilizando estruturas e processos 
bioquímicos. fixadores também deixam o tecido suscetível à 
coloração, o endurecem e evitam autólise.
• químicos ou físicos, e são combinados para melhores resultados
• : coagulantes/desnaturantes (não se liga à ptn para 
precipitá-la) e não coagulantes/aditivos (se ligam)
• ; 
• aldeídos: formaldeído, glutaraldeído, paraformaldeído
comercial
• agentes oxidantes: OsO4, K2Cr2O7, KMnO4, 
H2CrO4
• mecanismo desconhecido: HgCl2, ácido pícrico, sais de 
zinco
• combinação: glutar.+OsO4, ZnI2+OsO4, 
glutar.+carbodiamida, glutar.+formol
• fixação a seco: carbowax 6000 ou fixação no vapor
• microondas
ps: - oxida como ácido fórmico (precipitado marrom) na 
presença de luz e ar, então deve-se usar soluções tamponadas
clivagem
• etapa de corte
• fragmentos de 3mm a 5mm de espessura
• ajuda absorção de fixadores
descalcificação
• para estudo do tecido ósseo presente nos tecidos extraídos ou de 
tecidos que precisam retirá-lo.
• : por ácidos, soluções quelantes e 
resinas de troca iônica
• descalcificação física: associados á química, por dissolução 
eletrolítica, ultrassom, microondas
desidratação
• remoção da água
• desidratantes: álcool etílico
• permite parafina apolar se impregnar
diafanização
• remoção do álcool da desidratação
• preparação com substâncias com afinidade á parafina (xilol, 
toluol...)
• clareia o material (clarificação)
impregnação
• infiltração em parafina ou outros (carbowax, resinas, gelatina 
agar-agar...)
• parafina líquida previamente (entre 56° a 60°C)
inclusão
• emoldurar os tecidos previamente impregnados em placas de mais 
parafina ou outro material e depois ser seccionada
micrótomo
• secção bem fina dessas “placas” impregnadas e pós-inclusão para 
visualização no microscópio, com uma navalha
• : rotatório, criostato, de corrediça, de congelação, 
ultramicrótomo
• navalha, afiada, e bloco devem estar paralelos!
coloração
colorir os tecidos é necessário para visualização no microscópio de luz
organelas são naturalmente incolores, difícil visualização
os grupos auxocromos dos corantes determinam seu pH e afinidade
Tipos de técnicas
Histológica: procedimento de rotina, em que o corante tinge os 
compostos mais macros, de acordo com os caráteres aniônicos.
Estão inclusos todos os corantes “ácidos e básicos” normais, como 
hematoxilina e eosina
Histoquímica: os corantes servem pra identificar estruturas 
menores/discretas mais especificamente, baseado na afinidade química 
do composto pela molécula-alvo. Exemplo disso é o p.a.s. com a glicose.
corado com HE 
ps.: passos pré-coloração, para maximizar a penetração do corante
• Banho-maria a 40°C - distensão dos cortes do micrótomo
• Desparafinização
• Hidratação
• Proteção
exemplos de corantes
• : se associam a tecidos básicos, portanto são 
basófilos e tem auxocromos aniônicos (ex.: OH-)
• exemplo ácido: eosina (vermelha), Orange G, fucsina ácida
• organelas coloridas: citoplasma
• : se associam a tecidos ácidos, portanto são 
acidófilos e tem auxocromos catiônicos (ex.: NH2)
• exemplo básico: hematoxilina (violeta), azul de metileno, 
azul de toluidina
• organelas coloridas: núcleo
: azul de tripan, azul de metileno, 
verde janus b, vermelho tripan, vermelho neutro...; não fazem mal às 
células vivas
os mais importantes:
• HE - hematoxilina-eosina:
• rosa e violeta
• Corante mais rotineiro, tinge estruturas mais óbvias e 
simples para visualizar
• p.a.s. - ácido periódico de schiff
• processo histoquímico - pode ser combinado com he
• identifica glicogênio (ou polissacarídeos similares)
• feita de fucsina básica + ácido sulfuroso = reativo 
de schiff
• shiff + oxidação por ác periódico = p.a.s.
• cor magenta/bonina (mucina) e azul (núcleos)
• se surte efeito colorante, a amostra é p.a.s+
• teste para glicogênio - prova real: testar amostra 
com amilase salivar, antes de aplicar o pas. se tiver 
glicogênio, a enzima vai consumi-lo, e a amostra vai 
ter que ser p.a.s-
• impregnação pela prata - método de golgi
• cora tecidos do sistema nervoso
• cristal marrom/castanho
• reação: dicromato de potássio + nitrato de prata = 
depósito de cromato de prata
• azul de toluidina
• azulado
• colore núcleo e polissacarídeos
• tricrômico de masson
• 3 cores:
• ác. nucleicos - azul/roxo
• fibras/colágeno - azul e verde
• citoplasma, eritrócitos e músculo - vermelho
• tetróxido de ósmio - OsO4
• tóxico!
• colore gordura, mielina, complexo de golgi, 
membranas e vesículas (lipídicas)
especificidades de cada microscópio
- amostra
microscópio de luz
• fixação - em
metanol (metoh)
• desidratação -
etanol (etOH) ou 
xilol
• impregnação -
parafina
• navalha de
micrótomo - aço
• lâmina - de vidro
microscópio 
eletrônico
• fixação - em
glutaraldeído
• desidratação -
acetona
• impregnação -
plástico
• navalha de micrótomo
- diamante ou vidro
• lâmina - grade 
metálica
em heimpregnação pela prata
pas + he
azul de toluidina
foto por met foto por mev
por OsO4