Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - HPLC

Prévia do material em texto

AULA 1- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA- HPLC
O uso da técnica de separação, quantificação e identificação por HPLC é aplicada para uma variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos. É utilizada como uma técnica analítica altamente sensível e seletiva para identificação e quantificação de analitos em misturas bastante complexas. 
Grande utilização na toxicologia para monitorar o uso de medicamento ou para o uso na ciência forense ajudando a elucidar crimes. 
Poluentes orgânicos emergentes- são compostos químicos presentes em uma variedade de produtos comerciais como os medicamentos, esses produtos não são monitorados ou possuem legislação regulatória que apresenta um risco potencial ao meio ambiente, causando a disfunção do sistema endócrino e reprodutivo de humanos e animais. Provoca aborto espontâneo e distúrbios metabólicos. É necessário seu monitoramento em redes de esgoto por equipamentos sofisticados que podem ser automatizados, é na rede de esgoto que existe um grande descarte desses produtos ou pela excreção na forma não metabolizada. 
Resposta em cromatograma, os compostos investigados são representados pelos picos. As condições cromotagráficas são muito importantes, foi utilizado o ultra HPLC- tem o mesmo princípio de funcionamento do HPLC, o tipo de coluna utilizado pra separar os compostos dessa categoria dos POE foi uma C18. A fase móvel utilizada foi uma mistura de dois solventes (gradiente- essa mistura não foi a mesma do início até o fim, foi feita em proporções durante a análise). 
O detector utilizado foi um espectrômetro de massas, por isso a intensidade é dada em percentuais que geralmente é dada em massa/carga. 
É importante conhecer as condições cromatográfica que são necessárias para se ter uma boa separação dos compostos e ter um resultado confiável a respeito de quem são os compostos, a mudanças das condições melhora a sobreposição dos picos. Importante para ter um resultado confiável de quem são os compostos e suas concentrações na amostra. 
HPLC 
Se encaixa na cromatografia líquida, a fase móvel é líquida e a estacionária pode ser sólida, líquida, a base de trocadores iônicos, espécies com afinidade do tipo chave-fechadura ou constituído de peneiras moleculares para a cromatografia por exclusão. 
A alta performance e a alta eficiência é desrespeito a capacidade do HPLC de oferecer separações bastante seletivas e de alta qualidade em um tempo mínimo de análise com o auxílio das altas pressões dentro do sistema combinado com os mecanismos de separação que podem ser de adsorção ou de partição dependendo do estado da fase estacionária. 
Forma como o analito interage. 
Absorção- absorvido de maneira irreversível 
Adsorção- fica adsorvido na superfície (nesse caso na sílica) 
A cromatografia utiliza colunas de vidro maiores que as utilizadas em HPLC com comprimentos maiores, sendo que o diâmetro das partículas da fase estacionária sólida entre 150-200. Hoje são utilizados equipamentos melhores, os UHPLC, o diâmetro da partícula da fase estacionária varia de 1,7-2,5 micrômetros ou menor que 1,7. As vazões eram muito mais baixas do que as atuais, geralmente é utilizado 1ml/minuto antes era um volume menor fazendo a extensão da análise fosse maior, tornando o tempo de separação mais longo e a análise mais demorada. Se incluiu o sistema de bombeamento que aumentaria a vazão da fase móvel mas só isso não mostrou eficiência na separação, os cromatogramas gerados eram muito ruins e de baixa resolução e foi aí que os pesquisadores perceberam que diminuir o diâmetro da partícula da fase estacionária a resolução dos picos dos cromatogramas melhorava significativamente, por essa razão o HPLC foi introduzido bem após do cromatógrafo gasoso. 
A separação dos compostos depende do tipo de interação que eles têm com a fase móvel e estacionária, com a aplicação de pressão tende a diminuir o tempo de análise. O mecanismo envolvido na separação está baseado na adsorção no caso da fase estacionária ser sólida, e a fase móvel devido a passagem do solvente que carrega os compostos menos atraídos pelo sólido e vão ser separados. Cada composto sai em tempos diferentes (tempo de retenção), depois da separação se faz a identificação do analito por comparação do tempo de retenção dos padrões. 
É feito primeiro a injeção e análise dos padrões depois das amostras, de acordo com o tempo de retenção pode-se deduzir que o composto é o mesmo do padrão, por isso que todos os equipamentos tem uma biblioteca acoplada com uma grande variedade de compostos estudados o que facilita muito no trabalho com amostras complexas. 
A quantificação também é feita por comparação com auxílio de uma curva de calibração que mede a área ou altura dos picos cromatográficos de acordo com sua concentração, questão de proporcionalidade (área/ altura x concentração) que a partir da curva se determina a concentração nos componentes. 
TIPOS DE MECANISMOS DE INTERAÇÃO DENTRO DA CROMATOGRAFIA 
cromatografia de partição- ocorre quando a fase estacionária é líquida, o filme fino líquido cobre um suporte inerte que representa uma coluna capilar. A intenção acontece de acordo com a diferença de solubilidade do analito e da fase estacionária. O fator que determina essa separação é representado pela regra do “semelhante dissolve semelhante”. O analito fica mais ou menos dissolvido no filme líquido de acordo com sua polaridade/afinidade.
Cromatografia de adsorção- os analitos ficam adsorvidos só superficialmente na fase estacionária que é porosa, ocorre uma interação somente na superfície de forma que o analito for parecido com a fase estacionária ele tende a interagir por mais tempo do que outro analito que tem menos afinidade com essa fase que elui da coluna primeiro e gera o primeiro pico cromatográfico. 
Os demais mecanismos são bem mais específicos: 
Cromatografia de exclusão de molécula- mecanismo de chave-fechadura, se baseia em interações mais específicas entre um tipo de molécula de soluto e uma segunda molécula que se encontra ligada covalentemente a fase estacionária. E o sistema de peneiras moleculares em que as moléculas de tamanho determinado vão ser peneiradas e as de tamanho maior são excluídas. 
Cromatografia de troca iônica- resina de troca catiônica e aniônica por meio das forças eletrostáticas utilizadas. 
Cromatografia por afinidade
AULA 2-POR QUE UTILIZAR O HPLC/CLAE?
Para utilizar um HPLC é necessário observar vários fatores, ou para decidir entre o HPLC ou CG. Diferente do CG em que os analitos devem ser voláteis ou volatilizáveis (requisito para utilizar o equipamento), no HPLC o trabalho é feito com altas pressões provenientes de bombas separando compostos não voláteis que são a maioria dos compostos ou tendo características termicamente frágeis, essas pressões são responsáveis por impulsionar a fase móvel dentro do sistema/coluna que está recheada com partículas de fase estacionária. 
A gama de compostos que podem ser analisadas por HPLC é bem maior e com menos restrições, o uso das altas pressões e partículas de diâmetro pequeno na fase estacionária fazem do HPLC uma das técnicas mais utilizadas em qualquer parte do mundo, sendo muito útil na separação, determinação e quantificação de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarbonetos, carboidratos, drogas, terpenóides, pesticidas, antibióticos, esteroides, espécies organo-metálicas e muitas substâncias inorgânicas. 
COMPARAÇÃO 
quando comparado o HPLC que possui uma coluna empacotada metálica com a cromatografia líquida clássica nas colunas de vidro a diferença é muito grande principalmente relacionado aos efeitos da pressão, na técnica clássica existe apenas a ação da pressão da gravidade, da pressão atmosférica empurrando fazendo com que os analitos sejam separados tornado o tempo de análise bem maior. 
No caso do HPLC existe uma compactação e um sistema de vedação que faz com que o uso das bombas gere altas pressões resultando em separações com grande eficiência, alta resolução dos picos cromatográficos e o tempo de análise cada vezmais curto. 
Com todo o avanço tecnológico o valor da instrumentação se tornou bastante expressivo. O HPLC com componentes básicos com valores de 18000-300000 dependendo dos acessórios, do tipo de bomba, a flexibilidade do programa de gradiente, o software. Já o UPLC/UHPLC são equipamentos mais modernos existentes, os valores partem de 300000 reais. 
A diferença principal entre o HPLC e o UHPLC é a quantidade de pressão gerada pela bomba e o tamanho do diâmetro da partícula da fase estacionária, No UPLC a fase estacionária é porosa com diâmetro menor que 2 micrômetros e a pressão em cerca de 15000 psi, já pro HPLC a fase estacionária tem diâmetro maior de 2-10 micrômetros e a pressão menor que 1000 bar. 
COMPONENTES BÁSICOS DE UM HPLC 
1- Sistema de distribuição de solvente funcionando como fase móvel 
2- Uma válvula de injeção de amostra
3- Uma coluna metálica empacotada como fase estacionária que suporta a pressão
4- Uma coluna de guarda/pré-coluna para previnir problemas que possam vir a ocorrer dentro da coluna
*Tudo isso funcionando sob alta pressão*
5- Detector 
6- Computador interfaceado pra controlar o sistemas e apresentar os resultados em forma de cromatogramas com seus picos em termos de tempo de análise vs área/altura do pico. 
SISTEMA DE BOMBEAMENTO DE FASE MÓVEL 
No HPLC, consiste em um reservatório de fase móvel com sistema de tratamento de solvente para remoção de gases. 
Gases são um problema muito grande em HPLC, pois se trabalha com sistema todo vedado sob alta pressão. Quando esses gases formam bolhas eles atrapalham o fluxo ou o sistema interno da análise e pode prejudicar o equipamento perdendo pressão interna, isso é identificado pelo cromotograma gerado, as bandas dos picos saem bem mais largas do que o esperado. 
Esses reservatórios frequentemente são equipados com um meio de remoção para esses gases dissolvidos que geralmente são oxigênio e nitrogênio que interferem na análise causando o espalhamento das bandas e atrapalham a eficiência do detector. 
A remoção desses gases é feita pela desgaseificação e utilização de filtros com material particulado do solvente para evitar danos no sistema de bombeamento de injeção e entupimento da coluna. 
O HPLC não precisa ter necessariamente esses dois dispositivos, os equipamentos atuais tem a facilidade de ter um desgaseificador e pequenos filtros acoplados ao sistema, se for preferível é possível fazer a desgaseificação antes de colocar o solvente dentro dos reservatórios por banho de ultrassom a vácuo garantindo que o solvente esteja livre dos gases que podem causar problemas no sistema interno do HPLC. 
No HPLC, quando se trabalha com o sistema de bombeamento se bombeia uma quantidade de fase móvel para dentro do sistema com uma determinada vazão que pode ser ou não constante, chamada de eluição que pode ser feita de duas formas: 
1- eluição isocrática: em que a separação emprega um único solvente de composição constante
2- eluição com gradiente: quando a amostra é um pouco mais complexa com sobreposição de picos pode-se aumentar a resolução de separação empregando dois ou três solventes que diferem bastante em questão de polaridade colocando o percentual de cada um em um determinado tempo fazendo misturas no decorrer da análise, melhorando a separação. 
O HPLC usa altas pressões para auxiliar a separação dos analitos dentro da amostra, essas pressões são geradas por alguns tipos de bomba
1- bomba recíproca- é uma bomba mecânica, consiste em uma pequena câmara no qual o solvente é bombeando por um movimento de pistão para frente e para trás, controlado por um motor, duas válvulas de esfera abrem e fecham de maneira alternada para controlar o fluxo do solvente que entra pra dentro e para fora do cilindro. O solvente está em contato direto com o pistão, como alternativa, a pressão pode ser transmitida para solvente através de um diafragma flexível que é bombeado de forma hidráulica por um pistão recíproco. A vantagem de se utilizar essa bomba é que a pressão é de até 10000psi, tem fácil adaptabilidade a eluição por gradiente, se utiliza um volume interno pequeno de até 400 microlitros que é o volume que vai ser encaminhado dentro da câmara, a vazão é constante (o fluxo é a vazão da fase móvel) não depende de nenhuma pressão de retorno da coluna e nem da viscosidade do solvente. 
Porém esse tipo de bomba tem a desvantagem de produzir um fluxo pulsado que deve ser amortecido porque sua presença se manifesta como ruído de fundo na linha de base do cromatograma, no entanto o ruído é pequeno e pode ser minimizado depois por meio de tratamento estatístico. 
2- bomba pneumática
em condições ideais levam ao bom funcionamento do equipamento: 
Geração de pressão de até 6000 psi;
Gerar um fluxo que não tem pulsação utilizando o amortecedor de pulsos;
As vazões ideais variam de 0,1-10ml/min se considerar o diâmetro da fase estacionária varia de 2-10 micrômetros; 
O controle da vazão melhora a reprodutibilidade sendo menor do que 1%.
Os componentes devem ser resistentes à corrosão, utilizando principalmente aço inoxidável ou teflon porque se trabalha com solvente orgânico, utilizar esse tipo de solvente é de certa forma bom porque caso algo provoque o entupimento do sistema de bombeamento pela alta pressão não é preciso se preocupar com nenhum tipo de explosão, se enxerga o vazamento do solvente e uma diminuição da pressão. 
AULA 3- bomba pneumática 
A fase móvel fica dentro de um recipiente compressível inserido dentro de um vaso que pode ser pressurizado com gás comprimido. Esse tipo de bomba tem a vantagem de ser barata e livre de pulso diferente da bomba recíproca, mas possui a limitação de capacidade e da pressão de saída, depende da velocidade do fluxo, da viscosidade do solvente e da pressão de retorno da coluna. 
Essas bombas não são fáceis de trabalhar com a eluição gradiente onde tem que fazer modificações das proporções da mistura da fase móvel, acabam sendo limitadas a pressões menores que 2000 psi, bem abaixo das condições ideais. 
O líquido é deslocado mediante pressão exercida por um gás inerte a alta pressão, pode ser feita diretamente sobre o líquido ou sobre o recipiente comprimível que o contém. 
A recíproca é bem mais utilizada. 
INJEÇÃO DA AMOSTRA 
muitas vezes numa análise, o fator que limita a  precisão de medidas dentro da cromatografia líquida está focada na reprodutibilidade com a qual as amostras são injetadas dentro de uma coluna empacotada, o problema acaba sendo agravado porque as bandas se alargam e acaba sobrecarregando a coluna, o volume utilizado na injeção deve ser minúsculo de 0,5-500 microlitros ou ainda introduzir a amostra em despressurizar o sistema. 
O meio mais fácil e simples de injetar a amostra nessas condições é utilizar uma seringa/micro-seringa que permite a injeção através de um septo de elastômero que é um polímero auto-selante similar ao do CG. 
Para essa finalidade são utilizadas as micro-seringas que são projetadas para suportar pressões de até 1500psi. Injeções stop-flow, que é um versão de injeção, o fluxo do solvente acaba sendo interrompido momentaneamente e um adaptador no topo da coluna é removido e a amostra é injetada diretamente no início da coluna, depois essa peça volta ao local e o sistema é pressurizado novamente, a perda da pressão acaba sendo compensada e não atrapalha a análise. A vantagem dessa técnica de injeção é sua simplicidade, mas infelizmente a reprodutibilidade da injeção com seringa normal raramente será melhor do que 2-3% e com uma frequência pior, por isso se opta pelas micro-seringas. 
O método mais utilizado para introduzir amostras no HPLC é a alça de injeção ou amostragem (loop), além de utilizar micro-seringas também é baseado na utilização de alças de amostragem. Esse dispositivo costuma ser parte integrante do equipamento de cromatografia líquida e tem alças que podem ser intercambiadas (em azul) permitindo escolher o tamanho da alça que será injetada, a capacidade das alças variam de 5-500 microlitros, alças desse tipo permitem a introdução de amostras empressões adequadas de até 7000 psi com uma precisão relativa de poucos décimos de porcento. Esse sistema é o mais utilizado no HPLC e no UHPLC. 
como a coluna opera em pressão elevada é necessário utilizar uma técnica especial para injeção da amostra ame que haja a perda da pressão interna durante a injeção, a válvula contém os loops de amostragem que também são de aço pelo fato de trabalhar com solventes orgânicos, elas são permutáveis e é possível fazer a troca com vários volumes. 
Na posição de carregamento com a utilização de uma seringa/ micro-seringa para preencher a alça com uma porção de amostra que estará sob pressão atmosférica. Quando essa válvula é girada em 60° no sentido anti-horário o conteúdo dentro da alça será empurrado e injetado sob alta pressão para dentro da coluna, é um movimento manual de carregamento e de injeção no sentido horário e anti-horário para fazer a introdução da amostra para dentro da coluna. 
COLUNAS 
uma vez que a amostra foi injetada na coluna, a velocidade de separação e a eficiência dependerão do tipo de recheio/fase estacionária que tem dentro da coluna. 
As colunas geralmente são construídas de tubo de aço inox devido a utilização de solventes orgânicos. 
As colunas empacotadas para HPLC também tem um custo elevado pelo fato de serem feitas de material inoxidável, suportarem pressões elevadas para um sistema de separação e pelo tipo de fase estacionária. 
Dependendo do que será analisado e separado pode sofrer degradação, no caso da fase estacionária pode ser por adsorção irreversível de algumas impurezas que estão presentes na amostra e também dependendo do solvente escolhido para entrar em contato com a fase estacionária, isso não significa que as colunas tem um tempo de vida curto mas que podem viver por mais tempo se forem utilizadas de forma adequada. 
Por exemplo, para evitar uma degradação avançada na entrada da coluna principal é colocada uma proteção chamada de pré-coluna/ coluna de guarda, essa coluna tem a mesma constituição de fase estacionária da coluna principal. Essa coluna de guarda é menor e mais barata podendo ser substituída periodicamente, faz uma pré-filtragem para evitar a adsorção irreversível- vantagem por preservar a vida da coluna. 
Como prevenção, as amostras devem ser filtradas, centrifugadas antes de serem introduzidas no cromatógrafo para evitar esses problemas e qualquer tipo de entupimento do sistema que ocasiona o aumento da pressão e consequentemente o vazamento por alguma parte do sistema. 
Para fins de eficiência de separação e rapidez da análise, as colunas têm a temperatura monitorada evitando a degradação precoce da fase estacionária. 
Em UHPLC o diâmetro das partículas da fase estacionária é menor que 5 micrômetros. 
FASE ESTACIONÁRIA- RECHEIOS 
Fase estacionária sílica e porosa, típicas de um HPLC, consiste em micropartículas porosas que tem um diâmetro de esfera que varia de 3-10 micrômetros. Essas partículas são compostas de sílica (pode ser resina sintética, poliestireno, resina de troca iônica). 
A sílica é a mais utilizada, podendo ser uma sílica microporosa, de sílica fundida ou um polímero que são materiais utilizados nas colunas monolíticas. 
A fase estacionária de sílica microporosa são permeáveis ao solvente, tem área superficial adequada para uma boa adsorção, para isso deve-se ter muito cuidado com a faixa de pH da solução que está sendo introduzida no cromatógrafo líquido, pois o pH acima de 8 em soluções básicas faz a sílica se dissolver e sofrer hidrólise, e em pH muito ácidos a sílica é constituída principalmente pelos grupos silanol que interage com compostos polares e apolares, se encontram protonados quando o ambiente da solução está em pH entre 2-3. Esse grupo silanol se dissocia perdendo o H na faixa de pH maior que 3 e menor que 7, retendo fortemente as bases protonadas como radicais amônia e provoca a formação das caudas no lado direito e esquerdo dos cromatogramas. 
Pode-se utilizar sílica microporosa com pontes de etileno solucionado o problema da diferença de pH, quando utilizada ela resiste a hidrólise em pH até 12 o que é útil para separação de compostos com características básicas ( pH 8-12). 
A sílica modificada, também chamada de sílica quimicamente ligada, ligada a outro tipo de fase estacionária e os agrupamentos específicos são presos na superfície da sílica de forma covalente acaba retendo compostos apolares e opera numa faixa mais ampla de pH. Esse tipo de fase estacionária líquida é um tipo de separação de compostos baseados em partição. 
Ex: sílica quimicamente ligada- grupamento trimetil
Trimetil-silina reagindo com a sílica gerando a sílica quimicamente ligada, onde o radical R é o sítio/ porção responsável que atrai e interage com o analito ou não, dependendo da afinidade de retenção na fase estacionária. Esse tipo de fase estacionária é mais voltada para separação de compostos apolares sendo a c18 um tipo de fase estacionária, chamada octadecil, frequentemente utilizada nas colunas de HPLC.  
AULA 4- SÉRIE ELUOTRÓPICA DOS SOLVENTES 
O tipo de solvente na fase móvel é responsável por transportar o analito numa determinada vazão e pressão, a polaridade desse solvente é importante para que a separação dos picos seja adequada, para que os compostos sejam bem separados. 
A fase móvel/eluente, sendo um solvente orgânico ou não, tem uma determinada polaridade/força eluente que é a capacidade do solvente de atrair mais ou menos compostos que são semelhantes a ele, vale a regra do “semelhante dissolve semelhante”.
 Esses solventes têm uma ordem de polaridade e, no geral, a força eluente aumenta quando a fase móvel se torna mais parecida com a fase estacionária que provoca a retenção do analito, quando mais forte for a força eluente maior será a polaridade. 
Pentano como hidrocarboneto, que são os mais apolares, com força eluente praticamente zero. 
A água é o mais polar, com valor de força eluente maior que o metanol. 
ELUIÇÃO 
uma fase estacionária tendo um caráter polar tende a reter os compostos polares, portanto eles não tendem a interagir com a fase móvel que provavelmente tem uma força eluente menor. 
se a fase móvel tem mais caráter polar, que é similar ao composto que será separado, vão interagir e sair da coluna mais rapidamente juntos. Solventes podem ser utilizados de uma forma única ou misturada em proporções que possibilitem a variação de polaridade obtendo melhores separações dos picos cromatográficos. 
Polar tende a reter polar e apolar tende a reter apolar. a fase móvel, a fase estacionária e a mistura dos compostos que serão separados no decorrer do tempo, cada um com seu tempo de retenção, e detectados no detector. 
As moléculas do solvente competem com as moléculas do soluto pelo sítio de ligação da fase estacionária, quanto maior a força eluente do solvente mais facilmente ele deslocará o soluto. 
Eluição isocrática- eluição com um único solvente ou com uma mistura de solventes de composição constante. 
Se o solvente não diferencia adequadamente os componentes de uma mistura ou não propicia uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes outro tipo de eluição deve ser aplicada: 
Eluição por gradiente- o solvente é continuamente mudado do mais fraco ao mais forte em termos de força eluente/polaridade através da adição de mais solvente forte ao solvente fraco durante a corrida cromatográfica, muito parecido com a rampa de temperatura, aumentando a força do eluente e propiciando diferentes polaridades. 
Ex: eluição por gradiente utilização acetonitrila como fase móvel inicialmente bombeada para o sistema cromatográfico com 30% nos 7 primeiros minutos, depois esse percentual aumenta para 45% aumentando a polaridade do solvente por cerca de 20 min, então o percentual de acetonitrila é aumentado novamente até alcançar 80% por mais ou menos 10min. 
Nesse caso, foi utilizada uma única fase móvel só que em proporções diferentes, sendo a diferença entre os dois tipos de eluição, a eluição por gradiente pode ser programado pra variar a composição da fase móvelde forma contínua ao longo da corrida cromatográfica misturando até 4 solventes com diferentes polaridades, por isso que no reservatório de fase móvel existem vários recipientes para fazer essa mistura. 
Ex: solvente orgânico e água- mostra a eficiência de separação com o uso do gradiente da fase móvel. Na figura A mostra um cromatograma em determinadas condições cromatográficas em que a fase móvel utilizada para a separação é a acetonitrila 80%, que tem uma polaridade relativamente alta, e 20% de água que resultou em uma separação ruim porque os picos estão muito próximos e houve sobreposição. Para mudar esse cenário e melhorar a separação, pode ser adicionado água e acetonitrila em proporções diferentes sem 60% pra água e 40% para acetonitrila aumentando a polaridade da fase móvel e o resultado vai gerar um cromotograma com uma resolução melhor que a anterio, mas que ainda se observa algumas sobreposições. 
É possível melhorar ainda mais o resultando modificando a proporção dos solventes. Trocando a acetonitrila pelo metanol 50% e água 50%, causa uma melhora mais ainda com algumas sobreposições de alguns picos. É possível melhorar ainda mais os resultado já que existem outras combinações possíveis de solvente, a acetonitrila e o metanol misturados com água em proporções diferentes podem proporcionar uma boa separação, então se 20% de acetonitrila for combinado com 25% de metanol e os 55% restantes de água causa uma combinação perfeita na mistura desses solventes para obter o gráfico com ótima separação dos picos dos compostos sem causar nenhuma sobreposição, com altíssima resolução. 
A polaridade do solvente é ajustada para obter a resolução adequada da mistura. Pode-se usar eluição por gradiente, ou seja, em cromatógrafo com duas bombas, estas são programadas para variar a composição da fase móvel continuamente ao longo de alguma etapa da corrida cromatográfica. 
Ex 2: o caráter da fase estacionária no exemplo anterior o analito tinha mais afinidade ou menos afinidade pela fase móvel que era mais polar e, portanto, a fase estacionária sendo mais polar. 
quando se usa o conjunto de fase estacionária sendo apolar e a móvel polar essa cromatografia é chamada de fase reversa, a desvantagem é que a fase estacionária sendo apolar retém poucos compostos apolares. Uma coluna do tipo c18 a base de hidrocarboneto que são apolares, portanto, com caráter apolar, e todos os 30 compostos foram separados num tempo de 47 min utilizando o gradiente de eluição. O oposto em que a fase estacionária é polar e a móvel e a fase móvel é apolar é chamada de cromatografia em fase normal, a desvantagem é que o tempo de corrida acaba sendo maior, o custo dos solventes é mais elevado, maior preocupação com formação de bolhas, entupimento, aumento de pressão. 
Todos esses fatores como desvantagem levam a uma má separação dos compostos e uma baixa resolução dos picos cromatográficos, ficam muito largos ou sobrepostos. 
Além do tipo de fase móvel, a proporção dos solventes e a temperatura da coluna, levando em consideração o recheio da fase estacionária, tem grande importância no quesito separação. No CG, a eficiência de uma coluna cromatográfica depende, além da fase estacionária, do comprimento da coluna. 
Para saber se uma coluna tem uma alta ou baixa eficiência na separação, a avaliação é feita em termos do número de pratos teóricos (N), da quantidade de equilíbrios existentes entre o analito, a fase estacionária e a fase móvel dentro da coluna, quanto mais etapas de equilíbrio existirem dentro de uma coluna maior será o número de pratos teóricos e mais estreita será a banda quando o composto for eluido ou emergir da coluna, com picos bem separados é bem resolvidos sem sobreposições. 
Existe uma reação entre o número de pratos e altura dos pratos que é inversamente proporcional, ambos os parâmetros dizem respeito a eficiência de separação cromatográfica. 
No CG é mais comum trabalhar com colunas capilares que são mais longas do que as empacotadas utilizadas no HPLC. A relação da altura do prato, dada pela razão do comprimento e número de pratos teóricos, diz sobre a eficiência da coluna que depende do número de pratos teóricos.
 Para a coluna capilar que tem um diâmetro de coluna bem menor que as empacotadas, quando a altura do prato aumenta o número de pratos teóricos diminui, são grandezas inversamente proporcionais. Como as colunas mais compridas terão mais equilíbrios envolvidos a tendência é que elas sejam colunas mais eficientes do que as empacotadas, mas não quer dizer que se possa utilizar uma coluna capilar em HPLC uma vez que essas colunas capilares não suportam altas pressões requeridas pelo HPLC, por isso que a eficiência das colunas devem ser tratadas e comparadas entre colunas do mesmo porte. 
AULA 5- EFICIÊNCIA 
pelo fato de comparar a fase estacionária em colunas empacotadas que se entende que não somente o tipo de recheio da fase estacionária é que importa para uma boa separação da coluna cromatográfica.
 Dentro da coluna empacotada com a fase estacionária, o analito e a fase móvel percorrem a trajetória da coluna com velocidades diferentes e vão traçar caminhos diferentes já que as fases estacionárias são preferencialmente porosas.
Para isso, a equação de Van Deemter relaciona esses parâmetros com a altura do prato que é a eficiência da coluna. Os parâmetros A e B são constantes e relacionadas ao tamanho de fase estacionária e mi representa a vazão/ fluxo de difusão linear das partículas, quanto menor for o tamanho das partículas da fase estacionária melhor será a eficiência de separação. 
No gráfico que mostra o tamanho das partículas da fase estacionária para o HPLC que varia de 3,5-5 micrômetros e abaixo entre 2,7-1,8 micrômetros no UPLC, a eficiência se mostra mais alta pela altura do prato ser menor sendo inversamente proporcional ao Número de pratos teóricos. 
A grande diferença entre o HPLC e o UPLC é o tamanho das partículas da fase estacionária e as pressões elevadas que são requeridas quando se usa fases estacionárias cada vez menores, consequentemente o custo de um UPLC é bem mais alto. 
DETECTORES PARA CLAE
depois que os compostos foram separados eles precisam ser detectados. 
Os HPLC utilizam vários tipos de detectores, mas especificadamente são utilizados o ultravioleta, os eletroquímicos e o espectrômetro de massas. 
Para todos eles existem algumas características de detectores ideais para um bom funcionamento de detecção: 
Ter uma sensibilidade adequada. 
Uma resposta rápida independente da vazão.
Uma faixa de resposta linear estendida por várias ordens de grandeza. 
Pouca dependência da temperatura e vazão.
Resposta independente da fase móvel. 
Pouco alargamento do pico. 
Não destruir a amostra. 
Informações qualitativas sobre os analitos. 
De forma similar ao CG, um HPLC não possui muitos detectores universais que são aplicáveis e confiáveis como o DIC e da condutividade térmica do CG. 
O detector ideal para a cromatografia líquida deve ter todas as propriedades de um CG. 
DETECTORES DE ABSORBÂNCIA 
Espectrofotométricos (UV): 
É o mais comum e é constituído por uma cela de fluxo em Z. O sistema é simples, usa emissão intensa de uma fonte de lâmpada de mercúrio que emite radiação na faixa do ultravioleta, os instrumentos mais versáteis utilizam lâmpadas com fonte de deutério ou de xenônio junto com o monocromador de forma que se possa escolher um comprimento ideal para medir a absorbância dos analitos que saem da coluna. Sendo esse tipo de detector restrito para solutos que absorvem na região do ultravioleta. 
Existe uma capacidade de volume que passa por esse detector, o tamanho da cela de fluxo faz total diferença na geração do pico cromatográfico que minimiza os alargamentos de bandas que venham ocorrer fora da coluna. 
O volume dessa cela é mantido com o menor possível, por isso que tipicamente os volumes que chegam e são eluidos da coluna ficam limitados até 10 microlitros e a celas ficam limitadas até 10 milímetros. 
A maioria das celas são restritas a pressões não maiores que 600psique são condições ideais para operar um HPLC e ter um bom resultado de separação cromatográfica. 
DETECTORES ELETROQUÍMICOS 
Eletroquímicos- Nesse tipo de detector a detecção é feita através de reação redox, da redução e de oxidação dos compostos numa cela de fluxo a partir dois eletrodos de trabalho e de referência na presença de um potencial elétrico. Pode apresentar um LD extremamente baixo e é muito utilizado em análise de compostos traço, orgânicos com grande seletividade, além dos grupos funcionais hidrocarbonetos, Ésteres, aldeídos, hidroxilas aromáticas, aminas, halogênios.  
O detector pode ser do tipo amperométrico, coulunométrico, condutometrico, polarográfico. 
Apesar de não serem tão explorados como os detectores ópticos, apresentam alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade em reações redox. 
HPLC COM MS 
É um detector universal, é possível acoplar um espectrômetro de massas na saída da coluna de um cromatógrafo gasoso potencializando a técnica de separação, identificação e quantificação. 
Ex: na identificação dos isótopos, estrutura de moléculas orgânicas, elucidação de aminoácidos em proteínas, elucidação da sequência de ácidos nucleicos no DNA. 
No HPLC também é possível fazer esse acoplamento, porém um grande problema é o descompasso entre os volumes que são relativamente grandes de solvente no HPLC e os requisitos de alto vácuo de espectrômetro de massas. 
O esquema de HPLC com amostrador automático injetando a amostra na coluna e sendo transportada pela fase móvel que é um solvente sob alta pressão que interage tanto com o analito e a fase móvel e é separada sendo enviada para o espectrômetro de massas. 
O espectrômetro de massas fica interfaceado com o HPLC, o primeiro cuidado é com a diferença de pressão entre os dois dispositivos, a pressão do HPLC é bem diferente da do espectrômetro de massas que está sob auto vácuo, pra isso existe um bom sistema conector para essa interface para possibilitar a continuidade da análise. 
Um espectrômetro de massas é constituído por uma câmera de ionização na qual as moléculas que saem da coluna serão fragmentadas, ionizadas, analisadas e detectados por um detector similar às fotomultiplicadoras que dá origem ao espectro da razão massa/carga no eixo X e a abundância relativa em percentuais no eixo Y. 
A fonte de ionização pode ocorrer por impacto de elétrons, eletronspray, MALDI e outros tipos. Cada um desses tipos vai dar características diferentes no espectro de massas. 
Na ionização por elétrons, as moléculas que entram na câmara serão convertidas em íons, os elétrons emitidos pelo filamento aquecido serão acelerados por meio de um potencial aplicado antes de interagirem com as moléculas que entram na câmara. Algumas moléculas do analito vão absorver energia suficiente para ionizar gerando o pico do íon molecular (cátion), após a ionização esse cátion normalmente tem uma energia residual interna suficiente para que ela se fragmente, esses fragmentos serão analisados por um analisador de massas (quadrupolo, TOF, íon trap, FT-ICR(transformada de furrier))pra depois serem detectados pela multiplicadora de elétrons. 
IONIZAÇÃO POR ELETRONSPRAY 
É um tipo de fonte de ionização, envolve a produção de íons através da formação de um spray da solução contendo um analito dentro de um campo elétrico. 
É uma técnica de ionização considerada branda que possibilita a análise de moléculas grandes, biomoléculas grandes na sua forma intacta, como proteínas e DNA. 
Esse eletronspray cria essas gotículas que são carregadas positiva e negativamente através de um processo de nebulização, o solvente que geralmente é uma mistura de água e solvente orgânico (50%/50%) é removido a medida que as gotículas entram no espectrômetro de massas, esse processo de ionização acontece devido a aplicação do campo eletrostático que age sob a superfície da gotícula, à medida que o solvente evapora na região do auto vácuo o tamanho da gotícula vai diminuindo gradativamente até que sobre somente íons livres do solvente. 
ANALISADORES- QUADRUPOLOS 
Recebe os íons fragmentados gerados pela ionização. 
Consiste em hastes metalizadas/cilindros metálicos paralelos nos quais se aplica uma corrente elétrica é uma diferença de potencial de radiofrequência de forma alternada. A radiofrequência vai sendo variada de forma que os íons de diferentes razões massa/carga tenham uma trajetória helicoidal estável ao longo do quadrupolo. 
Os íons são separados de acordo com a estabilidade da sua trajetória dentro desse campo elétrico criado por meio das oscilações elétricas aplicadas nos cilindros metálicos. Os íons chegam ao detector e geram o espectro de massas. A aplicação desse campo eletrostático ocorre de maneira rápida, esse tipo de analisador opera pra CG e para HPLC. 
ANALISADOR DE VOO (TOF) 
É um analisador de massas que pode separar os íons pelo uso de campos magnéticos ou elétricos, alternativamente o tempo que os íons de diferentes massas levam pra atravessar distâncias definidas pode ser medido precisamente com o TOF. 
Nessa técnica, as partículas das substância são ionizadas para formar os cátion positivos que serão acelerados de forma que todos tenham a mesma energia cinética, o tempo gasto pra percorrer uma distância fixa vai ser usado pra encontrar a massa de cada íon na amostra, os íons positivos viajam por um orifício na placa carregada negativamente dentro do tubo, o tempo de voo de cada partícula através desse tubo vai depender da sua velocidade que depende da sua massa. 
Nas câmaras de ionização tem uma descarga levando a geração de íons positivos (cátions) que são produzidos dentro da fonte de íons por meio de elétrons na forma de pulsos, fótons ou por impacto de íons secundários. Esses íons são rapidamente acelerados dentro de um tubo direcionador seguindo em direção ao detector mediante um pulso de campo elétrico. Uma vez que esses íons que têm a mesma carga recebe a mesma energia cinética vão seguir ao longo do tubo em diferentes velocidades, dessa forma atingem o detector em tempos diferentes, o intervalo de tempo de descarga de íons até chegar no detector é extremamente pequeno. Já o detector de íons que monitora e quantificar o número de íons à medida que eles saem do tubo direcionador e atingem o detector que é o responsável por fazer a amplificação na forma de espectros de massa/carga. 
Ocorre a fragmentação das espécies na câmara de ionização, essas espécies são aceleradas e a aplicação de um campo magnético de forma que são encaminhadas ao tubo de direcionamento onde atingem o detector com velocidades diferentes. Dessa forma, depois são amplificadas de forma a gerar o espectro de razão massa/carga vs abundância.