Introdução ao HIV e Diagnóstico

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Di�g�ós�i�� d� HI�
Con���t� �i�tóri��
A síndrome da imunodeficiência adquirida
(AIDS) é causada pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV). Os
primeiros casos de AIDS foram
documentados nos anos 80. Então, a
doença se espalhou pelo mundo causando
uma pandemia.
Atualmente há uma tendência de
crescimento em jovens de 15 a 24 anos e
em adultos de 50 anos os mais, tanto em
homens quanto em mulheres.
Es��ut��� �o HI�
Os vírus da imunodeficiência humana HIV-1
e HIV-2 são retrovírus envelopados
pertencentes à família dos lentivírus.
- Lentivírus: característicos por
provocar infecções persistentes com
evolução lenta.
- Retrovírus: vírus cujo material
genético é RNA e possuem a enzima
transcriptase reversa, capaz de
transformar o RNA viral em cDNA.
O cDNA é integrado ao DNA da
célula pela enzima integrase.
Envelope: possui as glicoproteínas 120
(gp120) e 41 (gp41). A gp120 é a mais
externa, responsável por ligar o vírus às
células hospedeiras. Ela está ligada a gp41,
que atravessa o envelope viral.
Na parte interna do envelope existe uma
estrutura proteica constituída pela proteína
17 (p17).
A estrutura seguinte é o cerne ou capsídeo
viral, formada pela proteína 24 (p24).
Envolve duas fitas de RNA (genoma viral) e
as enzimas transcriptase reversa,
integrase e protease.
- Protease: quebra as ligações
peptídicas entre os aminoácidos das
proteínas, também conhecidas como
proteinases, peptidases ou enzimas
proteolíticas.
As proteínas e glicoproteínas virais são
identificadas pelo seu peso molecular em
quilodaltons. Exemplo: a gp120 tem 120
quilodaltons.
Eta��� d� i���cção p��� HI�
O HIV pode infectar células com receptores
CD4 em sua superfície, como os linfócitos T
helper, os macrófagos e as células
dendríticas.
Infecção inicial ocorre nas células T CD4.
1. As gp120 do vírus se ligam nos
receptores CD4 da célula,
desestabilizando as gp120 e
expondo sua alça V3.
2. A alça V3 interage com o coreceptor
CCR5. *
3. Ativação da gp41 e fusão do
envoltório viral com a membrana
celular — penetração do vírus.
4. Afrouxamento do capsídeo viral e
início da síntese do cDNA pela
enzima transcriptase reversa.
5. Depois de formado o cDNA, ele se
une à enzima integrase e migra para
o núcleo.
6. A integrase insere o cDNA no DNA
da célula, e ele vira DNA proviral.
7. O vírus passa a controlar a síntese
celular, iniciando a produção de
RNA mensageiro viral.
8. No citoplasma, os RNAs sintetizam
grandes moléculas precursoras
(Gag, Gag-Pol e Env) — são
proteínas que posteriormente serão
cortadas por proteases celulares e
virais. Acontece, por exemplo, com a
glicoproteína 160, que após cortada,
dá origem às gp120 e gp41.
9. O genoma viral e as proteínas
migram para as extremidades da
célula. Esses componentes saem da
célula por brotamento, quando
adquirem o envoltório.
10. O processo de maturação das
partículas virais será completado
pela clivagem das moléculas Gag e
Gag-Pol pelas proteases virais.
*À medida que a infecção progride, outras
células são infectadas como por exemplo o
linfócito T CD4, que possui o receptor CD4
e o coreceptor CXCR4.
Mar����re� �� �n�e�ção p�� HI� �a
co���n�� �an��íne�
O RNA viral é o primeiro a ser detectado.
Após ele, seguem-se: a proteína p24 e os
anticorpos contra o vírus.
Após o aparecimento dos anticorpos, há
uma redução na proteína p24 e no RNA
viral.
Di�g�ós�i�� d� i���cção p��� HI�
Os testes laboratoriais atuais podem
detectar RNA ou DNA proviral, proteína
p24 e anticorpos anti-HIV.
Con����os ����r�a�t��
Janela clínica/aguda ou período de
incubação: período entre o momento da
infecção e o aparecimento de sintomas ou
sinais.
Janela de soroconversão, imunológica ou
sorológica: impossibilidade de detecção de
anticorpos.
Soroconversão: o organismo produziu
anticorpos em resposta a um antígeno. Na
maioria dos infectados por HIV, acontece
em 30 dias. Porém em outros pode demorar
até meses.
Janela diagnóstica: tempo decorrido entre
a infecção e o aparecimento ou detecção de
qualquer marcador.
Cla���fic�ção d� F�e���
A infecção recente por HIV pode ser
dividida em fases, baseando-se no
surgimento de diferentes marcadores.
Testes de 4ª geração e rápidos não
incluídos.
❏ Estágio 0 (ou eclipse): ausência de
marcadores no sangue. Dura em
média 10 dias, da data da infecção
até a 1ª detecção de RNA viral.
❏ Estágio I: o RNA viral é passível de
ser detectado. Duração média de 7
dias.
❏ Estágio II: testes para RNA viral e
proteína p24 são positivos. Duração
média de 5 dias.
❏ Estágio III: testes para RNA viral,
proteína p24 e ELISA (que detecta
anticorpos IgM anti-HIV) são
positivos. Duração média de 3 dias.
❏ Estágio IV: testes para RNA viral,
proteína p24 e ELISA reagentes.
Teste de Western Blot com padrão
indeterminado, com presença de
algumas bandas específicas de
HIV-1. Duração média de 6 dias. O
Western Blot só é considerado
reagente quando apresenta 2 das 3
bandas: p24, gp41 e gp120/160.
❏ Estágio V: testes para RNA viral,
proteína p24, ELISA e Western Blot
reagentes. Porém o WB ainda não
apresenta reatividade para p31
(pol). Duração média de 70 dias.
❏ Estágio VI: testes para RNA viral,
proteína p24, ELISA e Western Blot
(completo) reagentes. Duração
indefinida.
*Estudos indicam que os testes de 4ª
geração podem detectar amostras nos
estágios II ou no III, dependendo do
fabricante. Da mesma forma, os testes
rápidos, de 3ª geração, podem detectar no
II, III ou IV, dependendo do fabricante. Para
testes rápidos de fluido oral, não é possível
determinar em qual estágio de Fiebig eles
se encaixam.
Lim���ções �� �l���ific�ção
Foram utilizados no estudo apenas ensaios
sorológicos desenvolvidos unicamente com
proteínas do subtipo B, HIV-1.
Como a sensibilidade de qualquer um dos
testes para a detecção do HIV depende do
fabricante, é possível que os resultados de
testes de fabricantes diferentes
classifiquem a infecção em estágios
distintos.
Flu���r��a� p��� �i�g�ós�i��
O diagnóstico sorológico da infecção é
realizado com, pelo menos, dois testes: um
de triagem e um segundo para confirmação.
O 1° teste deve ser o mais sensível, e o 2° o
mais específico, a fim de eliminar falsos
positivos.
A combinação padrão-ouro e mais utilizada
é um ensaio imunoenzimático de triagem +
o Western Blot para confirmação.
No caso de discordância, os testes devem
ser repetidos. Se a discordância se repetir,
deve-se fazer os testes novamente
posteriormente.
Eta�� �� t�i���m: méto��� r��o��n���os
ELISA, MEIA, QL, EQL, ELFA, CMIA e testes
rápidos (imunocromatografia, aglutinação
de partículas de látex ou
imunoconcentração).
Eta�� ��m��em����r: méto��� r��o��n���os
Imunoblot, Imunoblot rápido, Western Blot
e Quantificação de carga viral.
*É recomendado pela MS o uso do exame
de quantificação de carga viral como teste
complementar, A infecção é confirmada
quando apresenta resultados iguais ou
superiores a 5000 cópias/mL.
Pri��ípi�� ��to���ógi��� d�� �es���
En�a�� i��n�e���máti�� (EL���)
Os testes ELISA do tipo sanduíche ou
imunométrico são muito utilizados. Esses
ensaios apresentam uma fase sólida, que
pode ser uma placa de plástico com poços
ou pérolas de plástico.
1. São fixados antígenos na parte
sólida.
2. Os antígenos ligam-se aos
anticorpos (imunoglobulinas)
presentes na amostra.
3. É adicionada uma solução de
proteínas recombinantes e
peptídeos sintéticos do HIV-1 e
grupo O e HIV-2, conjugadas com
uma enzima.
4. A adição de um substrato* produzirá
cor que será medida por um
espectrofotômetro.
5. Os resultados são determinados
pela leitura da densidade ótica,
obtida no final do ensaio.
En�a�� i��n�e���máti�� ��m�i��d� o� EL���
co���n��o �� �es��� d� 4ª ge��ção
São capazes de detectar simultaneamente
a presença de antígenos e/ou anticorpos em
uma amostra.
1. Na fase sólida estão fixados
anticorpos contra o antígeno p24 e
antígenos do HIV-1 (como gp160,
gp120 e gp41), antígenos do grupo
O e antígenos de HIV-2.
2. A presença de anticorpos, na
amostra, é detectada pela adição de
uma solução de proteínas
recombinantes e de peptídeos
sintéticos do HIV, conjugadas com
uma enzima. A presençade
antígenos, na amostra, é indicada
pela adição de uma imunoglobulina
anti-p24 conjugada a uma enzima.
3. A revelação da reação ocorre pela
adição de um substrato* que
resultará na formação de cor,
indicando a presença de antígenos
ou de anticorpos na amostra.
4. A intensidade da cor é medida por
um espectrofotômetro.
5. Cada conjunto diagnóstico indica
como calcular o ponto de corte.
En�a�� im���e�z��áti�� de mi���p���ícu���
(ME��)
1. A fase sólida é formada por
micropartículas de látex recobertas
com antígenos do HIV aos quais vão
se ligar os anticorpos da amostra.
2. As micropartículas ligam-se a uma
matriz de fibra de vidro.
3. É adicionado um conjugado
composto de antígenos
recombinantes do HIV e peptídeos
sintéticos do envelope do HIV-1 e
HIV-2, conjugados à biotina
(vitamina B7). Os antígenos do
conjugado ligam-se aos anticorpos,
formando um complexo
antígeno-anticorpo-antígeno.
4. Adicionado um 2° conjugado,
composto de anticorpos anti biotina
conjugados com uma enzima, o qual
se liga ao complexo
antígeno-anticorpo-antígeno.
5. Adicionado um substrato
(4-Metilumbeliferil-Fosfato) que
reage com a enzima, originando um
produto fluorescente
(4-Metilumbeliferona), que será
medido pelo equipamento.
6. A presença ou ausência de
anticorpos anti-HIV- ou/e anti-HIV-2
é determinada pela intensidade da
fluorescência obtida.
*Existem ensaios que utilizam a
metodologia MEIA e detectam
simultaneamente antígeno p24 e
anticorpos anti-HIV-1 e anti-HIV-2.
En�a�� im����ógi�� co� re����ção
el����qu���o��m��e�c���� (EQ�)
1. A etapa inicial ocorre em meio
líquido.
2. A 1ª incubação consiste na mistura
de: amostra do usuário, anticorpos
monoclonais anti-p24 marcados
com biotina, antígenos
recombinantes específicos do HIV
marcados com biotina, peptídeos
sintéticos específicos do HIV
marcados com complexo de rutênio,
anticorpos monoclonais anti-p24
marcados com complexo de rutênio
e antígenos recombinantes
específicos do HIV marcados com
complexo de rutênio.
3. Os anticorpos e os antígenos da
amostra se ligam com os antígenos
e anticorpos, respectivamente.
Formam assim complexos do tipo
sanduíche
(antígeno-anticorpo-antígeno e
anticorpo-antígeno-anticorpo)
4. São adicionadas micropartículas
revestidas com estreptavidina.
5. Na 2ª incubação, os complexos do
tipo sanduíche ligam-se à fase
sólida, por meio da interação entre
biotina e estreptavidina.
6. A mistura de reação é aspirada par
uma célula de leitura, em que as
micropartículas são fixadas
magneticamente à superfície de um
eletrodo. Os elementos não ligados
são removidos. A aplicação de
corrente elétrica no eletrodo induz
emissão quimioluminescente, que é
medida por fotomultiplicador.
7. A presença de anticorpos
anti-HIV-1 e/ou anti-HIV-2 ou de
antígeno p24 na amostra é
determinada pela intensidade de
emissão.
8.
En�a�� im����ógi�� co� re����ção flu�r���en��
(EL��)
1. A fase sólida é um cone no qual a
parte superior é recoberta com
anticorpos anti-p24, permitindo a
detecção de antígeno p2, e a parte
inferior é recoberta por antígenos
recombinantes e peptídeos
sintéticos do HIV-1 e HIV-2, e
permite a detecção dos anticorpos
anti-HIV.
2. No cone se misturam a amostra do
usuário e um reagente contendo
anticorpo anti-p24 marcado com
biotina. Nessa etapa ocorre a lise do
vírus da amostra para liberação dos
antígenos p24, que se ligarão aos
anticorpos anti-p24 fixados na parte
superior do cone, e aos anticorpos
anti-p24 marcados com biotina. Os
anticorpos anti-HIV presentes na
amostra ligam-se aos antígenos da
parte inferior do cone.
3. É adicionado, na parte inferior do
cone, um conjugado composto de
antígenos de HIV marcados com
biotina, que ligam-se aos anticorpos
presentes na amostra.
4. Adiciona-se um conjugado
composto de estreptavidina
marcada com uma enzima, que se
liga às biotinas presentes na parte
inferior e superior do cone.
5. Adição de um substrato da enzima
marcado com uma substância
fluorescente. A intensidade da
fluorescência é captada e medida.
En�a�� im����ógi�� qu���o��m��e�c����
(C�I�)
1. Antígenos recombinantes do HIV-1 e
HIV-2 fixados no poço de reação,
fase sólida.
2. Os anticorpos presentes na amostra
se ligam aos antígenos fixados,
formando um complexo
antígeno-anticorpo.
3. Adição de conjugado composto de
antígenos recombinantes de HIV
marcados com uma enzima
(peroxidase).
4. Conjugado se liga aos anticorpos do
complexo antígeno-anticorpo.
5. Adicionado substrato (derivado do
luminol e um sal perácido) e um
agente de transferência de elétrons.
6. A reação entre o conjugado e o
substrato origina um produto
luminoso, captado e medido.
*A presença ou ausência de anticorpos
anti-HIV-1 e/ou HIV-2 na amostra é
determinada pela intensidade de luz obtida.
En�a�� im����ógi�� qu���o��m��e�c����
ma��éti�� (C�I�)
1. Fase sólida formada por
micropartículas magnéticas
recobertas por antígenos
recombinantes de HIV-1 e HIV-2 e
anticorpos monoclonais anti-p24.
2. Os anticorpos da amostra se ligam
aos antígenos. Os antígenos p24 da
amostra ligam-se aos anticorpos.
3. Adição de antígenos recombinantes
de HIV-1, peptídeos sintéticos do
HIV-1 e HIV-2 e anticorpos
monoclonais anti-p24 marcados por
um derivado da acridina.
4. Adição do substrato da enzima com
peróxido de hidrogênio e hidróxido
de sódio
5. Produção de luz, medida pelo
equipamento.
6. A presença ou ausência de
anticorpos anti-HIV-1 e/ou HIV-2 ou
de antígenos é determinada pela
intensidade de luz obtida.