RESUMO DE BIOLOGIA MOLECULAR

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Roteiro de Biologia Molecular
Biologia Molecular: É o ramo da biologia busca a estudar os organismos de ponto de vista molecular.
DNA
DNA – Ácido Desoxirribonucleico é uma molécula orgânica que contém informação que coordena o desenvolvimento e funcionamento de todos os organismos vivos.
 É uma dupla fita, Alfa Hélice, Formada por Nucleotídeo ADENINA - GUANINA e CITOSINA – URACILA OU TIMINA no caso do RNA, e um açúcar uma “PENTOSE”.
Adenina e Guanina são bases purina e Citosina, Uracila e Timina são bases Pirimídicas.
O grupo fosfato fica ligado no quinto carbono do açúcar e no carbono um fica ligada a base nitrogenada.
 Adenina e Timina possuem duas ligações de Hidrogênio enquanto a Guanina e Citosina possuem três ligações.
Gene
Gene: é um segmento do DNA que codifica certa proteína.
 
DNA (gene) Proteína
- As proteínas vão gerar os fenótipos: Estrutural e Funcional.
- Sequencia Codante: é uma sequencia que gera uma proteína.
- Gene: é uma sequencia Codante.
- Genoma: é um conjunto de genes de um organismo vivo.
 - Ocupação do gene:
Sinalização celular
Sinalização celular: é a forma como uma célula comunica-se com outra a partir de sinais por elas emitidos. São esses sinais que determinarão quando e como uma célula deverá agir.
 Os organismos multicelulares necessitam de mecanismos de sinalização que permite a comunicação entre as células presentes em um sistema, com o objetivo de coordenar seu comportamento em benefício do organismo como um todo. Estes “controles sociais” são extremamente importantes para se estabelecer regras em um sistema pluricelular e controle da função de cada célula individualmente.
Sinalização Protéica: A partir dos sinais extracelulares os receptores respondem a estes sinais com os segundos mensageiros que enviam uma informação o que o primeiro mensageiro está pedindo até o interior nuclear. E então dentro do núcleo é procurado o gene específico para se produzir a proteína que foi requisitada.
Tipos de Receptores:
 Receptores Nucleares – de localização Intracelular, são receptores citosólicos que atuam principalmente na transcrição de genes através do DNA.
Regulam a transcrição de genes através de hormônios esteróides, tireóideanos, ácido retinóico e vitamina D. Um ligante atravessa a membrana e se liga no receptor no citosol onde migra para o núcleo, ocorrendo transcrição genética, sintetizando proteínas e assim gera efeitos celulares.
 Receptores de Membrana – localizados na membrana plasmática celular, se associam a ligantes hidrofílicos que não conseguem atravessar a bicamada lipídica.
- São eles 1 - Canais Iônicos, 2 - Integrinas, 3 - Receptores Enzimáticos e 4 - Receptores associados à proteína G (GPCR). Ao serem ativados, tais receptores transferem o sinal para mensageiros secundários que levam a mensagem para o citosol.
- O tipo de Receptor associado à proteína G - é um dos mais importantes na célula, pois pode amplificar o sinal recebido ao ativar varias enzimas e segundos mensageiros. A parte da GPCR que fica na membrana recebe o sinal extracelular (ligante), sofre uma modificação em sua conformação e ativa a proteína G. Ela também muda sua conformação (de GDP para GTP) e transmite o sinal, ativando moléculas efetoras.
- Receptores do Tipo Tirosina Kinase – os monômeros de domínios tirosina kinase são inativos, mas ao se ligarem a uma molécula sinal, formam dímeros e se ativam.  Ocorre, então  uma trans-fosforilação do grupo que passa a se ligar e fosforilar proteínas sinalizadoras intracelulares. Tais proteínas  posteriormente, transmitem um sinal que gera uma resposta celular a molecular sinal que se ligou inicialmente no receptor.
Controle do Ciclo Celular
- Período G1: é o intervalo de tempo que transcorre desde o fim da mitose até o início da síntese de DNA (S). Esta fase caracteriza-se pelo reinício da síntese de RNA e proteínas, que estava interrompida durante a mitose, e a célula cresce continuamente durante essa etapa, como continua fazendo durante S e G2.
- Período S: ocorre a duplicação ou síntese do DNA.
- Período G2: é o intervalo entre o término da síntese de DNA e a próxima mitose, também denominado período pré-mitótico.
- Período G0: fase estacionária (célula não entra na divisão celular)
Controle Celular
- Na fase G1: Ao final desta fase, há células que não iniciam um novo ciclo ou que não estão em condições de fazê-lo; essas células permanecem num estado denominado G0. Isso ocorre, ou por não haver mais nutrientes suficientes, ou por não ter atingido o tamanho necessário, ou simplesmente porque elas devem parar nesse estágio. 
- Na fase G2: Antes de se iniciar a mitose existe outro momento de controle. Se a replicação do DNA não ocorreu corretamente, o ciclo pode ser interrompido e a célula voltar a iniciar a fase de síntese. 
-Replicação do DNA: Todos os organismos devem duplicar seu DNA apuradamente, antes de cada divisão celular.
- A replicação do DNA, ocorre de forma semiconservativa, é iniciada em origens únicas e geralmente ocorre de forma bidirecional, a partir de cada origem de replicação.
- A replicação sempre acontece sempre de 3linhas 5 linhas, é uma atividade exonucleásica.
- Replicação semiconservativa: significa que metade da fita de DNA e conservada na hora da replicação. 
Replicação de DNA
1 passo 
- Descompactação da cromatina.
- Enzima DNA-Helicase abre a molécula de DNA. Rompe as ligações ponte de hidrogênio.
- A enzima DNA-Topoisomerase ou DNA girasse, matem a fita dupla linear. A molécula de DNA deixa de ser helicoidal com a ação desta enzima. Evita a formação de super-hélices.
2 passo
- Proteínas SSBs, de ligam ao DNA unifilamentar evitando que de enrole novamente ou forme pontes ou gaps. 
- A Enzima DNA-Polimerase III de acopla a fita de DNA unifilamentar para o inicio da replicação. 
3 Passo
- A Síntese continua ocorre normalmente com a adição de nucleotídeos complementares a fita de DNA unifilamentar pela ação da enzima DNA-polimerase III. 
- A medida que a nova fita é sintetizada as proteínas SSB se desligam permitindo o enovelamento do DNA.
4 Passo
- Síntese descontinua forma fragmentos de Okazaki.
- A DNA polimerase III apenas sintetiza fitas de DNA na direção 5’ a 3’. Sendo assim a segunda fita de DNA unifilamentar precisa ser duplicada em fragmentos para respeitar essa necessidade. 
- Um fragmento de RNA chamado primer se liga a fita de DNA unifilamentar permitindo que a enzima DNA-polimerase III possa fazer a síntese do fragmento.
5 Passo
- A fita descontinua possui diversos fragmentos de DNA não ligados. Estes fragmentos são conectados pela enzima DNA-ligase. 
- Os primers são substituídos por nucleotídeos de DNA pela mesma enzima DNA-polimerase I. 
- No final do processo duas duplas fitas de DNA são formadas tendo como molde as fitas unifilamentares.
- A DNA polimerase II serve para reparo a fita de nucleotídeos, quando o reparo for < 50% agontese o reparo. Quando esta 50% = 50% a p53 (Proteina como peso molecular 53 DALTON), bloqueia a ciclase. Quando o reparo for > 50% a p53 leva a célula para uma cascata de apoptose.
 		
- Origem de Replicação: são regiões específicas na sequência nucleotídica de moléculas de 
DNA, nas quais determinadas proteínas se ligam para abrir a dupla hélice deste ácido nucléico, permitindo o início da biossíntese (replicação) de novas moléculas de DNA. 
Essas regiões são ricas em adenina e timina. É energeticamente favorável para a célula quebrar as pontes de hidrogênio entre adenina e timina, visto que, as pontes de hidrogênio entre guanina e citosina são mais intensas.
Expressão Gênica: É o processo molecular responsável pela produção do fenótipo de uma determinada célula.
Este processo está divido em duas partes:
Gene: Corresponde a uma região particular de uma molécula de DNA. Cada gene determina a produção de molécula especifica de RNA, “transcrevendo” para ela seu código molecular.
RNA: Orienta a produção de proteínas traduzindo informações codificadas na molécula de RNA em uma sequência de aminoácidos, característica de cada molécula proteica.
- RNA: a partirda identificação do gene específico feito pelo segundo mensageiro feito dentro do invólucro nuclear. Inicia um processo de cópia daquele gene específico. O processo de cópia do DNA é chamado de TRANSCRIÇÃO, a cópia gerada é chamada RNA e o RNA e chamado de TRANSCRITO.
 A diferença entre o DNA e RNA:
- O RNA é uma cadeia única diferente do DNA que é uma dupla fita;
- O RNA possui açúcar RIBOSE e seus nucleotídeos;
- Os nucleotídeos do RNA possuem URACILA NO lugar de TIMINA.
Transcrição e processamento de RNA: A transcrição baseia-se no pareamento complementar de bases de uma das fitas de DNA molde, gerando uma molécula de mRNA. Esse processo é catalisado pela enzima RNA polimerase.
A RNA polimerase somente se movimenta no sentido 3 linha 5 linha da fita molde de DNA por tanto a fita de RNA é sempre no sentido 5 linha 3 linha.
- O fator de transcrição procura o gene e faz uma copia, RNAm.
- O RNAm entrega ao ribossomo no R.E.R.
Expressão gênica nos Procariotos (Bactéria)
RNA Polimerase: encontra o gene, e faz a copia.
Etapas
Região Iniciadora reconhece o TTGACAT box (-35), e iniciasse a síntese de transcrição; e o TATA box (- 10) o que indica que o gene foi copia e transferido para o um RNA, seguidos de CG, U.
Expressão gênica nos Eucariotos (Humano)
A transcrição dos eucariontes está dividida entre os três tipos de polimerase do RNA, chamadas de I, II e III. Os eventos que descreveremos a seguir referem-se ao mecanismo de início da transcrição executada pela polimerase do RNA II, aquela que sintetiza os RNAm.
A transcrição em eucariontes é bem mais complexa que em procariontes. Nos eucariontes a transcrição ocorre no núcleo, enquanto a tradução ocorre no citoplasma. Já nos procariontes tal separação celular não existe, sendo os dois processos muito bem acoplados no espaço. A separação temporal e espacial desses dois processos nos eucariontes permite a eles uma melhor regulação da expressão gênica.
Nos eucariotos a transcrição dos genes envolve a participação de fatores de transcrição (TF) envolvidos no reconhecimento da região promotora e na ativação da RNA polimerase, denominados de TF basais.
As células eucarióticas possuem RNA polimerases I, II e III. Essa três polimerases possuem ações definidas. A polimerase I transcreve genes que codificam o RNA ribossomal (rRNA). A polimerase II transcreve genes que codificam proteínas na forma de RNA mensageiro (mRNA) e  pequenos RNAs. Sua regulação é relacionada com a diferenciação e manutenção da identidade celular, tal como repostas da célula perante alterações ambientais. A polimerase III se dedica à transcrição de um grande número de genes relacionados com RNA de interferência e RNA transportador (tRNA), com tamanho máximo de 400 pares de base.    
RNA polimerase I
A RNA polimerase I atua em regiões promotoras específicas denominadas 18s, 28s e 5,8s, atuando na transcrição dos genes ribossomais. Dessa forma, a atividade dessa enzima interfere na produção do ribossomo, interferindo indiretamente na tradução celular, ao inibir a síntese de RNA ribossomal, a célula pode entrar em processo de morte celular por apoptose ou autofagia, ou em processo de senescência.
RNA polimerase II
A RNA polimerase II é uma enzima com 12 subunidades que transcreve genes que codificam RNA mensageiro, tendo grande impacto na diferenciação e manutenção celular. Já foram descritas modulações em diversos estágios da transcrição, sendo que tal ação é um mecanismo central no controle da expressão gênica. Para o início da sua ação, a RNA polimerase II conta com a ação de fatores de transcrição como o TF-IIB, o TF-IID, o TF-IIF e o TF-IIH que geram, em regiões específicas do DNA, complexos de pré-iniciação. Tais complexos auxiliam a ligação da RNA polimease II às regiões do DNA que serão transcritas, assim como estimulam a saída da RNA polimerase II da região promotora. A subunidade TAF do TF-IID, pode estar ligada à proteína TBP (TATA Box-bindingProtein), formando um complexo que irá interagir com sequências TATA presentes no DNA, sinalizando os genes que serão transcritos pela RNApol II. O complexo formado por RNA pol II e o TF-IIF interage com o complexo TF-IIB e TBP juntamente com a região promotora do DNA, resultando no complexo de iniciação da transcrição. Tal complexo se liga ao TF-IIE e ao TF-IIH, formando o denominado complexo de pré-iniciação (PIC) que contém no seu sitio ativo DNA de dupla fita, que será transcrito. Na presença de nucleotídeos, uma porção central do DNA sofre separação das fitas, gerando uma bolha de transcrição Nessa bolha, uma das fitas do DNA atua como molde e passa próximo ao sítio ativo da RNA pol II. Desta forma, a RNA pol II consegue exercer sua ação enzimática em cadeia, formando o RNA mensageiro.  
RNA polimerase III
A RNA polimerase III sintetiza os tRNA, rRNA 5S, rRNA 7S e alguns snRNA.
CAP 5’
Cap 5' é uma estrutura típica de mRNA dos eucariotos, a qual é gerada pela ligação 5'-5' trifosfato entre a extremidade 5' de uma molécula de mRNA precursora e um nucleotídeo alterado (GMP metilado). O Cap 5' protege o mRNA contra a ação de ribonucleases, proteção contra a ação de fosfatases e também é responsável por interagir com complexos protéicos que processam, exportam o mRNA para o citosol e promovem a ligação deste com os ribossomos.
Etapas para a formação do CAP 5'
A formação do CAP exige uma série de alterações químicas na estrutura do RNA. Primeiramente, um fosfato da extremidade 5’ do RNA deve ser liberado por hidrólise, gerando uma extremidade 5’ difosfato.
Essa extremidade difosfato deve então se ligar a um átomo de fósforo a de um GTP, gerando uma ligação incomum 5’-5’ trifosfato.
O nitrogênio que se encontra na posição 7 da guanina da extremidade deve então sofrer uma metilação, mediada pela enzima S-adenosil-metionina, formando o chamado cap 0.
As riboses dos dois primeiros nucleotídeos do RNA podem também ser metiladas na extremidade 2'-OH, formando os chamados cap 1 e cap 2.
Representação esquemática da adição do Cap na extremidade 5' do mRNA de eucariotos. Na extremidade 5' do RNA recém-formado é adicionado um guanilato na orientação reversa (ligação 5’-5’), com posterior adição de grupamento metil na posição 7’ do nucleotídeo (7-metilguanilato). 
Cauda Poli-A
Além dos capacetes, a maioria dos RNA’s eucarióticos são alterados de forma a conter uma cauda de poliadenilato na sua extremidade 3’. Nessa cauda estão presentes cerca de 200 ácidos nucleicos, que se enrolam ao redor de várias cópias de uma proteína ligadora. Essa cauda tem a função de atuar como acentuadora da tradução, proteger o mRNA da digestão por nucleases presentes no meio e proporcionar uma maior estabilidade à molécula. Especula-se que ela também tenha um papel importante no transporte do mRNA para o citoplasma.
É interessante notar que o nucleotídeo que se encontra logo antes da cauda poli-A não é o último que será traduzido e podem haver mais centenas de nucleotídeos além da extremidade 3’ de um RNA maduro.
 Formação da cauda Poli-A
Os nucleotídeos contendo a adenina não são codificados pelo DNA e são adicionados posteriormente ao mRNA. 
Como o mecanismo celular sabe onde deverá ser adicionada a cauda poli-A? 
Estudos mostraram que os transcritos primários de RNA são clivados através de uma endonuclease específica que reconhece a sequência AAUAAA. Entretanto, apenas essa sequência não é suficiente para que ocorra o corte, é também necessário que haja um contexto ainda desconhecido de nucleotídeos próximos que caracterizem a região.
Após o corte, uma enzima polimerase poli-A, dependente de ATP, acrescenta os nucleotídeos contendo a base adenina na extremidade 3’ do RNA.
 Sobre a interrupção dos genes
Até a pouco tempo atrás, pensava-se que os genes celulares eram compostos por arranjos contínuos de nucleotídeos. Somente em 1977 descobriu-se a existência de genes interrompidos. Assim, quando se olhava o DNA, percebia-se que o gene possuía mais nucleotídeos do que aqueles encontrados no mRNA (necessários para a produção de proteínas).
Hoje,sabe-se que os transcritos primários de RNA contêm a cópia de toda sequência presente no DNA e que algumas partes dessa sequência são recortadas dessa molécula de forma a produzir o RNA funcional.
As sequências que são retiradas do transcrito primário foram chamadas de íntrons e aquelas que permaneceram como parte do RNA funcional, exons.
 Processamento alternativo
É interessante notar que, para algumas proteínas, o conceito de íntrons e exons é meio confuso. Com essas proteínas acontece o chamado processamento alternativo. Nesse tipo de processamento pode-se dizer que os íntrons e os exons são tecido-específicos, ou seja, em um tecido ele pode ser um íntron e em outro tecido ele pode funcionar como exon. Isso pode caracterizar funções específicas de uma mesma proteína em um determinado tecido. Deve-se notar que os fatores que controlam esse corte específico ainda são pouco conhecidos.
Splicing
O splicing consiste na retirada dos íntrons de um RNA precursor, de forma a produzir um mRNA maduro funcional.
Essa excisão dos íntrons do mRNA é um evento muito importante e requer uma extrema precisão das enzimas envolvidas no processo. A falta ou o acréscimo de um único nucleotídeo em um exon pode levar a uma alteração da fase de leitura e a produção de uma proteína completamente diferente da original.
A análise das sequências de milhares de uniões íntro-exon de eucariotos permitiu a definição de  consensos apresentados dentro dessa região de corte. 
Esses dados mostraram que a grande maioria dos íntrons começa com uma sequência GU e termina com AG.  A sequência de consenso no ponto de corte 5’ dos vertebrados é AGGUAAGU e na extremidade 3’ dos RNAs de mamíferos, o consenso é um trecho contendo 10 pirimidinas (C ou U), seguidas por uma base qualquer, um C e uma sequência final.
Além disso, os íntrons possuem ainda, um importante ponto interno, chamado de ponto de ramificação, situado entre 20 e 50 nucleotídeos antes do ponto de corte 3’ e que não é muito conservado nos mamíferos.
O restante do íntrons é extremamente variável e não tem muita importância no processo de splicing, o que foi provado com a produção de íntrons quiméricos através de experimentos biomoleculares.
Deve-se notar ainda que formas de algumas doenças, como a talassemia, podem ser causadas pela mutação em regiões intrônicas (nesse caso a mutação criou um novo local de corte para o íntrons, produzindo um sinal de parada precoce da proteína).
Código Genético
O código genético do DNA se expressa por trincas de bases, que foram denominadas códons. Cada códon, formado por três letras, corresponde a certo aminoácido.
Dizemos que o código genético é universal, pois em todos os organismos da Terra atual ele funciona da mesma maneira, quer seja em bactérias, em uma cenoura ou no homem.
O códon AUG, que codifica para o aminoácido metionina, também significa início de leitura, ou seja, é um códon que indica aos ribossomos que é por esse trio de bases que deve ser iniciada a leitura do RNAm.
Note que três códons não especificam nenhum aminoácido. São os códons UAA, UAG e UGA, chamados de códons e parada durante a “leitura” (ou stop códons) do RNA pelos ribossomos, na síntese Protéica.
Controle da expressão gênica nos procariotos (Bactéria)
Um óperon é uma unidade funcional do genoma, na qual duas ou mais regiões codificadoras de um produto gênico (de RNA ou proteico) ocupam posições adjacentes, estão coorientadas e têm a sua transcrição controlada por um mesmo conjunto de sequências reguladoras . Muitas vezes, por simplificação, as diferentes regiões codificadoras presentes em um óperon são referidas como “genes estruturais” ou apenas “genes”, e é comum que os diferentes “genes” de um óperon codifiquem produtos funcionalmente relacionados em algum grau (p. ex., em óperons que codificam diferentes tipos de rRNA ou em óperons que codificam diferentes enzimas que participam de uma mesma via metabólica).
operon lac: Regulação de genes para metabolizar a lactose. Lac repressor, proteína ativadora de catabólito e AMPc.
É o controlador da síntese das enzimas metabolizadoras de lactose a qual três enzimas fazem parte. O RNAm do operon lac é dito policistrônico ou poligênico pois possui informação para codificar as 3 proteínas.
BETA-GALACTOSIDASE:
Ela é capaz de quebrar a lactose em glicose e galactose.
TRANSACETILASE: Metaboliza outros dissacarídeos que não a lactose.
PERMEASE: É a enzima responsável pelo transporte de lactose do meio extracelular para o meio intracelular.
1) Na ausência de Lactose, não existe 1,6-alolactose e portanto a Proteína repressora Lac permanece ligada à sequência operadora impedindo a transcrição do DNA.
2) Na presença de Lactose, parte desta é convertida a 1,6-alolactose que se liga à Proteína Repressora Lac e reduz a afinidade desta pela sequência operadora. Com a saída da Proteína repressora Lac da sequência operadora os genes estruturais podem ser transcritos na forma de um mRNA policistrônico ou poligênico.
 Mesmo na ausência de lactose, existe transcrição basal dos genes estruturais.
Controle da expressão gênica eucarioto
Regulação gênica é o processo de controlar quais genes no DNA da célula são expressos (usados para produzir um produto funcional como uma proteína).
Em eucariontes, como os humanos, a expressão gênica envolve várias etapas e a regulação de genes pode acontecer em qualquer uma delas. Contudo, muitos genes são regulados primariamente no momento da transcrição.
A expressão gênica eucariótica pode ser regulada em vários estágios
O processo de regulação da expressão dos genes em células eucarióticas é muito mais complexo, podendo ocorrer em diversos níveis (estrutural, transcricional, pós-transcricional, traducional, pós-traducional). Para simplificar, abordaremos o modelo transcricional, que possui duas principais estratégias: a regulação permanente e a regulação transitória.
A regulação permanente ocorre quando há uma modificação no DNA que altera de forma definitiva suas propriedades de expressão. Dois exemplos são comumente citados: a recombinação somática, na qual os segmentos gênicos que irão estruturar os genes relacionados à síntese de importantes proteínas do sistema imune, as imunoglobulinas e os receptores de célula T.
O outro exemplo é a inativação do cromossomo X nas fêmeas. O processo, que ocorre a partir do centro de inativação do cromossomo X, é bastante precoce no desenvolvimento, ocorrendo por volta da segunda semana da embriogênese. Neste momento, um dos cromossomos X é inativado, em um processo de compensação de dose dos produtos gênicos codificados pelos mais de 1000 genes localizados no cromossomo X. Após ser metilado, o cromossomo inativo permanece condensado, podendo ser observado sob microscopia óptica na forma do corpúsculo de Barr ou cromatina sexual.
A regulação transitória pode ocorrer de forma direta, quando a molécula sinalizadora tem propriedades hidrofóbicas e consegue atravessar diretamente a membrana, levando sua mensagem ao interior da célula, ou de forma indireta, quando a molécula sinalizadora possui características hidrofílicas e necessita de um receptor transmembrana para conduzir sua mensagem ao interior da célula. A percepção do sinal pelo receptor desencadeia uma série de reações no interior da célula, culminando com a atividade genética modulada.
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