Mecanismos de interação Ag-Ac e métodos imunológicos

Prévia do material em texto

Mecanismos de interação Ag-Ac
Imunodiagnóstico: diagnóstico laboratorial com técnicas imunológicas, buscando revelar presença de antígeno e anticorpo no organismo do indivíduo.
· Antígeno: substâncias capazes de induzir resposta imune específica. 
Imunogenicidade é a resposta imune humoral e/ou mediada por células. 
Antigenicidade é a capacidade de se ligar com o produto da resposta imune celular e/ou humoral.
Epítopos são regiões imunologicamente ativas de um imunógeno, onde se ligam receptores de membrana específicas do antígeno nos linfócitos ou imunoglobulinas, é ele quem dá a imunogenicidade, é uma região variável.
· Imunoglobulinas: glicoproteínas formadas por no mínimo 4 cadeias polipeptídicas que neutralizam, aglutinam, precipitam e realizam outras funções contra o antígeno. Necessitam outros agentes para eliminar o antígeno.
IgM: estágios iniciais da doença, resposta imune primária. Primeira imunoglobulina produzida pelo feto. Alta atividade aglutinante, ativa e fixa complemento. Está também em secreções.
IgG: única que atravessa a placenta. De maior [ ] no soro. Não se pesquisa ela em recém nascidos. Ativa e fixa complemento, 1ª linha de defesa do RN, de forma passiva (mãe passa). Fase crônica de doenças – IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
IgA: em secreções. Ativa o complemento pela via alternada. Fase aguda e intermediária.
IgD: não ativa nem fixa complemento. É receptor de antígeno na membrana de linfócitos B. De fase aguda, em doenças autoimunes do tecido.
IgE: alergias e parasitoses. Não fixa, mas pode ativar o complemento pela via alternada. Promove citotoxicidade, envolvendo eosinófilos. Reações de hipersensibilidade tipo 1.
Anticorpos monoclonais: produz anticorpo específico para um epítopo antigênico. Ex.: HCG.
Reações antígeno-anticorpo
· parátopo do antígeno reage com epítopo do antígeno.
· ligações não covalentes que isoladas são fracas, mas em conjunto conferem estabilidade ao processo. Forças são: Van der Waals, eletrostáticas, pontes de H e hidrofóbicas.
· afinidade: força de ligação resultante do total de forças entre epítopo e anticorpo. Quando alta, o complexo ag-ac fica unido.
· avidez: medida de estabilidade do complexo ag-ac. Depende da afinidade do anticorpo pelo epítopo, valência do anticorpo e do arranjo geométrico.
baixa avidez: Ig se dissocia.
· ↑ac ou ↑ag: reação inespecífica ou não reação. 
· ac = ag: equivalência, forma rede e ocorre reação.
· limiar de reatividade: ideal, 100% sensível e específico; porém é utópico, não existe. O real tem um ponto de máxima eficiência. Testes podem ler máxima sensibilidade e baixa especificidade.
Janela imunológica: semanas de infecção
Técnicas de 1ª geração são menos rápidas do que as de 4ª geração, que detectam infecção aguda.
Imunoensaios
· Reagentes não marcados: menor sensibilidade, precisa formar grandes complexos ag/ac. Ex.: precipitação e aglutinação.
· Reagentes marcados: amplificação do sinal, aumenta sensibilidade.
· Aplicações dos testes imunológicos: diagnóstico presuntivo e diferencial; diferenciação das fases da doença; diagnóstico de alergias, de doenças autoimunes, de imunodeficiências; avaliação; imunidade celular e humoral; dosagens hormonais, marcadores humorais; seleção de doadores de sangue e órgãos; avaliação da imunidade (vacinas); pesquisa.
· Vantagens dos testes imunológicos: rapidez, simplicidade, possibilidade de automação, kits comerciais padronizados, variante técnica, diversidade de materiais biológicos.
Métodos, técnicas e reações imunológicas
Diretos: pesquisa de antígenos.
Indiretos: pesquisa de anticorpos.
Reações imunológicas: não utilizam compo-nentes marcados. Neutralização, precipitação, ativação do complemente, citotoxicidade, aglutinação.
Reações imunológicas I
Reações de precipitação:
· Eletroforese: migração de partículas carregadas em um solvente sob a influência de um campo elétrico. Não é imunológica pois não tem ligação ac/ag, se baseia na diferença de cargas. A corrente em meio semissólido inerte faz arrastar proteínas por carga.
· Imunodifusão radial: a difusão de uma substância solúvel em meio fluido é um processo em que a mesma é transportada de uma parte para outra com resultado de movimento molecular ao acaso. Tem reação antígeno/anticorpo. As proteínas difundem radialmente.
· dupla: antígeno e anticorpo em um círculo, quando se encontram as proteínas difundem-se e precipitam. Usada na micologia (fungos).
· simples: incorpora-se proteína ao ágar, divide a placa em partes e coloca a amostra que difunde até reagir com anti-proteína, forma-se um halo ao redor. Quanto maior o halo, mais proteína tem. Quantifica e identifica proteínas.
· Imunofixação: eletroforese para separar proteínas, aplicação de antissoro específico (IgG, IgM, IgA, Kappa e Lambda) em faixas separadas. As proteínas não precipitadas são lavadas e o precipitado é corado. Permite definir o tipo de alteração.
· Imunoeletroforese: eletroforese + imuno-difusão radial dupla e precipitação das proteínas.
· Contraimunoeletroforese: é a propriedade de arrastamento, pela corrente de eletroendosmose das moléculas de anticorpo menos eletronegativos, que reagirão e precipitarão quando houver identidade e presença de antígeno. Reação que se soma à imunodifusão radial dupla.
· Turbidimetria: substitui a imunodifusão. Mede a luz transmitida através de uma suspensão de partículas, mede a turvação da solução. As leituras turbidimétricas medem a intensidade da luz que ocorre como resultado de combinação entre reflexão, absorção e a dispersão da luz incidente. Quanto mais turvo, menos absorve luz e mais proteína tem. É rápida, sensível, quantitativa de luz dispersada. 
· Nefelometria: método direto para medir luz dispersada por partículas suspensas na solução. A quantidade de luz dispensada pelo complexo ag-ac na solução será afetada pelo tamanho e forma do complexo. Luz é diretamente proporcional à [analito].
*para pesquisa de proteínas: 1º eletroforese (separa), 2º turbidimetria (quantifica e caracteriza).
Reações de aglutinação
Acúmulo visível de partículas como resultado de interação entre aglutinina, usualmente um anticorpo e aglutinógeno ou antígeno.
· Ativa/direta: pesquisa antígeno ou anticorpo. Antígeno particulado é aglutinado diretamente pelo anticorpo.
· Passiva/indireta: sempre pesquisa anticorpo, pois o antígeno está fixo. Antígeno acoplado a um suporte inerte, se tem anticorpo no meio aglutina. É um teste que não utiliza o antígeno isolado, mas sim acoplado a uma partícula inerte.
· Passiva Reversa: pesquisa anticorpo. Agora o ac está fixo na partícula inerte. Consiste na aderência do anticorpo à parículas inertes que poderão ser utilizadas para detectar a presença de um antígeno.
· Inibição: detecção de antígenos pesquisa hormônios e de anticorpos pesquisa anticorpos contra vírus.
Reações imunológicas II
Reações de imunofluorescência: para identificar antígeno e classes específicas de anticorpos. Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpos se ligarem covalentemente a fluorocromo sem perder a reatividade específica com o antígeno. Alta sensibilidade.
· Direta: localização de antígenos em células ou tecidos, usando um anticorpo específico anti-antígeno, marcado com fluorocromo. 
· Indireta: usa um anticorpo anti-imunoglobulina marcado por fluorocromo, e o objetivo é detectar o anticorpo que se liga a um antígeno fixado em lâmina.
Reações de enzimaimunoensaio: o marcador é uma enzima.
· Colorimétrico: analitos (antígeno ou anticorpo) são avaliados de forma qualitativa ou quantitativa através da medida da intensidade da atividade enzimática sobre um substrato.
· EMIT: método competitivo, usa antígeno marcado com enzima. Quanto mais antígeno na amostra, menos sítio de ligação do anticorpo estão disponíveis para ligar ao marcador (Ag-E), sobrando enzima livre para agir no substrato. É homogêneo, amostra, + ac + ag-E. 
· ELISA: qualitativo e quantitativo. Detecta antígeno e anticorpo. Heterogêneo. Para anticorpo pode ser indireto, captura de IgM ou competição com anticorpo marcado. Paraantígeno pode ser captura ou competição com antígeno marcado. Baseado na imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida.
· teste de avidez IgG: identificar e diferenciar infecção recente de infecção pregressa. Os anticorpos novos não tem tanta avidez na ligação. Se ↑avidez, os anticorpos são pregressos. Muito feito em grávidas.
· Fluorimétrico: variações do ELISA, para analitos de alto e baixo peso molecular em fluídos biológicos. Baseia-se na captura de antígeno ou anticorpo usando uma fase sólida. A fluorescência é produzida com a ligação entre substrato e conjugado enzimático. É de 4ª geração, usa como confirmação para testes. Mesma enzima, mas o substrato é fluorimétrico.
· MEIA: em micropartículas suspensas e revestidas com anticorpo ou antígeno. A área de superfície das micropartículas aumenta a cinética do ensaio e diminui o tempo de incubação.
· ELFA: é um ensaio imunoenzimático fluorimétrico que usa fase sólida revestida de antígeno ou anticorpo, um conjugado enzimático e substrato que fornece complexo fluorescente. De 4ª geração, permite pesquisar tanto antígeno quanto anticorpo, muito sensível, rápido, 1ª linha para IgM.
· UNICAP: sistema específico para determinar IgE total e específica, estando o anticorpo ou alérgeno ligados covalentemente à fase sólida. Ensaio heterogêneo quantitativo, onde as [ ] são calculadas por curvas de calibração.
· DELFIA: imunofluorimetria em tempo resolvido. Usa quelatos de lantanídeos (európio, samário) que em equipamentos (fluorômetros) eliminam a reação fluorescente de fundo que interfere quando se utiliza substância fluorescente convencional, aumentando a qualidade de detecção. Para hormônios, marcadores tumorais, teste do pezinho. Sistema fechado.
· Fluorescência polarizada: luz emitida pelo marcador fluorescente pode ser polarizada ou despolarizada dependendo do tamanho das moléculas. As moléculas grandes como as formadas quando um marcador fluorescente se liga a um anticorpo, por si só giram lentamente e emitem luz polarizada. O grau de polarização é inversamente proporcional à quantidade de antígeno presente no material biológico.
· Quimioluminescente: CLIA. Excitação (emissão de luz) por reação química de oxidação com agentes quimioluminescentes derivados biológicamente. A luminescência é a emissão de luz associada com a dissipação de energia de uma substância que se encontra em estado eletricamente excitado. Luminol, isoluminol ou éster de acridina (não precisa catalisador, tem menor interferência de fenda, tem alto rendimento, alta sensibilidade e se conjugado não limita) emite luz quando encontra enzima. A emissão de luz é detectada e medida utilizando luminômetros com sistema fotomultiplicadore. Substitui o MEIA.
Reações de radioimunoensaio: usa radioisótopos ao invés de fluorocromo. Maior sensibilidade que imunofluorescência. Hoje usa-se na pesquisa. Anticorpo marcado com radioisótopo. Quali e quanti. Para hormônios e marcadores humorais.
Reações imunológicas III
Reações de eletroquimioluminescência: ECLIA. Substâncias ativas quimicamente são geradas a partir de precursores estáveis na superfície de um eletrodo. Rutênio e ósmio. Automatizado. Pesquisa anticorpo e antígeno. Mais usado para marcadores tumorais, hormônios e doenças infecciosas.
Reações de imunocromatografia: usa várias membranas como fase sólida, onde se fixa os antígenos ou anticorpos e os controles. Reação Ac/Ag com marcadores como Au/Ag coloidal. “Testes rápidos”. Alta sensibilidade, serve como elemento de triagem pois dá: neg/pos/inválido. Pode ser de fluxo lateral, de dupla migração. De 4ª geração.
Reações de imunoeletrotransferência: identificação de proteínas (Ag/Ac). 1º prepara a amostra solubilizando proteínas. 2º separa proteínas por eletroforese. 3º fixa em fita de nitrocelulose. 4º bota em solução com anticorpo específicos, então ocorre uma nova imersão em solução anti-Ig marcada com enzima. 5º revelação adicionando cromógeno.
Reações de Imunoluminimetria
· Citometria de fluxo fluorescente: separa, conta, examina e classifica partículas microscópicas (células) suspensas em meio líquido em fluxo. É Ag/Ac mas detecta elementos da membrana celular. Permite avaliação simultânea de muitos parâmetros das células a medida que elas passam por feixe de luz no meio líquido. Aplicações: imunofenotipagem, viabilidade celular, ciclo celular, proliferação, marcação intracelular.
· em partículas: acopla à CFF um complexo informatizado para fazer reações múltiplas usando microesferas coradas como base. Cores diferentes, λ diferentes, mas do mesmo tamanho. Em cada partícula bota Ac-anti”algo”. Determina pela cor e não pelo tamanho. Em uma mesma preparação pode identificar citocina, marcadores tumorais, hormônios...