RESUMO - Testes sorológicos - imuno

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Testes sorológicos (cap 2): 
_____Introdução:_____ 
● Testes sorológicos → Técnicas usadas 
para detectar e quantificar antígenos (Ag) e 
anticorpos (Aa), ou outras substâncias que 
desempenham o papel de antígeno no 
ensaio (ex: fármacos, hormônios, ácidos 
nucleicos, citocinas, receptores celulares, 
etc). 
● Podem utilizar reagentes marcados ou 
não marcados. 
 ↳ ensaios clássicos com reagentes 
não marcados ￫ sensibilidade de detecção 
menor ￫ necessita formação de grandes 
complexos Ag-Aa para que sejam 
detectados. 
 ↳ ensaios com reagentes marcados ￫ 
amplificam o sinal ￫ sensibilidades de 
detecção maior. 
OBS: A amplificação do sinal também pode 
ser obtida com o emprego de partículas. 
● Os testes sorológicos têm se tornado cada 
vez mais refinados e de execução simples, 
porém, para garantir a qualidade dos 
resultados é necessário manter um controle 
bem rigoroso. 
● A fim de eliminar erros sistemáticos, é 
aconselhável manter um programa de 
controle de qualidade permanente para 
avaliar equipamentos, reagentes e outros 
fatores. 
__________Teste de 
imunofluorescência____ 
Baseia-se na capacidade das moléculas 
de anticorpo de se ligar covalentemente a 
fluorocromos sem perder sua reatividade 
específica com o antígeno. 
↳ Fluorocromos → substâncias que 
absorvem luz de um comprimento de onda 
menor e, instantaneamente, emitem luz de 
comprimento de onda maior (menor 
energia), quando excitadas com luz de alta 
energia, constituindo o fenômeno 
denominado fluorescência. 
 ↪ apresentam moléculas complexas, 
frequentemente sob a forma de anéis com 
duplas ligações. 
↪ A conjugação do fluorocromo com 
o anticorpo se faz por meio dos grupos 
amino da lisina, que não são críticos para a 
atividade do anticorpo (ex: ligação 
tiocarbamida, sulfonamida etc). 
Teste de imunofluorescência direta: 
● empregado na pesquisa e localização de 
antígenos em células ou tecidos, por meio 
de um anticorpo específico marcado com 
fluorocromo (conjugado). 
↳ imunocomplexo estável → conjugado 
fixado ao antígeno. 
● O anticorpo não ligado é removido por 
lavagens e o preparado é observado em 
microscópio de fluorescência. 
● Apresenta elevada sensibilidade e 
especificidade, mas requer o preparo de um 
conjugado para cada sistema que se queira 
estudar. 
● Principal aplicação → na imunocitoquímica 
→ demonstração de vários antígenos de 
células e tecidos, principalmente nas doenças 
imunológicas renais e de pele. 
● Empregando-se anticorpos de diferentes 
especificidades marcados com fluorocromos 
contrastantes, podem-se localizar 
componentes diferentes dentro de uma 
célula, diferenciar uma célula de outra ou 
localizar a distribuição de antígenos em 
células ou tecidos. 
Teste de imunofluorescência indireta: 
● Empregado para amplificar o sinal e 
aumentar a sensibilidade de detecção. 
● Pode ser empregado na pesquisa de 
antígenos ou de anticorpos. 
 ↳ Pesquisa de Antígenos: 
↪ incubação da célula ou tecido em 
que se quer pesquisar o antígeno com o 
anticorpo específico obtido em animal 
conhecido ou monoclonal → 
imunocomplexo. 
↪ Após a lavagem → preparação é 
incubada com um conjugado de anti-
imunoglobulina produzida em outra espécie 
de animal. 
↪ Vantagens ￫ É mais sensível, (o 
anticorpo não marcado tem mais sítios de 
ligação que o antígeno) → ocorre uma 
amplificação com o uso de dois anticorpos. 
É mais fácil de ser controlada e pode-se 
utilizar um único conjugado para diferentes 
sistemas. 
↪ Desvantagens ￫ necessita maior 
tempo de reação, mais reagentes e pode 
ser menos específica (O teste pode ser 
utilizado nos mesmos sistemas que 
empregam o método direto, com aumento 
de sensibilidade). 
 ↳ Pesquisa de Anticorpos: 
 ↪ Antígenos padronizados são 
fixados a lâminas de vidro. O soro do 
paciente é diluído, colocado sobre o 
antígeno e incubado ￫ complexo antígeno-
anticorpo. 
 ↪ Após lavagens, a preparação 
é incubada com o conjugado fluorescente e, 
se houver anticorpo no soro, o conjugado 
(fluoresceína ligada à anti-imunoglobulina) 
reage com o anticorpo específico para o 
antígeno. 
↪Utilizando-se diluições seriadas 
do soro é possível determinar o título de 
anticorpos, que será o inverso da máxima 
diluição em que se observa fluorescência. 
 ↪ Pode apresentar falsos-
positivos e falsos-negativos. 
 ↪ Vantagens ￫ é sensível, 
específica, reprodutível, de padronização e 
execução simples. O mesmo conjugado 
pode ser utilizado em sistemas diferentes. 
Podem-se determinar as classes e 
subclasses de anticorpos empregando-se 
conjugados específicos. 
↪ Desvantagens ￫ A necessidade de 
microscópio de fluorescência, a subjetividade 
na leitura e a não automação representam 
limitações do teste. 
_______________Técnicas 
Imunoenzimáticas_____ 
● Utilização de antígenos ou anticorpos 
marcados com enzimas que permitem a 
detecção, titulação e quantificação de 
substâncias de interesse biológico. 
● Fator importante → Eficiência do 
conjugado empregado. 
● Métodos utilizados para: 
 ↪ localizar de constituintes celulares. 
 ↪ medir pequenas quantidades de 
Antígenos, haptenos e anticorpos. 
 ↪ detectar imunoprecipitados. 
 
Imunoperoxidase: 
● Enzima → Peroxidase. 
 ↪ é de fácil coloração e fornece 
resultados satisfatórios e reprodutíveis. 
Permite a detecção simultânea de dois ou 
mais constituintes celulares (depende do 
cromógeno utilizado). 
● Mesmo princípio da imunofluorescência 
→ em vez do fluorocromo, emprega-se a 
enzima, que tem maior capacidade de 
amplificação. 
 ↪ A enzima converte o componente 
cromógeno (substrato+ doador de 
hidrogênio) em um produto insolúvel que 
precipita no sítio da reação → podem ser 
visíveis ao microscópio óptico comum e, 
adicionando-se tetróxido de ósmio, ao 
microscópio eletrônico. 
● outras enzimas → fosfatase alcalina e 
glicose oxidase. 
● Técnica PAP: (peroxidase-antiperoxidase) 
 ↪ O anticorpo específico reage com 
o antígeno da lâmina. 
 ↪ coloca-se uma anti-imunoglobulina. 
 ↪ adiciona-se um complexo solúvel 
(peroxidase combinada com antiperoxidase). 
Esse complexo se liga à anti-imunoglobulina 
já fixada ao primeiro anticorpo ￫ incorpora a 
peroxidase ao sistema. 
 ↪ Adiciona-se o cromógeno ￫ 
precipitado marrom. 
● Mesmo princípio da imunofluorescência 
indireta (na pesquisa de anticorpos). → com 
a vantagem de fornecer preparações 
duradouras. 
 ↪ Antígenos fixados à lâmina, 
incubados com diluições do soro onde se 
quer pesquisar os anticorpos específicos. 
 ↪ Após lavagem ￫ incuba-se com 
uma anti-imunoglobulina marcada com a 
peroxidase. 
 ↪ adiciona-se o substrato 
cromogênico, como a diaminobenzidina/H202 
que, sob a ação da enzima, forma um 
precipitado. 
● Pode-se usar o sistema de amplificação da 
avidina/estreptavidinabiotina em que a 
enzima é conjugada à avidina e o anticorpo, 
à biotina. 
Enzimaimunoensaio: 
● Método quantitativo 
● Reação antígeno-anticorpo é monitorada 
pela medida da atividade enzimática. 
● Vantagens → elevada sensibilidade, utiliza 
reagentes estáveis, livre das exigências de 
trabalhar com radioisótopos e poder ser 
adaptado tanto a testes simples quanto à 
automação. 
● não depende de um segundo fenômeno 
(ex: precipitação, aglutinação ou fixação de 
complemento). 
● Dois tipos: homogêneo e heterogêneo. 
↪ Homogêneo ￫ não é necessário 
separar os complexos antígeno-anticorpo e 
o antígeno e/ou o anticorpo livres, pois a 
interação antígeno-anticorpo modula a 
atividade da enzima. 
↪ Heterogêneo ￫ a separação é 
necessária, pois a atividade da enzima não é 
alterada pela reação antígeno-anticorpo. 
● Requisito necessário para as enzimas: 
↪ ter alta atividade específica 
(produto da reação enzimática estável, de 
fácil quantificação e com ↑ coeficiente de 
extinção molar) 
↪ Ser estável. 
↪ ser facilmente obtida em forma 
purificada 
↪ serfacilmente conjugada a vários 
antígenos, anticorpos e haptenos. 
 ↳ ELISA: