RELATÓRIO AULA PRATICA CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM SISTEMAS PROCARIÓTICOS

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CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
HETERÓLOGAS EM SISTEMAS PROCARIÓTICOS 
 
 
Junea Leandro do Nascimento 
Eng. Agronoma 
PhD. Produção Vegetal 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com especial foco no 
estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas, ou 
seja, investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre DNA, 
RNA e síntese proteica. A biologia molecular faz uso de várias técnicas em seus experimentos, 
sendo as mais conhecidas o Miniprep, o PCR, a digestão de DNA plasmidial com enzima de 
restrição e a eletroforese em gel de agarose. 
A clonagem biológica consiste na inserção de um gene em um vetor, ou seja, a inserção de 
um DNA capaz de se multiplicar dentro de um sistema vivo, como é o caso do plasmídeo 
bacteriano. A transformação genética pode ser definida como a incorporação estável e hereditária de 
DNA exógeno por células de um hospedeiro. A célula mais comumente utilizada é a célula 
bacteriana de Escherichia coli. Em certas bactérias, a transformação ocorre naturalmente o que 
contribui para o aumento da variabilidade genética das populações. Outras bactérias, tais como a E. 
coli, têm que tornar-se competentes para transformação, antes de serem transformadas. Certas 
estirpes de E. coli podem-se tornar competentes para transformação com DNA plasmídico através 
de tratamento com cátions, tais como Ca
2+
, Mn
2+
 ou Co
3+
, comumente chamado transformação por 
choque térmico, sendo um método fácil e relativamente barato de transformação, onde uma solução 
0,1M de CaCl2 é, frequentemente, utilizada para este fim. Os íons atuam neutralizando as cargas 
negativas da membrana e do DNA. Após o choque térmico a temperatura entre 37º a 42ºC, criam-se 
poros na membrana e o DNA pode alcançar o interior da célula (MARANHÃO, 2003b; 
NASCIMENTO et al., 1999). Plasmídeos pequenos incorporam-se mais facilmente à célula 
bacteriana competente. A transformação bacteriana é utilizada para a preparação de DNA 
plasmidial, em larga escala, e para a seleção de clones recombinantes (BROWN, 2003; 
MARANHÃO, 2003A). 
Plasmídeos ou vetores são moléculas de DNA fita duplas extracromossomal encontrados em 
todas as espécies de bactérias. Os plasmídeos variam em estrutura, tamanho, modo de replicação, 
número de cópias por célula e habilidade para propagarem-se em diferentes bactérias. Todos 
contêm três características comuns: marca seletiva, origem de replicação e sítio múltiplo de 
clonagem (NASCIMENTO, 1999). A marca seletiva refere-se a genes que conferem resistência a 
antibióticos e que proporcionam a seleção dos clones transformados daqueles não transformados. 
Para essa seleção, é adicionado ao meio de cultura o antibiótico adequado, em concentrações que 
permitam diferenciar a célula não transformada (sensível ao antibiótico) da célula transformada 
(resistente ao antibiótico). 
A origem de replicação autônoma ou ori é o sítio em que se inicia a replicação do DNA, 
podendo se replicar independentemente da replicação bacteriana e produzir milhares de cópias do 
plasmídeo dentro da célula hospedeira. A replicação dos plasmídeos pode ser sincronizada com o 
ciclo celular, resultando em baixo número de cópias, ou ser independente do ciclo da célula 
hospedeira, permitindo a proliferação de centenas de cópias por célula (BROWN, 2003; WEAVER, 
2001). 
Os plasmídeos usados como vetores precisam ser purificados e separados do resto do 
genoma. Existem vários métodos de isolar o DNA plasmidial da bactéria, sendo que as 
minipreparações (miniprep) podem ser utilizadas para um rastreamento rápido do plasmídeo que 
contém o inserto com o gene de interesse. Obtêm-se uma quantidade pequena e impura do DNA 
plasmidial, mas que é suficiente para análise do fragmento através de digestão enzimática. As 
maxipreparações são realizadas a partir de volumes grandes da suspensão bacteriana. 
Essencialmente, esta etapa é uma escala maior da minipreparação, seguida de purificação adicional 
do DNA. O resultado disto é uma quantidade grande do DNA plasmidial purificado (vários 
microgramas). Ao se fazer uma Miniprep de um plasmídeo obtém-se suficiente número de cópias 
desse gene para manipulação química. Após a purificação de um plasmídeo, é sempre 
recomendável analisar a identidade e características do plasmídeo através da digestão com enzimas 
de restrição, para confirmar o tamanho dos fragmentos esperados, ou em simples eletroforese de gel 
de Agarose. 
A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), introduzido inicialmente por Saiki et al. 
(1985) e Mullis & Faloona (1987), foi utilizado para tentar obter uma ampliação seletiva de genes 
de interesse. Este método utiliza uma enzima DNA polimerase termoestável para copiar in vitro 
uma determinada região da molécula de DNA, região esta que é condicionada pelo uso de pequenos 
“primers” que hibridam com locais individualizados das cadeias de DNA delimitando assim o 
fragmento a amplificar. Esta técnica permite amplificar uma molécula, bilhões de vezes em poucas 
horas (Eidne, 1991), sendo particularmente útil quando se analisa tipos de mRNA pouco abundantes 
ou quando a quantidade de tecido disponível é limitada (Dallman & Porter, 1993). O PCR consiste 
em um processo cíclico onde os seguintes passos, são repetidos durante um número determinado de 
vezes: 1) A cadeia dupla de DNA é desnaturada por aquecimento obtendo-se duas cadeias simples; 
2) Os primers introduzidos na reação ligam-se com zonas homologas em cada uma destas cadeias; 
3) A DNA polimerase catalisa a produção de novas cadeias complementares. Cada um destes ciclos, 
que demora apenas alguns minutos, duplica a quantidade da DNA pretendida, deixando-a com uma 
cadeia dupla. Preparações de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas à 
digestão com enzimas de restrição para identificação e caracterização do DNA objeto do estudo. 
O isolamento de DNA cromossomal ou plasmidial é um procedimento básico e fundamental 
para a clonagem molecular. A purificação consiste na separação do DNA a partir dos restos 
celulares e das proteínas, principalmente as DNases que degradam as moléculas de DNA, tanto em 
células bacterianas como em células eucarióticas. Diferentes reagentes e substâncias são utilizadas 
neste procedimento em função do tipo celular. No caso das bactérias gram negativas (E. coli), a 
combinação de detergentes e substâncias alcalinas removem as camadas lipídicas da membrana 
externa e da parede celular expondo o DNA para a purificação. As proteínas podem ser removidas 
eficientemente com a utilização de uma mistura dos solventes orgânicos, fenol e clorofórmio. Esses 
solventes rompem rapidamente a integridade celular desnaturando as proteínas, deixando os ácidos 
nucléicos em solução aquosa (BROWN, 2003; MARANHÃO; MORAES, 2003). O procedimento 
de preparação de DNA, a partir de uma cultura de células bacterianas, pode ser resumido da 
seguinte maneira: 1) As células são cultivadas em meio de cultura, depois recuperadas por 
centrifugação, a partir da cultura, e concentradas no menor volume possível; 2) As células são 
rompidas e seu conteúdo liberado, formando um extrato celular; 3) Esse extrato celular é tratado e 
todos os seus componentes são removidos, exceto o DNA; 4) O DNA resultante é concentrado por 
precipitação e mantido em solução aquosa. 
Já a eletroforese em gel de agarose é um método simples e eficiente que permite separação, 
identificação e purificação de moléculas de DNA. Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) possuem 
carga elétrica que pode ser utilizada para separar fragmentos de tamanhos diferentes quando 
colocados em um gel horizontal na presença de um campo elétrico. A agarose possui poros por 
onde as moléculas de DNA migram quando é adicionada uma corrente elétrica. A taxa de migração 
das moléculas é afetada pelo tamanhoe forma das moléculas, densidade do gel e força da corrente 
elétrica. As moléculas maiores de DNA migram mais vagarosamente do que as moléculas menores. 
Quando o DNA é clivado com enzimas de restrição, fragmentos de diferentes tamanhos migram em 
diferentes padrões. O protocolo padrão de gel de agarose permite separar fragmentos de DNA entre 
0,5 a 25 kb. A eletroforese também pode ser utilizada para separar proteínas e moléculas de RNA. 
A agarose utilizada no gel é um polissacarídeo que forma uma rede e permite regular a velocidade 
da migração das moléculas durante a separação. A adição de corante fluorescente (brometo de 
etídio ou sybr®), que se intercala entre as bases do DNA, e o uso de radiação ultravioleta permitem 
a visualização e a fotografia (NASCIMENTO et al., 1999; SOUZA, 2003). Em um dos poços do 
gel, onde as amostras a serem avaliadas por eletroforese são colocadas, é adicionado um marcador 
de peso molecular contendo fragmentos de DNA de tamanho conhecido. Este tem como objetivo 
estimar o tamanho dos fragmentos gerados após a corrida. O tamanho de cada fragmento é medido 
em pares de bases (pb). 
 
2. OBJETIVOS 
Propiciar o aprendizado prático de técnicas de clonagem, expressão e purificação de 
proteínas heterólogas em sistemas procarióticos. 
 
3. METODOLOGIA 
Utilizou-se Escherichia coli como a fonte de DNA para a realização das aulas práticas. 
 
3.1 A análise seqüencial e clonagem do gene de interesse 
Antes da clonagem do gene de interesse é preciso realizar um estudo do mapa de restrição do 
gene de interesse, para, em seguida, selecionar os sítios que flanquearão o mesmo. Foi realizada 
uma aula prática sobre esse assunto, onde pudemos observar os passos até a construção do mapa de 
restrição. 
Com um exemplo de sequência de mRNA, foi realizada a identificação da Open Reading Frame 
(ORF) (Figuras 1 e 2) utilizando o software ORF Finder do National Center for Biotechnology 
Information (NCBI). A pesquisa da seqüência homologa foi procedida com BLAST proteína 
(NCBI) (Figura 3). O mapa de restrição (Figura 4) foi construído utilizando o software NEBcutter 2 
(BioLabs Inc.). 
 
Figura 1. Identificação da ORF (NCBI). 
 
Figura 2. Sequência de nucleotídeos. Área marcada indica início e fim da ORF. 
 
Figura 3. BLAST proteína. 
 
 
Figura 4. Mapa de restrição de uma sequência nucleotídica. 
 
3.2 Expressão heteróloga da proteína TcPR-4 
3.2.1 Reação em cadeia de polimerase (PCR) 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um procedimento rápido que possibilita a 
amplificação in vitro de fragmentos de DNA específicos, partindo-se de uma quantidade mínima de 
DNA alvo ou de RNA previamente convertido em cDNA. 
Para a realização da reação de PCR foram utilizados: molde (DNA); tampão (10x concentrado); 
cofator (MgCl2 50 mM); primer (sintetizados a partir da sequência de nucleotídeos) e dNTPs 
(nucleotídeos do DNA formados por uma base nitrogenada (Adenina, Citosina, Guanina e, ou 
Timina), um açúcar (desoxirribose) e 3 grupos fosfato; fornece energia e nucleotídeos necessários 
para a síntese de DNA, a um par de iniciadores). 
 Estoque Trabalho 
 Molde DNA 30 ng 1,00 μM 
 Tampão 10x 2,50 μM 
 MgCl2 50 mM 0,75 μM 
 Primer 100 μM Forward 1,00 μM 
 Reverse 1,00 μM 
 dNTPs 10 μM 1,00 μM 
 Taq 0,20 μM 
 H2O 17,55 μM 
 Total 25,00 μM 
O protocolo seguiu-se da seguinte ordem: H2O; tampão; dNTPs; primer F; primer R; MgCl2; 
Taq DNA polimerase; molde. A enzima Taq DNA polimerase, que catalisa a reação, deve ser 
adicionada antes do molde, para que a mesma não seja contaminada. 
A técnica de reação de PCR consistiu em três passos: 
1° - Desnaturação do DNA: fase em que ocorre a abertura das fitas de DNA em temperaturas entre 
94-96° C. 
2° - Anelamento dos primers: onde os primers se hibridizam de forma precisa na sequência original 
do DNA a temperatura de 50º C. A temperatura varia de acordo com a composição dos primers. 
3° - Amplificação da sequência genicas de TcPR4: a DNA polimerase acrescenta os dNTPs à fita, 
de acordo com o pareamento de bases, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas 
(extensão) a temperatura de 72º C. 
 
3.2.2 Preparo de células competentes de Bactérias E. coli (BL21 pLysS) 
 
Colônias isoladas de BL21 pLysS foram inoculadas em 2 mL de meio LB seletivo líquido sem 
antibióticos, contendo 34 mg/mL de clorafenicol e, em seguida, incubadas overnight a 37° C por 
180 rpm. 
Após o crescimento bacteriano, foram adicionados 500 μL do pré-inóculo da referida bactéria em 
50 mL do meio LB líquido, nas mesmas condições. O material foi incubado a 37° C e 200 rpm, até 
alcançar uma OD600 0,5. Logo após, as culturas foram mantidas, por 20 min, no gelo e em seguida 
centrifugadas a 10000 rpm por 10 min. Após lavagem, as células foram ressuspensas em 5 mL de 
MgCl2 e 5mL de CaCl2 para neutralização das cargas da membrana. Houve incubação de 20 min 
para aderência das cargas à membrana das amostras, sendo que, em sequência, as células foram 
ressuspensas em 10 mL de Ca2+ e glicerol para conservar a membrana. Foram retiradas alíquotas 
de 200 μL da estirpe e mantidas a temperatura de -80° C. 
 
3.2.3 Extração do DNA plasmidial 
 
O Plasmídeo utilizado para expressão de proteínas foi o pET-28a (Figura 5) resistente a 
kanamicina. Na referida prática, fez-se a utilização do AccuPrep
®
 Plasmid Mini Extraction Kit 
(BIONEER Inc.). Os procedimentos, seguindo as normas do fabricante, foram os seguintes: 
- Pré-inóculo com o objetivo de crescimento da bactéria contendo o plasmídeo alvo em meio 
líquido, este crescimento ocorreu em 5,00mL de meio LB, contendo 50 μg.mL
-1
 de canamicina, 
incubado a 37º C, overnight a 180rpm. 
 - Retirou-se uma alíquota de 2 mL do meio de crescimento e colocou-o para centrifugar por 2 
minutos a 13000 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado, restando apenas o pellet 
no eppendorf. 
 - Adicionou, no recipiente (eppendorf) contendo o pellet, 250 μL do tampão 1 para ressuspensão do 
pellet. O recipiente foi colocado em um vórtex, facilitando a ressuspensão do pellet. 
 - Em seguida, foi adicionado 250 μL do tampão 2 (detergente) para que ocorresse a lise da bactéria, 
com agitação manual e suave por 4x. 
 - Logo após, adicionou-se 350 μL do tampão 3, com inversão suave do tubo por 4x. O material foi 
centrifugado por 10 min a 4° C e 13000 rpm. O material sobrenadante foi descartado. A adição do 
tampão 3 desse kit foi para a neutralização das enzimas da bactéria e também da ação do detergente. 
 - O lisado clareado foi transferido para o tubo de ligação da coluna de DNA e centrifugado a 13000 
rpm durante 1 min. 
 - Em seguida, foi adicionado 700 μL de tampão 4 para o tubo de ligação de coluna ao DNA e 
centrifugado a 13000 rpm durante 1 min. Isto remove os sais solúveis e detritos. O sobrenadante foi 
descartado. 
 - Foi adicionado 50 μL do tampão 5 (esse valor pode variar até 100 μL, dependendo da quantidade 
de material); esperou 1 min e em seguida foi levado à centrifuga por mais 1 min. O eppendorf foi 
retirado da centrifuga e imediatamente imerso em gelo. O tampão 5 pode ser substituído por água. 
 
Figura 3. Mapa do vetor de expressão pET-28a. 
3.2.4 Preparo do gel de Agarose e corrida do gel em eletroforese para visualização do DNA 
plasmidial. 
 
Os materiais utilizados para esta etapa foram: 
 - TAE: composto por TRIS, Ac. acético e EDTA; 
 - Agarose, na concentração de 1,5%; 
 - pET 28 – 5000 pares de base (5000 Daltons); 
 - Gene PR-4 – 500 pares de bases. 
 
Nessa etapa foi adicionado 0,75 g de agarose (volume final de TAE = 50 mL). Precisa-se de um 
gel que permita que a malha de DNA passe para o plasmídeo (concentração de 1,5%). Para diluir a 
agarose no TAE, leva ao microondas por 1 a 1,5 min, até diluir. Esfria um pouco a solução antes de 
correr o gel, de modo a nãotrincar o material utilizado. Para a corrida do gel em eletroforese, foram 
adicionados 1 μL do intercalante (gel Red) que vai se ligar ao DNA e emitir fluorescência ao ser 
excitado com luz UV; 2 μL de corante (cianol, bromofenol e glicerol). 
 
3.2.5 Digestão plasmídial e do produto de PCR 
 
O vetor pET-28a foi digerido por duas enzimas de restrição, a Nde1 e a BamH1 e, 
posteriormente, houve a ligação do inserto. A solução de digestão do vetor e do produto de PCR foi 
como se segue: 
Tampão: Tango 2x Volume final: 20 μL 
 MiniPrep PCR 
Tampão 10x (Tango) 4 μL 4 μL 
Enzima 1 (Nde 1) 1 μL 1 μL 
Enzima 2 (BamH 1) 1 μL 1 μL 
DNA plasmidial 5 μL DNA PCR 14 μL 
H2O 9 μL ------- 
Total 20 μL 20 μL 
A confirmação das digestões foi observada em gel de agarose 1%. 
 
3.2.6 Purificação do PCR e do DNA plasmidial digerido 
 
Foi utilizado o AccuPrep PCR Purification Kit (BIONEER, Inc.), de acordo com as 
recomendações do fabricante. Pegou-se o volume de digestão, completou com água até o volume de 
200 μL; em seguida adicionou 200 μL do tampão 1, misturou gentilmente, colocou o volume na 
coluna e centrifugou por 1 minuto a 13000rpm. O resíduo foi descartado e a coluna lavada com 
tampão 2 por duas vezes. O DNA plasmidial e o produto de PCR foram recuperados das colunas 
por eluição com água. 
 
3.2.7 Reação de ligação 
 
A ligação do vetor pET-28a com o inserto TcPR-4 foi realizada utilizando os seguintes 
materiais: 2 μL de tampão 5x; 1 μL do respectivo plasmídeo; 6,5 μL do inserto; 0,5 μL da T4 DNA 
ligase (5U/μL). Em seguida, as reações foram incubadas a 22° C por 2 h. 
 
3.2.8 Transformação da bactéria E. coli por choque térmico e confirmação das colônias 
transformadas por PCR 
 
Na transformação bacteriana, foram previamente preparados 10μL da amostra de DNA 
plasmidial e adicionado a 200μL da suspensão de células competentes (BL21) e deixadas no gelo 
por 30 minutos. Em seguida, procedeu-se o choque térmico (42° C por 1’30’’ min) e logo após 
transferiu-se as células para o gelo por 2 minutos. Foi adicionado às células 1 mL de meio LB e 
incubadas sob agitação a 37º C por 60 minutos. Após esse processo, foram plaqueadas em meio LB 
(meio de cultura Luria Bertani 20g/L) com ágar (15 g/L), contendo o antibiótico correspondente à 
resistência do plasmídeo de interesse (Cloranfenicol e Kanamicina) a fim de selecionar os 
transformantes, alíquotas de 100μL da suspensão. Para cada transformação foram selecionadas 4 
colônias isoladas. Uma PCR de colônia foi realizada para a confirmação dos clones positivos, os 
quais foram aplicados em gel de agarose 1% para a visualização da amplificação dos genes 
clonados. 
3.2.9 Indução de proteína (TcPR-10) 
 
A indução da proteína TcPR-10 foi feita através da inoculação de uma colônia isolada de células 
de E. coli da estirpe BL21 transformadas com o vetor de expressão pET-28a - TcPR-10, crescida 
em meio LB sólido contendo 34 mg/mL de Cloranfenicol e 50 mg/mL de Kanamicina, em 3 ml de 
meio LB líquido com os respectivos antibióticos por aproximadamente 16 horas a 37°C a 180 RPM. 
Após esse período centrifuga o inoculo e ressusendeu o pellet com 1 mL de meio LB. 
Na sequência, essa cultura foi rejuvenescida adicionando esse 1 mL em 50 ml de meio LB 
líquido contendo 34 mg/ml de Clorafenicol e 50 mg/ml de Kanamicina por 3 horas sobre agitação 
de 180 rpm a 37º C, e então, ressuspendeu em 1 mL de meio LB e trasferiu para 500 ml de meio LB 
líquido, com os respectivos antibióticos, crescida a 180 rpm, sob constante aeração a 37° C. A 
(densidade ótica) OD600nm alcançou 0,5-0,7, e logo após, adicionou-se à cultura 1 mM de IPTG 
(Isopropyl-ß-Ŋ-thio-galactoside). Também foi obtida para análise, a cultura controle, sem adição de 
IPTG. Após 4 horas de indução a 200 rpm e 37° C, as células foram centrifugadas a 12.000 rpm 
durante 15 minutos a 4 
o
C. Os pellets obtidos foram armazenados em ultra freezer a -80
o
 C. 
Na análise da indução da proteína, as amostras (controle e induzido) foram diluídas em tampão 
de amostra 1X (Tris-HCl 12 mmol/L pH 6,8, glicerol 5%, SDS 0,4%, 2-mercaptoetanol 2 mmol/L e 
azul de bromofenol 0,02%) e desnaturadas a 95ºC durante 5 minutos. Em seguida as amostras 
foram aplicadas em gel SDS-PAGE 15%. A voltagem aplicada para corrida foi de 100 volts por 2 
horas, e ao final, o gel foi corado com azul de comassie coloidal. 
 
3.9.10 Purificação de proteína (TcPR10) 
 
Após indução, as células de BL 21 (E. coli) com pET-28a – TcPR-10 foram coletadas por 
centrifugação (11000 xg, 20 min, 4° C) e os pellets ressuspensos em tampão de lise (50 mM de 
tampão fosfato, 300 mM de NaCl, 2% de Nonidet, 0,1 mg mL
-1
 de lisozima, pH 8,0). As células 
lisadas foram centrifugadas (10.000 rpm, 20 minutos, 4ºC) e a solução sobrenadante foi aplicada em 
uma coluna TALON
®
 em resina de afinidade com metal de acordo com as instruções do fabricante 
(Clontech). A coluna foi lavada com 20 volumes (20mL) de tampão A (Fosfato de sódio 50 mM, 
pH= 7.4, acrescido de 300 mM de NaCl, 10 mM de Imidazol), e a eluição da proteína com o tampão 
B (Fosfato de sódio 50 mM, pH= 7.4 acrescido de 300 mM de NaCl e 150mM de Imidazol). 
Alíquotas de 500 µL foram coletadas em tubos eppendorf e analisadas por eletroforese SDS-PAGE. 
As frações mais puras foram armazenadas a 4ºC. 
4. RESULTADOS 
 
Figura 1 - Eletroforese em gel de agarose 1,5% de reação de PCR. M: Marcador; 1e 2: 
Miniprep (plasmídeo 5000pb); 3: produto do PCR (gene 500pb). 
 
 
Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose 1,5% após digestão e purificação. M: Marcador; 1: 
Miniprep; 2: produto de PCR. 
 
 
 
 
 
 
 
M 
M 1 3 2 
500 pb 
1 2 
5000pb 
Figura 3 - Eletroforese em gel de agarose 1,5% de PCR de colônias de E.Coli transformadas 
com a construção pET28a/PrT4. M: Marcador; 1-3: PCR de colônias (comparado ao marcador, 
confirma a presença das colônias transformadas). C-: Controle negativo (branco). 
 
 
 
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
AUSUBEL, F.M.; BRENT, R.; KINGSTON, R.E.; MOORE, D.D.; SEIDMAN, J.G.; SMITH, J.A.; 
STRUHL, K. Current protocols in molecular biology, New York: John Wiley , 2003. 4755 p. 
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Técnicas em Biologia Molecular. IN:BROWN, T.A. Clonagem gênica e análise de DNA. Porto 
Alegre: Artmed, 2003. 376 p. 
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1999. 85 p. Apostila. 
MARANHÃO, A.Q. Transformação bacteriana. In: AZEVEDO, M.O.; FELIPE, M.S.S.; 
BRÍGIDO, M.M.; MARANHÃO, A.Q.; SOUZA, M.T. de. Técnicas básicas em biologia 
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Técnicas básicas em biologia molecular. Brasília, DF: Universidade de Brasília, 2003b. 211 p. 
SOUZA, M. T. de. Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose. In: AZEVEDO, M. O.; 
FELIPE, M. S. S.; BRÍGIDO, M. M.; MARANHÃO, A. Q.; SOUZA, M.T. de. Técnicas básicas 
em biologia molecular. Brasília, DF: Universidade de Brasília, 2003. 211 p. 
WEAVER, R. F. Molecular biology. Lawrence: University of Kansas, 2001. 880 p. 
M 1 2 3 C- 
500pb