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II - MORFOFISIOLOGIA DO APARELHO REPRODUTOR MASCULINO INTRODUÇÃO A função básica do aparelho reprodutor masculino é a produção de espermatozóides viáveis para preservação da espécie. Está constituído de testículos, vasos eferentes, epidídimos, vasos deferentes, glândulas acessórias (próstata, vesículas seminais, bulbouretrais e ampolas), pênis e prepúcio. Os espermatozóides produzidos nos túbulos seminíferos saem do testículo vão ao epidídimo, onde adquirem a capacidade de fecundar e, são estocados na cauda. Na ejaculação são transportados ao longo dos ductos deferentes para a uretra, onde se misturam às secreções das glândulas acessórias para constituir o sêmen do ejaculado. Figura 1. Trato reprodutivo bovino. a. ampola, bu. glândula bulbouretral, cap.e cabeça do epidídimo, caud. e cauda do epidídimo, cp pedúnculo esquerdo do pênis, dd ductos deferentes, fe pênis, pg próstata, r reto, rp músculo retrator do pênis, s escroto, sf flexura sigmóide, t testículo, vg vesícula seminal. Fonte: Hafez , 1995 TESTÍCULOS São as gônadas masculinas, cujas funções são a produção de espermatozóides e a produção de hormônios esteróides. Cada testículo é circundado por uma cápsula fibrosa chamada de túnica albugínea, sendo que, em algumas espécies essa cápsula contém fibras musculares. Nesses animais a cápsula é contrátil, sendo importante para manter a pressão adequada dentro do tecido e/ou para movimentar o fluido e os espermatozóides dentro do testículo. Se a cápsula dos testículos for removida pode-se verificar que o parênquima testicular é constituído, basicamente, de túbulos seminíferos separados pelo tecido intersticial. Os túbulos seminíferos são estruturas cilíndricas muito longas, compactamente dobradas, são organizados em lóbulos e separados por tecido fibroso. Os túbulos são distribuídos uns sobre os outros, e o espaço entre eles forma o tecido intersticial, que contém nervos, vasos sangüíneos e as células de Leydig, que são responsáveis pela síntese de esteróides no testículo. Cada túbulo tem a forma de um loop em que ambos os lados se abrem no rete testis, que é um sistema de intercomunicação situado centralmente no testículo. Devido à alta permeabilidade dessa estrutura, a composição do fluido que vem dos túbulos seminíferos é modificado quando passa no rete testis. A ligação entre o rete testis e o epidídimo é feita através dos ductos eferentes, que assim como os túbulus, também tem o seu número definido (4 a 14). Esses ductos se unem para formar o ducto epididimário, que consiste de um túbulo único muito enovelado e que posteriormente dará origem ao ducto deferente. O epidídimo é dividido anatomicamente em três partes: cabeça, corpo e cauda. Na cabeça ocorre o início da maturação espermática, no corpo a maturação se completa e na cauda os espermatozóides maturos são estocados. Cobrindo os testículos e epidídimos encontra-se a tunica vaginalis, que é uma extensão do peritônio e tem duas camadas, uma visceral, que cobre os testículos e epidídimos, e uma parietal que cobre a cavidade escrotal. Figura 2. Testículo e epidídimo. Fonte: Harper, 1982 BOLSA ESCROTAL: O escroto nos animais domésticos adultos varia de muito penduloso, como e o caso dos ovinos, a perianal como nos suínos, mas em todas as espécies serve para manter a temperatura testicular alguns graus abaixo da corporal. A bolsa escrotal, no qual os testículos estão localizados consiste de várias camadas, a tunica vaginalis que apesar de ser uma extensão do peritônio, é bem mais grossa, e envolve os testículos e epidídimos. A camada muscular, a túnica Dartos, que é responsável pala variação na posição dos testículos, bem como na alteração da espessura e área da superfície do escroto de acordo com a temperatura. A pele que cobre os testículos é mais fina do que no resto do corpo, tem menos gordura, os pelo são finos, e possuem muitas glândulas sebáceas e sudoríparas. Além disso, na pele encontram-se receptores para temperatura que levam a informação ao cérebro. A proximidade de contato com o corpo do animal, é auxiliado pelo músculo cremaster interno dentro do cordão espermático que tem a capacidade de abaixar e elevar os testículos. Todos os componentes da bolsa escrotal auxiliam na manutenção da temperatura do testículo abaixo da corporal, sendo que essa temperatura é mantida pelo mecanismo de contracorrente do cordão espermático. Se os testículos não descem da cavidade abdominal tem-se um problema chamado criptorquidismo, em que os testículos são incapazes de produzir espermatozóides devido a temperatura, que permanece similar a temperatura corporal. Da mesma forma, se a temperatura do testículo que está na bolsa escrotal for, por qualquer motivo, elevada o animal fica estéril temporária ou permanentemente, dependendo do tempo de exposição à altas temperaturas. DESCIDA DOS TESTÍCULOS: Os testículos nos animais domésticos se originam próximo aos rins mas, esses descem para o escroto durante a vida fetal ou logo após o nascimento. Seja qual for a explicação para a descida dos testículos, uma vez fora da cavidade abdominal eles fica mais frio (4 a 7ºC abaixo da corporal) e se tornam susceptíveis as alterações de temperatura À medida que os testículos descem para o escroto, carregam o sistema vascular, a artéria testicular se torna alongada, e nas espécies em que o escroto é pendular como no bovino, a artéria fora da cavidade abdominal se enrola formando um cone vascular, que faz parte do cordão espermático. A artéria enrolada é circundada por uma cadeia de múltiplas veias pequenas, chamada de plexo pampiniforme, formando o cordão espermático. Sendo que, as veias do plexo pampiniforme se reúnem para formar uma única veia próximo ao canal inguinal. Esse sistema vascular complexo constitui um sistema altamente eficiente de troca de calor contracorrente em que o sangue arterial é pré-resfriado antes de atingir o testículo, e o sangue venoso que sai do testículo é aquecido à temperatura corporal antes de retornar ao abdômen. O cordão espermático é recoberto pela túnica vaginalis, e está formado pelas artérias e veias espermáticas, nervos, vasos linfáticos e o músculo cremaster. E tem a função de assegurar que todo o testículo seja mantido a uma temperatura mais baixa do que a dos órgãos da cavidade abdominal TECIDO INTERSTICIAL: No parênquima testicular o tecido intersticial ocupa os espaços dentre os túbulos seminíferos e, está formado pelas células de Leydig, vasos sangüíneos, vasos linfáticos e nervos, apresentado também uma população variável de outras células. A concentração de túbulos seminíferos varia entre espécies, portanto também varia a quantidade de tecido intersticial. No bovino cerca de 15 % do parênquima do testículo é tecido intersticial e desse, 7,5 % são células de Leydig. As células de Leydig são relativamente grandes e estão localizadas, na maioria das vezes, próximo ao sistema vascular, e sua função principal é secretar hormônios esteróides. Essas células usam o colesterol como substrato para síntese de hormônios esteróides, sendo que esse pode ser sintetizado a partir do acetato ou ser obtido diretamente da corrente sangüínea. A testosterona sintetizada no tecido intersticial passa pela barreira sangüíneo testicular e vai para o lúmen dos túbulos seminíferos, onde se liga a uma proteína ligadora de andrógenos (ABP) para que possa ser mantida em altas concentrações dentro dos túbulos e, assim garantir uma espermatogênese normal. Além da testosterona, o testículo secreta vários outros esteróides, tais como a dehidroepiandrosterona e a andostenediona. A produção de testosterona, pelas células de Leydig, é regulada pelo LH da hipófise, e os níveis circulantes de testosterona, por sua vez, controlam a secreção de LH através de feedbacknegativo. Figura 4. Estrutura do tecido intersticial no carneiro e cachaço. Fonte: Setchell, B.P., 1982 TÚBULUS SEMINÍFEROS: Os túbulos seminíferos, constituem a maior parte do parênquima testicular (85% no touro) são compostos de dois tipos de células somáticas, as mióides e as de Sertoli, e de cinco tipos de células germinativas, espermatogônias, espermatócitos primários, secundários, espermátides e espermatozóides. Essas células germinativas encontram-se confinados entre a parede dos túbulos seminíferos e os pares de células de Sertoli que formam junções especializadas. As células mióides ou do tipo muscular, circundam os túbulos constituindo uma parte importante da parede dos túbulos seminíferos juntamente com material acelular. A maioria do material acelular fica entre as células mióides formando a membrana basal. As células mióides são, provavelmente, as responsáveis pelo movimento peristáltico dos túbulos que auxiliam o transporte de espermatozóides para fora do testículo. As células de Sertoli ocupam uma posição pivô no epitélio dos túbulos seminíferos, se estendem da parede externa do túbulo até o lúmen e estão em contato com todas os tipos celulares do epitélio seminífero. As espermatogônias estão entre as células de Sertoli e o tecido que limita a parede, e as demais células germinativas estão espremidas entre pares de células de Sertoli adjacentes ou embebidas nas criptas da superfície luminal do citoplasma das células de Sertoli , que possuem uma forma irregular e extensa. Figura 5. Esquema da disposição das células germinativas e células de Sertoli nos túbulos seminíferos. Sg espermatogônia, Sp espermatócito, rS espermátide arredondada, eS espermátide alongada, J junção entre as células de Sertoli, Bm membrana basal, MC células mióides, spm membrana espermática, Sm membrana da células de Sertoli, Sn núcleo da células de Sertoli. Fonte: Barth & Oko, 1989 As células de Sertoli são diplóides e o número dessas células é um fator limitante na produção espermática, pois elas só podem dar suporte a um número finito de células germinativas. Portanto, o número de células de Sertoli não só determina a produção de espermatozóides, mas também o tamanho do testículo. A inibição da replicação dessas células no período neonatal resulta em um menor número e conseqüentemente, menor produção espermática e menor tamanho do testículo. Por outro lado, o inverso ocorre se o período de replicação dessas células for prolongado como, por exemplo, no caso de hipotireoidismo induzido, resultando em um aumento do número de células, aumento da produção espermática e aumento do tamanho do testículo. As células de Sertoli formam uma série de junções especializadas entre elas, e entre elas e as células espermáticas. Essas junções são importantes na movimentação das células germinativas através do túbulo em direção ao lúmen. Inicialmente pensava-se que as células de Sertoli eram apenas células de suporte, mas hoje sabe-se que elas tem inúmeras funções essenciais para funcionamento do testículo: Suporte físico para as células germinativas. As junções entre as células de Sertoli são o maior componente da barreira sangüíneo testicular. São responsáveis pela nutrição das células germinativas. Proporcionam a liberação dos espermatozóides do epitélio germinativo, pois à medida que a cabeça é liberados no lúmen, as células de Sertoli retém a maioria do citoplasma das espermátides. Fagocitose dos resíduos de citoplasma, e outras substâncias que possam prejudicar as células germinativas. Secretam o fluido que preenche o lúmen dos túbulos, e várias das proteínas encontradas no fluido. Esse fluido carrega os espermatozóides dos túbulos para o rete testis e depois para o epidídimo. Secretam a proteína ligadora de andrógenos (ABP), que se liga a testosterona e a dehidrotestosterona e transporta esses andrógenos para o epidídimo A secreção de ABP pelas células de Sertoli ocorre em resposta ao FSH. Secretam proteínas ligadoras de metais tais como - transferrina (Fe), e ceruloplasmina (Cu), que transportam íons para o interior do túbulo que são necessários ao desenvolvimento de células germinativas. Não sintetizam hormônios esteróides, mas convertem a testosterona em estradiol e em dihidrotestosterona (DHT). Secretam inibina e ativina, que controlam a liberação de FSH pela hipófise e o ativador de plasminogênio que é importante para a remodelação durante a migração celular. Secretam o antígeno H-Y responsável pelo desenvolvimento do testículo durante a diferenciação sexual. Secretam fatores de crescimento que também afetam a espermatogênese. Figura 6. Células de Sertoli Fonte: Hafez, 1995 BARREIRA SANGÜÍNEO-TESTICULAR: Essa barreira é estabelecida pouco antes da puberdade e é resistente a vários tratamentos utilizados para quebrar barreiras em outras partes do corpo. É uma barreira seletiva, sendo importante porque previne que proteínas, inclusive hormônios e anticorpos, entrem em contato com as células germinativas. Portanto, a função primária dessa barreira é, provavelmente, a de criar nos túbulos um ambiente apropriado para a meiose, controlando as substâncias que entram no epitélio. Essa barreira pode ser morfologicamente localizada em dois locais da parede dos túbulos, nas junções da células miódes, e nas das células de Sertoli, sendo essa última a mais importante em bovinos. As junções especializadas entre células de Sertoli dividem os túbulos em 2 compartimentos: basal e adluminal. No compartimento basal encontram-se, principalmente, as espermatogônias e no adluminal os espermatócitos, que entraram em meiose, e as espermátides em transformação. O compartimento basal dá livre acesso aos componentes que penetram na camada mióide, enquanto na segunda barreira, composta das junções da células de Sertoli, a entrada de substâncias é restrita e seletiva. Portanto, as células germinativas que se encontram no compartimento adluminal estão isoladas e não tem acesso direto a nutrientes, hormônios e outras substâncias, dependendo unicamente das células de Sertoli. Outra função dessa barreira é o isolamento imunológico das células haplóides em desenvolvimento. Figura 7. Junções da células de Sertoli formando a barreira sangüíneo testicular, compartimento basal entre a parede do túbulo e a junção e adluminal acima da junções. Fonte: Setchell, B.P., 1982 CÉLULA ESPERMÁTICA Espermatozóides ou gametas masculinos são produzidos nos testículos através de um processo chamado de espermatogênese, sendo que os primeiros são liberados na puberdade, embora os eventos relacionados à espermatogênese comecem durante a vida fetal . Os espermatozóides dos mamíferos possuem dois componentes principais, a cabeça e a cauda. CABEÇA: O tamanho e o formato da cabeça varia com a espécie, mas a estrutura é semelhante para todos os mamíferos. Em todas as espécies consiste de uma massa de DNA altamente condensada chamada de cromatina, que esta combinada com pequenas proteínas ou peptídeos chamadas de protaminas. A cromatina é estabilizada pela formação de ligações dissulfidricas, que são rompidas após a fecundação no citoplasma do ovócito. A cabeça pode ser dividida em 2 regiões principais, a região acrossomal e a pós- acrossomal. A parte anterior da cabeça é coberta pelo acrossomo que cobre o DNA. O acrossomo consiste de membranas formando uma espécie de saco, que contém várias enzimas, tais como a hialuronidase e a acrosina, importantes para a penetração no ovócito. Assim como as demais células do organismo, o espermatozóide é coberto pela membrana plasmática. Portanto, nessa região do espermatozóide possuem 5 membranas: a plasmática, a acrossomal interna, a acrossomal externa, a nuclearinterna e a nuclear externa. Após a região acrossomal encontra-se a pós-acrossomal que está localizada posteriormente, entre o plasmalema e as membranas nucleares, essa região é importante, pois é através dela que o espermatozóide se liga e fusiona com óvulo. Na extremidade caudal dessa região, as membranas nucleares formam a fossa de implantação, que esta associada à inserção do flagelo, enquanto a membrana plasmática se estende cobrindo toda a cauda. CAUDA: Assim como a cabeça, a cauda varia em tamanho e formato entre espécies, mas a estrutura geral é semelhante. Pode ser dividida em quatro porções anatômicas distintas: pescoço (peça de conexão), peça intermediária, principal e final, sendo que todas são envoltas pela mesma membrana. A peça intermediária se estende da cabeça até o final da hélice mitocondrial, sendo que a porção próxima da cabeça é chamada peça de conexão e liga o aparelho móvel ao núcleo. Comum a todas as porções da cauda é o axonema central, constituído de 9 microtúbulos duplos com um par de microtúbulos únicos no centro. A peça intermediária difere das outras por ser circundado por uma camada de mitocôndrias, organizadas de forma helicoidal. Essas mitocôndrias suprem energia em forma de ATP para os microtúbulos, que quebram o ATP fornecendo energia para o movimento da cauda (motilidade altamente correlacionada com os níveis de AMPc). Entre o axonema e a hélice mitocondrial estão 9 fibras densas externas. Na peça principal, após a hélice mitocondrial, os filamentos do axonema e as fibras densas externas se estendem e são rodeados por uma capa fibrosa. Na região final a capa fibrosa desaparece e os microtúbulus (9+2) são cobertos apenas pela membrana plasmática. Em síntese, o espermatozóide é uma célula que tem estruturas especializadas que refletem a sua função. Ou seja, o acrossomo contém enzimas essenciais para a fecundação e a cauda contém a fonte de energia e o maquinário necessário para produzir a motilidade. Figura 9. Estrutura da cauda do espermatozóide mamífero em que foram feitos cortes em várias regiões. Fonte: Setchell, B. P., 1991 ESPERMATOGÊNESE É um longo processo, que envolve uma série de divisões mitóticas das espermatogônias, duas divisões meióticas dos espermatócitos, remodelação morfológica extensa das espermátides hapóides e a liberação de espermatozóides diferenciados na luz dos túbulos seminíferos Durante a formação do testículo as células germinativas primordiais migram para a crista genital, quando esta migração se completa essas células ocupam sua posição no centro dos cordões sexuais, que formarão os túbulos seminíferos. Nesse momento, passam a ser chamadas de gonócitos, e são circundados pelas células de sustentação e uma membrana basal proeminente. Os gonócitos não se dividem, como no caso das fêmeas, mas permanecem inativos até um pouco antes da puberdade. Nessa época, passam a se chamados espermatogônias A0 (que vão dar origem aos demais tipos celulares), migram entre as células de Sertoli até atingir o tecido limitante externo ou base do túbulo e entram em um período de multiplicação mitótica indefinida. As espermatogônias estão sempre localizadas na camada que compõem a base do túbulo, sofrem varias divisões mitóticas para formar espermatócitos, que estão localizadas em uma camada mais acima. Os espermatócitos sofrem um longo processo reducional ou divisões meióticas, para formar a próxima camada de células haplóides chamadas espermátides. As espermátides, que são originalmente células arredondadas, sofrem uma série de transformações para formar a camada final de espermátides alongadas com a cabeça e cauda e, então são liberadas no lúmen dos túbulos. Portanto, a diferenciação das células germinativas em sua forma final está sempre associada com sua mobilidade no epitélio do túbulo. O deslocamento das células germinativas em direção a luz do túbulo é auxiliado pelo citoplasma das células de Sertoli. Figura 10. Estágios da espermatogênese Fonte: Alberts et al., 1994 A espermatocitogênese se refere à primeira fase da espermatogênese e envolve as espermatogônias que são células germinativas diplóides, originárias dos gonócitos, que se dividem mitoticamente, e estão localizadas no compartimento basal dos túbulos, entre as células de Sertoli e o tecido limitante externo. As células germinativas primordiais sofrem várias divisões mitóticas para popular os cordões sexuais e, então passam a chamar-se gonócitos. Antes da puberdade, os gonócitos sofrem modificações para formar as espermatogônias A0 que darão origem as demais células germinativas. As espermatogônias são classificadas em 3 tipos: A, B e intermediária. No bovino existem quatro tipos distintos de espermatogônias A, que são A0, A1, A2, A3. As espermatogônias A0 se dividem mitoticamente dando origem a A1, que são células de renovação, ou à A0 que são as células tronco de reserva. Existem 3 divisões mitóticas da espermatogônia tipo A (A1, A2, A3), o que termina com a espermatogônia intermediária. Novas células tronco reservas são produzidas também pela divisão mitótica de A2, e eventualmente A3 se diferencia em A1 renovando a linhagem espermática. Espermatogônias intermediárias se originam da divisão mitótica de A3. As do tipo B1, são mitoticamente derivadas do tipo intermediária, e se dividem dando origem a B2. Todos esses tipos celulares estão na lâmina basal e quase que completamente circundados pelas células de Sertoli. Após a divisão mitótica das espermatogônias B2, resulta o espermatócito primário que, imediatamente, inicia meiose com síntese ativa de DNA. Os espermatócitos primários pré-leptoteno, portanto são derivados mitoticamente das espermatogônias B2 e são as últimas células produzidas por mitose. Durante essa fase, que representa uma interfase pré-meiótica que precede a prófase da primeira divisão meiótica, ocorre síntese de DNA duplicação dos cromossomos homólogos. O próximo estágio do espermatócito primário é leptóteno, que é o primeiro estágio da prófase meiótica, seguido pela fase de zigóteno, paquíteno e diplóteno. Essa primeira divisão meiótica dá origem a dois espermatócitos secundários diplóides (estes têm metade dos cromossomos embora esses cromossomos já tenham sido duplicados). Os espermatócitos secundários, que contém metade do número de cromossomos, entram na segunda divisão meiótica produzindo rapidamente quatro espermátides arredondadas haplóides. Nas divisões meióticas para formar uma células com número haplóide de cromossomos a partir de uma diplóide, ocorre uma duplicação de cromossomos seguido de duas divisões (uma para separar os cromossomos homólogos pareados e a segunda para separar as cromátides irmãs). Figura 11. Mudanças que ocorrem durante a divisão meiótica envolvendo espermatócitos primários e secundários. Fonte: Kretser & Kerr, 1994 RENOVAÇÃO DAS ESPERMATOGÔNIAS E DURAÇÃO DA ESPERMATOGÊNESE Para manter a continuidade do ciclo do epitélio uma renovação de espermatogônias deve ser assegurada em determinado ponto. Divisões mitóticas sucessivas do tipo A (A1, A2, A3) são seguidas por divisões mitóticas para formar In, B1, B2 espermatogônias. As células de renovação, se originam após a divisão mitótica de A2, que é uma mitose equivalente a que resulta em A1 e A3. Portanto, em qualquer estágio encontram-se 2 populações de A na camada basal dos túbulos seminíferos, sendo A3 que dará origem a espermátide e A3 que eventualmente se diferencia em A1 e renovando a linhagem de espermatogônias. Se a espermatogênese for considerada a partir de A3, a duração no bovino é de 48 dias. Mas, se for também levado em conta a renovação de A1 a duração é 62dias. Existe um pré-tipo A0 que não está envolvida na renovação, mas é considerada célula de reserva. ESPERMIOGÊNESE O processo em que as espermátides arredondadas são transformadas, por uma série de modificações morfológicas progressivas, em espermátides alongadas, com cabeça e cauda e que serão liberadas na luz dos túbulos seminíferos é chamado de espermiogênese. Esse processo pode ser divido em 4 fases denominadas de golgi, capuchão, acrossomo e maturação. A fase de golgi no touro se refere desde a formação da espermátide arredondada (passo 1, figura 8) até a formação do grânulo acrossômico esférico associado com a membrana nuclear (passo 3). A fase de capuchão se caracteriza pelo crescimento de um capuchão acrossômico na cabeça (fases de 4-7). O período em que ocorrem as modificações no núcleo e acrossoma é chamada de fase do acrossoma (fases 8-12). E, a fase de maturação se refere à fase em que a espermátide completa a sua diferenciação, incluindo a formação final do flagelo e porção do pescoço, e a condensação final do núcleo (fases 13-14). Espermiação é a liberação da espermátide em forma de espermatozóide na luz dos túbulos. Durante esse processo, a grande porção de citoplasma encontrado na espermátide é deixada para trás formando o corpo residual, que é fagocitado e digerido pelas células de Sertoli. A região do pescoço da espermátide é ligada a esse excesso de citoplasma, permanecendo como uma gota citoplasmática, localizada na região da peça intermediária, quando o espermatozóide é liberado. Figura 13. Liberação das espermátides na luz dos túbulos seminíferos Fonte: Hafez, 1995 ESPERMATOZÓIDES Espermátides maturas são liberadas no lúmen dos túbulos na forma de espermatozóides, pelo força de extrusão das células de Sertoli. Os espermatozóides, quando deixam o testículo são imóveis, incapazes de fecundar, possuem gota proximal e seu metabolismo é diferente do espermatozóide do ejaculado. Os espermatozóides são transportados por elementos contráteis e secreção dos fluidos do testículo e, pelos cílios da parede interna dos ductos deferentes. Vários processos estão envolvidos no transporte dos espermatozóides para fora do testículo: Secreção ativa de fluidos das células de Sertoli e rete testis. Contração de elementos da cápsula testicular. Contração da camada da cápsula testicular. O transporte dos espermatozóides nos ductos eferentes, é feito pelo movimento das células ciliadas, enquanto que a passagem pelo epidídimo ocorre devido as contrações da musculatura lisa da parede. Sendo que, o tempo de transporte do espermatozóide pelo epidídimo é de 8-11 dias nos bovinos. CICLO E ONDA DO EPITÉLIO SEMINÍFERO Como foi visto existem 13 tipos celulares distintos A0, A1, A2, A3, I, B, espermatócito primário pré-leptóteno, leptóteno, zigóteno, paquíteno, espermatócito secundário e espermátide, que se desenvolvem em ordem cronológica. As espermátides podem ser divididas em 14 fases distintas representadas pelos números arábicos de 1-14 (Fígura 14). Uma das coisas mais impressionantes do epitélio dos túbulos e que certas células são encontradas somente associadas com outros tipos de celulares. Portanto, as associações celulares são bem definidas e sofrem modificações cíclicas. No bovinos existem 12 associações celulares ou estágios que são representado pelos número romanos de I a XII (Figura 14). Cada uma das associações celulares, desenvolvem-se em sincronia com as outras, de forma que olhando uma seção da parede do túbulo uma série de associações celulares diferentes podem ser vistas até que o ciclo se complete e a associação original apareça novamente. O tempo que uma associação celular leva para passar pelos 12 estágios é chamado de ciclo celular. Portanto, o ciclo se refere a uma série de modificações em determinada área do epitélio seminífero que ocorre entre dois surgimentos do mesmo estágio de desenvolvimento (associação celular). Em bovino, o ciclo tem duração de 13,5 dias e esta relacionado com o tempo necessário para o desaparecimento de um estágio particular até o seu reaparecimento novamente num dado segmento do túbulo. Figura 14. Vários estágios do ciclo celular em bovinos. Fonte: Hafez, 1995 ONDA: Os estágios não se modificam apenas com o tempo, mas também ao longo da extensão do túbulo. Portanto, a onda se refere a modificações seqüenciais do estágio do ciclo ao longo da extensão do túbulo e está relacionada com espaço. O ciclo se refere a evolução sincrônica de um estágio ao próximo em um segmento qualquer do túbulo. A onda por outro lado, se refere a sucessivas estágios organizados em ordem decrescente ao longo do túbulo começando no rete-testis. Figura 15. Onda do epitélio seminífero Hafez, 1995. EPIDÍDIMO: Os espermatozóides, deixam o testículo e vão através dos ductos eferentes para o epidídimo, que é um órgão que consiste de um ducto único muito enovelado, que tem várias funções tais como: absorção, maturação e transporte. O tempo de passagem pelo epidídimo é em torno de 8-11 dias em bovinos, entretanto esse pode ser mais rápido dependendo se o animal está em regime de coleta, em que as reservas epididimárias são esgotadas por ejaculações freqüentes. Pode ser dividido em três porções, cabeça, corpo e cauda A cabeça ou segmento inicial tem um epitélio alto e um lúmen estreito contendo poucos espermatozóides e, está envolvido na reabsorção da maioria dos fluidos que saem dos testículos. O corpo ou segmento médio apresenta, um epitélio um pouco mais baixo e um lúmen maior contendo muitos espermatozóides, sendo que nessa região ocorre a maturação. A cauda ou segmento final: possui um epitélio baixo, lúmen muito grande e está repleto de espermatozóides, sendo responsável pelo armazenamento das células espermáticas. Figura 16. Epidídimo Fonte Hafez., 1995 O trânsito através de epidídimo e ductos eferentes está associado a várias mudanças maturacionais, que incluem: 1. Aquisição da motilidade progressiva 2. Condensação final do núcleo e modificações na forma do acrossoma 3. Estabilização das proteínas estruturais pela formação de ligações dissulfidricas 4. Alterações na natureza da superfície da membrana plasmática 5. Migração da gota proximal para a porção distal da peça intermediária 6. Inibição do metabolismo 7. Reabsorção, fagocitose e liquefação dos espermatozóides com defeito 8. Absorção do fluidos do túbulos e rete testis Os espermatozóides que não são ejaculados são gradualmente eliminados pela urina ou na masturbação. Os que não eliminados sofrem envelhecimento. Primeiro perdem a habilidade de fecundação, depois a motilidade e finalmente se desintegram e são reabsorvidos. Portanto, ejaculados obtidos após um período de descanso, normalmente, tem uma alta percentagem de espermatozóides em degeneração. GLÂNDULAS ACESSÓRIAS: Os fluidos seminais adicionados durante a ejaculação, para formar o sêmen, servem como veículo para o transporte e proteção, estimulam o metabolismo do espermatozóide e fornecem energia necessária para sua passagem através do útero. As glândulas que contribuem para o sêmen são os ductos deferentes, ampolas, vesículas seminais, próstata e bulbouretrais. As suas secreções, são reguladas por andrógenos e, são compostas de vários componentes incluindo acido cítrico, frutose, outros açúcares livre, glicoproteínas , proteínas, prostaglandinas, ergotinina, inositol. Figura17. Esquema de uma vista dorsal das glândulas acessórias no touro. SV vesículas seminais, P próstata, C glândulas de Cowper ou bulburetral, A ampola dos ductos deferentes (D), U uretra, B bexiga. Fonte: Stechell, 1991 CONTROLE ENDÓCRINO DA ESPERMATOGÊNESE Existem no testículo dois tipos de células secretórias, as célulasde Leydig que secretam hormônios esteróides e, células de Sertoli que secretam várias proteínas necessárias ao adequado balanço hormonal. Desde de muito tempo, sabe-se que a hipofisectomia causa atrofia dos testículos diminuindo a secreção de andrógenos e inibindo a espermatogênese. Entretanto, a administração de FSH e LH exógeno são capazes de restituir a função testicular. O hipotálamo desempenha um papel fundamental no controle da função testicular, pois secreta GnRH, que age na hipófise estimulando a síntese de gonadotrofinas, que agem no testículo. Portanto, todos os fatores externos e internos que atuam no hipotálamo, também controlam ou afetam a espermatogênese. O controle endócrino da espermatogênese depende de FSH, do LH e da testosterona. A ação do FSH é restrito as células de Sertoli, estimulando suas funções que dão suporte ao desenvolvimento das células germinativas. O LH estimula a liberação de testosterona pelas células de Leydig, que por sua vez é necessária para manutenção da espermatogênese, agindo também nas células de Sertoli. Todo o desenvolvimento testicular e, o estabelecimento da espermatogênese dependem desses hormônios. A importância primária do FSH parece ser no início do desenvolvimento testicular na puberdade. No adulto, o FSH não é tão importante, visto que a testosterona pode substituir a função do FSH em manter a síntese de ABP e, controlando a secreção de fluido testicular pelas células de Sertoli. Por outro lado, o LH, através dos andrógenos, é importante não só no início do desenvolvimento puberal, mas também para manter a espermatogênese no adulto. A secreção de FSH e LH pela pituitária está sob o controle positivo do GnRH liberado pelo hipotálamo e, sob o controle negativo da testosterona e estradiol secretados pelos testículos. A síntese de testosterona pelas células de Leydig também é reguladas pela prolactina, que age sinergisticamente com o LH e outras hormônios, incluindo substâncias parácrinas secretadas pelos túbulos, em estágios específicos da espermatogênese. A produção do FSH e LH são diferencialmente controladas pelo feedback das células de Sertoli, através da inibina e ativina, e pela influência da taxa estradiol:testosterona na secreção de gonadotrofinas pela hipófise. Ativina é um potente liberador de FSH, enquanto a inibina tem efeito inibitório na secreção de FSH . A justaposição das células de Leydig com os túbulos seminíferos, assegura que altas concentrações de testosterona sejam mantidas nos túbulos. Os altos níveis de testosterona são essenciais para espermatogênese, pois estimulam as funções das células de Sertoli e garantem o transporte desse hormônio para o lúmen dos túbulos seminíferos. As altas concentrações de testosterona nos túbulos seminíferos e no fluido do rete testis, são importantes também para manter a função do epidídimo. Figura 18. Esquema mostrando a relação entre os túbulos seminíferos e as células intersticiais. Fonte: Kretser, 1982. ESTEROIDOGÊNESE: Os testículos secretam vários esteróides que são sintetizados a partir do colesterol, tais como a androstenediona e dihidroepiandrosterona, sendo a testosterona o principal deles. A secreção de testosterona pelas células de Leydig é estimulada pelo LH, visto que essas células tem receptores para LH. A resposta das células de Leydig ao LH é rápida, um pique de testosterona ocorre 1-2 horas após o pique de LH. A testosterona pode ser convertida nas diferentes tecidos em vários andrógenos, como ocorre no cérebro em que tem de ser convertida em estrogênio para poder agir. Da mesma forma, a genitália externa e a próstata dependem da dihidrotestosterona, portanto a testoterona através da enzima 5-á redutase precisa ser convertida em dihidrotestosterona. Se essa não estiver presente não vai ocorrer desenvolvimento de pênis, os testículos não vão descer da cavidade abdominal e ocorrerá uma feminização testicular. Os testículos também secretam estrógenos e, em algumas espécies, em grandes quantidades. Parte do estrógeno circulante é devido à conversão periférica da testosterona, mas a que está presente na veia espermática, 40-50% é secretado pelo testículo, através da conversão de andrógenos em estrógenos , pelas células de Sertoli. ESPERMATOZÓIDE NO TRATO GENITAL FEMINO - TRANSPORTE, CAPACITAÇÃO, REAÇÃO DO ACROSSOMO E FECUNDAÇÃO Os espermatozóides presentes no ejaculado, apesar de terem sofrido a maturação durante a passagem pelo epidídimo ainda não possuem a capacidade para fecundar um óvulo. Essa capacidade é adquirida após permanecer no trato genital feminino por algum tempo. As mudanças fisiológicas que conferem ao espermatozóide a capacidade de fecundar são chamadas de capacitação. Essa mudanças, se referem a remoção ou alteração de substâncias que estabilizam a membrana plasmática do espermatozóide, e que foram incorporadas a ela durante a passagem pelo epidídimo e, quando da exposição ao plasma seminal. A remoção desses fatores tornam o espermatozóide capaz de se ligar à zona pelúcida do ovócito e, sofrer a reação do acrossomo. Em bovinos o sêmen é depositado na vagina, e os espermatozóides devem passar através da mucosa da cervix, que contém várias dobras e grande quantidade de muco, antes de entrar no útero. Durante o período periovulatório o muco serve para proteger os espermatozóides do ambiente hostil da vagina, prevenir a entrada de plasma seminal no útero, excluir espermatozóides morfologicamente anormais, reter e conservar os espermatozóides para posterior migração no trato superior. Os espermatozóides, entram no muco e tendem a nadar entre as estruturas longitudinais das glicoproteínas, para atingir a superfície do epitélio secretor. Muitos ficam nesse local, mas outros conseguem se liberar e continuam o trajeto até atingir o útero. O transporte dos espermatozóides no útero ocorre, principalmente, devido à atividade contrátil das paredes uterinas, nesse caso a motilidade do espermatozóide serve apenas para mantê-lo em suspensão no fluido uterino. Os espermatozóides que passam a junção útero-tubárica, sãs retidos no istmo até a ovulação. No istmo, os espermatozóides se ligam as células do epitélio formando um reservatório. A liberação dos espermatozóides do reservatório do istmo é gradativa, e parece estar relacionada com as mudanças na membrana plasmática, associadas com a capacitação. A motilidade hiperativa do espermatozóide, que ocorre devido ao processo de capacitação, também facilita a sua liberação do istmo. No reservatório, a maioria das células espermáticas mantém a sua ultraestrutura e viabilidade normais, indicando que a sua principal função é manter a capacidade de fecundar e, assegurar a disponibilidade de espermatozóides férteis no momento da ovulação. A migração do espermatozóide do istmo até a ampola, local da fecundação, se dá pela motilidade espermática e pela contratibilidade do oviduto. Em bovinos a capacitação tem início durante a passagem do espermatozóide pelo muco da cervix, sendo que aqueles que se encontram em avançado estado de capacitação, provavelmente não chegam ao oviduto. Os espermatozóides que conseguem chegar ao istmo e se aderem as células do epitélio, sobrevivem e sofrem a capacitação lentamente. Alguns completam a capacitação no momento da ovulação, se liberam do reservatório e fecundam um óvulo recém ovulado. Portanto, o trato feminino também controla a velocidade da capacitação e garante que um número mínimo de espermatozóides capacitados estejam presentes no local da fecundação. REAÇÃO DO ACROSSOMO Em todos os mamífero os ovócitos são rodeados por uma capa de glicoproteínas (ZP1, ZP2 e ZP3) chamada de zona pelúcida. (ZP), que deve ser ultrapassada durante a fecundação. Portanto a reação do acrossomotem duas funções, tornar o espermatozóide capaz de penetrara a zona e fusionar com a membrana plasmática do ovócito. A reação do acrossomo envolve a formação de múltiplos pontos de fusão, entre a membrana acrossomol externa e a membrana plasmática, permitindo a liberação do conteúdo do acrossomo e a exposição de receptores necessários para ligação à ZP. Figura 20. Esquema da reação do acrossomo. AC acrossomo, AO membrana acrossomal externa, PM membrana plasmática, ES segmento equatorial, IA membrana acrossomal interna. Fonte: Bedford 1982 Os espematozóides capacitados se ligam a uma glicoproteína da ZP (ZP3), e essa ligação induz a reação do acrossomo. A ligação com a ZP3 provoca uma cascata de eventos, culminando com um aumento intracelular de Ca++, pela liberação das reservas intracelulares, e a entrada de Ca++ extracelular. O Ca++ age em fosfolipídeos da membrana facilitando a fusão, além de ativar várias substâncias fusogênicas. Outro evento causado pelo aumento de Ca++ é a abertura do canal de Na permitindo a entrada de Na e H, levando a um aumenta do pH intracelular. A entrada de Ca++, o aumento no pH e a produção de substâncias fusogênicas são essenciais para que ocorra a reação do acrossomo. Com a reação do acrossomo, outro receptor no espermatozóide é exposto, e esse se ligará a outra glicoproteína da membrana (ZP2), e com o auxílio das enzimas que foram liberados e da hipermotilidade, o espermatozóide ultrapassa a zona pelúcida. Figura 21. Representação gráfica da seqüência de eventos que ocorrem na interação da cabeça do espermatozóide com a zona pelúcida do ovócito durante a fecundação. Fonte: Bleil, 1991 Tendo passado a zona, o espermatozóide atravessa o espaço perivitelínico, e a cabeça então, se liga a membrana plasmática do ovócito e é incorporado ao citoplasma. A membrana plasmática da região equatorial, é a que inicialmente fusiona com o plasmalema. A região posterior e a cauda vão ser incorporadas posteriormente, através da fusão de membranas. A reação do acrossomo é absolutamente essencial para que ocorra a fusão, visto que, concomitante com a reação do acrossomo a membrana plasmática do segmento equatorial sofre mudanças para tornar o espermatozóide capaz de fusionar com o óvulo. Figura 22. Fusão do espermatozóide com o citoplasma do ovócito Fonte: Bedford, 1982 Ao ser incorporado no citoplasma, o espermatozóide ativa o ovócito, que completa a meiose e libera substâncias que vão modificar a ZP impedindo a entrada de outros espermatozóides, evitando a polispermia. Logo após, ocorre a transformação do núcleo do espermatozóide e dos cromossomas do ovócito, em pró-núcleos masculino e feminino. Os pró-núcleos se aproximam do centro do ovócito ocorrendo a fusão, para formação de um único núcleo diplóide que dará origem a um novo indivíduo. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ALBERTS B., BRAY, D., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WATSON, J.D. Biologia Molecular da Células. Terceira edição, Editora Artes Médias, Porto Alegre, 1997, 1294p. 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V - EXAME ANDROLÓGICO: MATERIAL UTILIZADO, REAGENTES E EQUIPAMENTOS INTRODUÇÃO A realização de uma coleta e avaliação de sêmen, seguros e confiáveis exigem a utilização de material de campo e de laboratório adequados, evitando resultados e interpretações errôneas da qualidade do ejaculado. Portanto, o andrologista deve trabalhar munido de todo instrumental necessário e indispensável para este fim, o que irá assegurar um trabalho de qualidade. O material que o Médico Veterinário irá utilizar em um exame andrológico que envolve, exame clínico geral, exame do sistema genital (interno e externo), e avaliação física e morfológica do sêmen, compreende desde ficha de identificação até material de laboratório. É conveniente ter uma caixa de transporte para carregar todo esse material, com uma lista de materiais, colada na mesma, evitando assim problemas de esquecimento de algum dos itens (Anexo 1). No presente trabalho, que visa atingir, principalmente o técnico de campo, serão discutidos os materiais de acordo com a sua necessidade na seqüência ordenada do exame andrológico. Desta forma, serão abordados os seguintes itens: 1 Ficha de identificação 2 Material utilizado para os exames: da saúde geral, da genitália externa e da genitália interna 3 Material utilizado para coleta de sêmen 4 Material utilizado no laboratório 5 Lavagem e esterilização do material utilizado. IDENTIFICAÇÃO Deve ser preenchida uma ficha de acordo com o registro do animal. Deve conter além da raça e idade, o nome, número de registro, procedência do touro e proprietário. Em se tratando de sêmen congelado, nome do laboratório responsável pela congelação, número da partida, volume da palheta, nome e registro do touro. (Anexo 5). A ficha de exame andrológico tem uma elevada importância, pois lá estarão registrados todos os dados do (s) touro (s) em questão, e a partir destes dados, referentes ao: exame clínico, examedos órgãos reprodutivos e avaliação seminal, o Médico Veterinário irá emitir seu certificado, dando um parecer favorável ou não. No caso da perda de uma ficha, há perda de todo um trabalho, pois naquela (s) ficha (s) constavam todas as informações necessárias para se avaliar o (s) animal (is). EXAME DO REPRODUTOR: CLÍNICO GERAL, DA GENITÁLIA INTERNA E EXTERNA. EXAME CLÍNICO GERAL O exame clínico andrológico tem como objetivo estabelecer se o animal é normal ou não em termos da sua sanidade e condição geral, se apresenta órgãos reprodutores normais (anatômica e funcionalmente) e por último verifica-se alguma anormalidade comportamental. Atualmente é possível determinar se o touro é normal e ainda estimar seu grau de fertilidade potencial com certa exatidão. A avaliação clínica geral no exame andrológico é realizada basicamente por inspeção do animal em movimento e em estação. Caso seja diagnosticada alguma anormalidade, o veterinário deve proceder a um exame mais detalhado, e neste caso ele deve ter em mãos os seguintes elementos básicos: 1 Termômetro – para aferição da temperatura; 2 Estetoscópio – para proceder a um exame dos aparelhos circulatório, respiratório e digestivo (rúmen); 3 Recipientes estéreis para coleta de fezes e urina EXAME DO SISTEMA GENITAL EXTERNO Ao exame externo dos órgãos do sistema reprodutivo masculino, deve-se observar: 1 Pênis 2 Prepúcio 3 Escroto 4 Cordão espermático 5 Testículos 6 Epidídimo O exame externo do sistema reprodutor deve ser realizado por inspeção, palpação, aferição da circunferência escrotal e das dimensões testiculares (em caso de acompanhamento da evolução da puberdade ou na constatação de assimetria de órgãos, para determinar o grau de assimetria). Então, nesta etapa do exame andrológico, o veterinário deve ter consigo as seguintes ferramentas: 1 Fita métrica para aferição da circunferência escrotal 2 Paquímetro para determinar as dimensões testiculares EXAME DO SISTEMA GENITAL INTERNO No exame genital interno, as seguintes estruturas devem ser avaliadas por palpação: 1 Glândulas vesiculares 2 Ampolas do ducto 3 Próstata 4 Glândulas bulbo-uretrais: observar apenas alterações. Estas estruturas estão localizadas na pélvis, onde é produzido o plasma seminal, que serve de veículo para conduzir os espermatozóides do trato reprodutivo masculino para o feminino. O material necessário para realização deste exame é: 1 luvas para toque retal 2 mucilagem Somente depois deste procedimento é aconselhável se proceder a coleta de sêmen. PREPARO DO TOURO PARA COLETA DE SÊMEN Antes da coleta de sêmen é necessário realizar uma toalete geral da região prepucial, para isto, o veterinário deve estar munido de: 1 Tesoura para cortar o excesso de pelos ao redor do orifício prepucial 2 Sabão neutro para lavagem do prepúcio 3 Papel toalha para enxugar bem a região lavada 4 Kilol (antisséptico a base de extrato de sementes de grapetfruit) para desinfecção da mucosa prepucial para coleta de sêmen para cultura ou para sêmen destinado a criopreservação) COLETA DE SÊMEN Uma amostra de sêmen do touro pode ser coletada por meio da vagina artificial, por eletroejaculação, ou por massagem dos órgãos reprodutivos internos. Vagina artificial Material necessário: 1 Tubo rígido de borracha com válvula para a entrada e saída de água e ar (é a base da vagina artificial) 2 Mucosa de látex que irá revestir o interior do tubo rígido 3 Cone de látex para direcionar o sêmen para o interior do recipiente de coleta. Este cone será colocado na extremidade contrária a entrada do pênis 4 Ligas (tripa de mico) para amarrar a mucosa e o cone látex junto ao tubo rígido 5 Tubo cônico de 15 ml (recipiente de depósito do sêmen) para ser conectado ao cone de látex 6 Protetor térmico para o tubo de 15 ml 7 Termômetro para adequar a temperatura na média de 43 ºC 8 Recipiente para aquecer água 9 Aquecedor de água (ebulidor/ rabo quente) 10 Becker (250ml) para fazer a volumetria do sêmen 11 Manequim (vaca em cio) ou vaca mansa fora do cio, a qual receberá aspersão de urina de vaca em cio. Portanto deve-se ter um estoque de urina congelada. 12 Álcool a 70 % 13 Benjamin (tê) 14 Transformador 15 Isqueiro ou placa aquecedora 16 Caixas transportadoras de lâminas 17 Pipeta de Pasteur 18 Solução salina a 0,9 % (para diluição seminal, quando este estiver muito concentrado) Eletroejaculação Material necessário: 1 Eletroejaculador 2 Cone de látex para captura do ejaculado 3 Suporte para o cone de látex 4 Tubo de 15 ml para o depósito de sêmen 5 Protetor térmico para o tubo de 15 ml 6 Álcool a 70 % 7 Benjamin (tê) 8 Transformador 9 Isqueiro ou placa aquecedora 10 Caixas transportadoras de lâminas 11 Pipeta de Pasteur MASSAGEM DAS VESÍCULAS SEMINAIS E AMPOLAS DOS DUCTOS DEFERENTES Material necessário: 1 Luvas para toque retal 2 Mucilagem para lubrificar o reto 3 Cone de latex 4 Suporte para cone 5 Tubo de 15 ml 6 Protetor térmico para o tubo de 15 ml 7 Papel alumínio 8 Isqueiro ou placa aquecedora 9 Caixas transportadoras de lâminas 10 Pipeta de Pasteur MATERIAL UTILIZADO NO LABORATÓRIO Após a coleta o sêmen é levado ao laboratório, para avaliar: turbilhionamento, motilidade, vigor, concentração e morfologia. O "laboratório" pode ser improvisado no local da coleta, desde que o veterinário disponha de todo o aparato necessário para a realização dos exames. Material necessário: 1 Microscópio de luz clara ou de contraste de fase 2 Banho Maria (graduável a 35-37 ºC) 3 Lâmina e lamínula de microscopia 4 Micropipeta de 20µl 5 Ponteiras para a micropipeta de 20 µl 6 Câmara de Neubeuer para concentração 7 Lamínula para câmara de Neubeuer 8 Placa aquecedora (graduável a 35-37 ºC) 9 Tubos tipo eppendorf 10 Frascos de penicilina para concentração 11 Caneta para escrita em vidro 12 Formol-salina para manter os espermatozóides para avaliar concentração e morfologias 13 Corantes (rosa bengala ou giemsa) para avaliar morfologia espermática em microscópio de luz clara 14 Pipeta de Pasteur 15 zapping ou parafilme 16 Suporte para tubo de 15 ml 17 Suporte para eppendorf 18 Contador de célula manual 19 Porta lâmina suja 20 Luva cirúrgica para coloração MATERIAL PARA CONGELAMENTO Para o sêmen destinado ao congelamento, além do material descrito para coleta e avaliação, há a necessidade dos seguintes materiais. 1 Meio de congelamento (ex: tris-gema, Nagase, citrato-gema) 2 Palhetas de 0,5 e 0,25 ml para envase do material 3 Pente para envase das palhetas 4 Pente para retirar o excesso de sêmen 5 Papel toalha para enxugar excesso de sêmen na ponta da palheta 6 Material para lacrar as palhetas (Ex. lacrador a calor, álcool polivinílico) 7 Plataforma de isopor a 3-4 cm para estabilização do sêmen 8 Geladeira regulada a 5 ºC para estabilização do sêmen 9 Nitrogênio líquido 10 racks 11 Pinças para raquear palhetas 12 Botijão de Nitrogênio líquido 13 Esparadrapo para identificar a rack e a caneca 14 Pano de campo TÉCNICAS DE ANÁLISE LABORATORIAL DO SÊMEN EXAMES IMEDIATOS: devem ser realizados logo após a coleta do sêmen Volume: pode variar conforme o método de coleta, de 2 a 6 ml na vagina artificial, e até 25 ml na eletroejaculação, é medido no tubo coletor; Aspecto: Pode variar de cremoso ou marmóreo, leitoso, opaco até aquoso. É indicativo da quantidade de espermatozóides no ejaculado. Cor: normalmente é brancacenta ou marmórea. Odor: o normal é suigeneris. No entanto, pode apresentar cheiro de putrefação, que é indicativo de infecção; cheiro de urina, que é indicativo de contaminação durante a coleta. Motilidade: percentagem de espermatozóides móveis em vários campos na lâmina. Apresenta correlaçãocom a fertilidade e deve ser avaliada imediatamente após a coleta do sêmen. Para isso, coloca-se uma gota do sêmen de 10 l entre lâmina e lamínula e avalia-se ao microscópio. É importante que o conjunto lâmina-lamínula estejam previamente aquecidos em placa aquecedora a 37ºC, para se evitar choque térmico. Quando necessário, diluir a gota de sêmen com uma gota de citrato de sódio a 2,9% ou com solução salina 0,9 %. Vigor: é a intensidade do movimento de cauda dos espermatozóides com motilidade progressiva. É mais bem apreciada em sêmen diluído. Turbilhonamento: representa o produto entre a concentração e a motilidade do ejaculado, coloca-se uma gota do sêmen de 10 l sobre lâmina pré-aquecida a temperatura de 37ºC e leva-se ao microscópio na objetiva de 10x, observando-se as bordas da gota. EXAMES MEDIATOS: realizado após os exames imediatos Concentração: representa o número de espermatozóides por milímetro cúbico (mm3) ou centímetro cúbico (cm3). Um dos métodos mais utilizados é o da câmara de Neubeuer. Para avaliar a concentração do sêmen fresco bovino, inicialmente deve-se fazer uma diluição de 1:200 (sêmen: formol-salino ou citrato). Para isto, coloca-se em um vidro de penicilina 0,02 ml sêmen, com o uso de uma micropipeta, e em seguida adiciona-se 4 ml de solução formol-salina (1%). Esta amostra pode ser armazenada em geladeira até o momento da realização do exame; Para contagem é indicado seguir o seguinte procedimento: 1 Colocar a lamínula sobre a câmara; 2 Com a pipeta de Pasteur, inclinada a 45º deixar o sêmen diluído (1:200) fluir sob a lamínula até completar a cavidade. È importante evitar: a formação de bolhas e acúmulo de sêmen nas bordas da lâmina, assim como evitar que o líquido da parte superior passe para a inferior, pois pode ocorrer um erro na contagem; 3 Aguardar aproximadamente um minuto para iniciar a contagem, afim de que os espermatozóides se estabilizem na câmara; 4 Realizar a contagem em objetiva de 10x. Contar os espermatozóides localizados em cinco quadrados dentre um total de 25 quadrados (contar os quatro cantos e o quadrado central ou cinco quadrados corridos em diagonal), escolher um ângulo de cada quadrado, considerando apenas as cabeças dos espermatozóides que tocam nas linhas que formam o respectivo ângulo. Fazer a contagem do outro lado da câmara, caso ocorra uma diferença de 10% pode ser indicativo de preenchimento ou homogeneização inadequada, devendo, portanto, repetir a contagem. Neste caso o sistema deverá ser montado novamente, depois dos dois lados contados obtém-se a média entre os dois lados; (Figura 1). 5 após a contagem, faz-se o cálculo da concentração espermática, referente a equação abaixo: A________= nº de espermatozóides/mm3 1_ x _N_ x _1_ B 25 10 Onde: A= número de espermatozóides contados B= fator de diluição (1:200 = 200, 1:100 = 100) N = número de quadrados contados 1/10 = altura da câmara Portanto, se a diluição for 1:200 multiplica-se o número contado por 10.000 que corresponderá ao número de espermatozóides/mm3. Conversão para ml: 1 mm3 = 1 µl 1 ml = 1000 µl conc./ml = número de espermatozóides x 107 Porcentagem de espermatozóides vivos e mortos: serve para assegurar a avaliação da motilidade e para se estimar a taxa de diluição no caso da conservação de sêmen. É feito esfregaço em lâmina, com o corante eosina-nigrosina. (Anexo 3). pH: pode variar de 6,4 a 7,8 e pode ser aferido utilizando fita apropriada ou phmetro; Figura 1: Contagem diagonal na câmara de Neubeur Morfologia espermática: a morfologia espermática é outra variável avaliada no laboratório e representa a porcentagem de células normais ou íntegras estruturalmente, assim como a distribuição das diferentes anormalidades morfológicas.(Anexo 4). 1 Preparo de amostras para avaliação da morfologia: Adicionar gotas de sêmen em frasco identificado, contendo 2 ml de solução formol- salina, previamente aquecida a 37ºC, até ocorrer turvação do meio. Se estiver examinando sêmen descongelado, a diluição em solução formol-salina deve ser a mínima possível, somente o suficiente para matar os espermatozóides, pois se assim não for, obter-se-á uma alta taxa de diluição e conseqüente, dificuldade para encontrar espermatozóides ao exame microscópico. Pode ser conservada em geladeira até a realização do exame. 2 Preparação de lâminas úmidas para avaliação da morfologia em contraste de fase Após a homogeneização do sêmen ao formol salina, toma-se uma gota da mistura (10 l) e coloque-a entre lâmina e lamínula. Aplica-se sobre este conjunto um papel filtro e, suavemente, pressiona-se a lamínula até que o excesso do líquido seja absorvido. Depois disto, fixa-se a lamínula sobre a lâmina por meio de esmalte, que é aplicado sobre suas bordas e tem-se pronta a preparação úmida para exame de contraste de fase, ou interferência. 3 Coloração rosa-bengala para avaliação da morfologia em microscopia de luz clara Com uma micropipeta de 20µl deve-se misturar uma gota da solução formol- salina/sêmen com uma gota de corante rosa bengala sobre a lâmina. Após homogeneizar bem, coloca-se uma lamínula sobre esta solução. Com um papel filtro retira-se o excesso de líquido. Em seguida deve-se contar 200 espermatozóides no mínimo. 4 Lâminas coradas por outros corantes Esta técnica é muito utilizada para o exame da morfologia espermática. O exame é realizado em esfregaço de sêmen corado por diferentes técnicas de coloração, conforme a disponibilidade do corante. Nesta apostila será citado os meio de coloração: giemsa e rosa-bengala.(Anexo 3). 5 Confecção correta de esfregaços de sêmen Para a preservação da integridade do espermatozóide, a gota de sêmen deve correr, no momento de seu estiramento, por trás da lâmina elevada obliquamente a um ângulo de 45º em relação a que vai receber o esfregaço. Assim, a gota é "puxada" e não "empurrada" sobre a lâmina base. Este procedimento impede lesões grosseiras sobre os espermatozóides como "desprendimento de cabeça" e fraturas diversas da peça intermediária e da peça principal da cauda. Outro cuidado indispensável é o de submeter o esfregaço imediatamente após ter sido feito, ao microscópio convencional, aumento de 400x, para se ter certeza de um bom trabalho, ou seja, presença de células com boa disposição por toda lâmina e bem separadas entre si. O que não se aceita é o "amontoamento" de células, pois esfregaços assim preparados, não permitem a realização de um bom exame morfológico (Fonseca, 1992) [Figura 2]. Figura 2: Confecção correta do esfregaço espermático No caso em que se está avaliando sêmen congelado, o procedimento é semelhante: após a descongelação da palheta, toma-se uma gota do seu conteúdo e procede-se o esfregaço conforme descrito. LAVAGEM E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAL Materiais utilizados na lavagem: - escova para tubos; - esponja; - água deionizada ou destilada; - sabão Extran MA – 02 (MERK) - escova de cerdas macias. Todo material utilizado é lavado em água corrente; Depois vai para um recipiente contendo uma solução cuja proporção é de 1 ml de sabão EXTRAN® MA 02 Neutro para 100 ml de H2O destilada. Os materiais devem permanecer nesta solução por 12 h; Após este período, lava-se todo material (tubo cônico, vidros, pipeta, seringa, sonda, borracha de soro) com escova; Em seguida enxaguar cada item 10 vezes em H2O corrente; Depois lavar seis vezes em H2O destilada aquecida a 45-65ºC, por 30 minutos; Retiram-se plásticos e vidros e coloca-os em estufa a temperatura de 45º-60ºC, durante 24h, depois de secos, os vidros são montados e separados dos plásticos. Todas as Vidrarias são vedadas com papel alumínio e zapping, e logo após esteprocedimento são levadas para estufa de Pasteur a 190ºC durante 6h; Plásticos - plastificados em seladora; Depois de embaladas em papal pardo, materiais de plástico (ex. tubos de 15 ml), vão para o microondas por 10 minutos. É importante que dentro do microondas fique um becker com 600 ml de H2O destilada. Toda vez que for esterilizar, trocar a água, pois esta entra em ebulição; Depois de embalados (bailarina, tubo cônico, agulha, seringa, suporte para eppendorf, etc.), vão para autoclave a uma temperatura de 120ºC por 30’; Lâmina e lamínula - deixa de molho, depois lavar em água corrente e colocar no papel toalha, para secar, o material só pode ser montado e embalado em papel alumínio depois de bem seco; Mucosas e cones de látex para coleta de sêmen são lavados seguindo o mesmo protocolo até o item cinco desta seqüência. Depois dos banhos escorre-se bem, coloca-se papel pardo por dentro e embala, sela, e leva para autoclave; Materiais que entram em contato com formol-salina, formol-citrato, metanol e corantes são lavados separadamente; Estes materiais ficam de molho dentro de um recipiente com sabão Extran, da mesma maneira como já citado. Depois vão para a estufa ou autoclave, para serem esterilizados É importante que todo material de borracha seja lavado antes de ser utilizado, esta lavagem ocorre da mesma forma já descrita. VI – EXAME ANDROLÓGICO: PATOLOGIA ESPERMÁTICA E ANORMALIDADES GENITAIS EM TOUROS Cláudio Alves Pimentel Médico Veterinário, PhD pimentel.sul@terra.com.br MORFOLOGIA ESPERMÁTICA INTRODUÇÃO O principal objetivo do Exame Andrológico é o de se fazer uma estimativa da fertilidade potencial do touro e, em segundo lugar, identificar anormalidades no trato genital ou no comportamento sexual que possam comprometer a fertilidade. Em terceiro lugar, deve-se observar seu mérito genético para o fim a que se destina. Um touro pode se apresentar sub-fértil quando tem problemas no sêmen, não consegue executar o ato sexual ou quando é portador de doenças venéreas. A importância do exame andrológico reside no fato de um touro servir, no mínimo, 25 vacas por temporada em regime de monta natural, até milhares, através de inseminação artificial. Neste caso, reveste-se de importância a avaliação de seu mérito genético. Um exame andrológico deve constar de seis etapas básicas: I. Histórico, onde é considerado, principalmente, o objetivo do exame; II. Exame clínico dos órgão genitais III. Exame de sêmen; IV. Exame do comportamento sexual V. Exame microbiológico EXAME DE SÊMEN O exame de sêmen é realizado em duas etapas. Inicialmente é realizado um exame imediato avaliando-se volume, aspecto, pH, motilidade e vigor. Este exame é realizado no local onde se encontra o touro, logo após a coleta. A seguir coletam-se amostras para o exame laboratorial, que é realizado posteriormente, no laboratório (concentração e morfologia espermática). EXAME IMEDIATO O volume é determinado através da leitura direta no copo graduado, em ml. O normal para touros oscila entre 1-10ml. O aspecto está correlacionado com a concentração espermática e quando o exame andrológico se destina a uma simples triagem de touros pré-serviço, o aspecto pode substituir o exame laboratorial de concentração. Quando o aspecto for aquoso, estima-se uma concentração espermática inferior a 300x106/mm3, quando for opalescente, a concentração situa-se entre 300 a 500x106/mm3, leitoso, de 500 a 1000x106/mm3 e cremoso superior a 1.000x106/mm3. O exame de motilidade é realizado de duas maneiras: primeiramente coloca-se uma gota de sêmen sobre lâmina previamente aquecida, e observa-se em pequeno aumento (40X), o movimento de massa dos espermatozóides que é chamado turbilhonamento. Atribui-se valores de 1-4, em cruzes, sendo 4 cruzes quando se pode observar movimentos de onda dos espermatozóides que chegam a formar a letra grega “”. Zero é atribuído quando os espermatozóides estão todos parados. Tabela 1. Classificação do Turbilhonamento (DESCHAMPS & PIMENTEL, 1979) CÓDIGO Classificação DESCRIÇÃO 0 muito pobre Sem movimento de massa + Pobre Apenas grupos de espermatozóides deslocam-se ++ Aceitável Presença nítida de ondas (nuvens) +++ Bom Intenso movimento de ondas e essas bem marcadas ++++ muito bom Movimentos formando a letra grega “” A seguir, coloca-se uma gora de sêmen diluído com uma solução de congelamento (80% de uma solução de citrato de sódio a 2,9% e 20% gema de ovo), previamente aquecida, entre lâmina e lamínula e estima-se subjetivamente a percentagem de espermatozóides móveis em escalas de 10 em 10 %. Segundo BARTH (1989), o espermatozóide do tipo abaxial é normal no touro e faz com que as células se desloquem em movimentos circulares, por isso deve-se estimar não apenas o movimento progressivo, mas também o circular. Durante a estimativa da motilidade, avalia-se o vigor que pode situar-se entre 1 e 5 segundo critérios adaptados de WALTON (1939). Esse exame se refere a qualidade do movimento das células, ou seja a velocidade com que atravessam o campo microscópico, atribuindo-se valor cinco para a velocidade máxima, também estabelecida subjetivamente, e um, quando se tem apenas movimentos oscilatórios. A determinação do pH pode ser de valia em casos de alterações inflamatórias do trato genital e contaminação do ejaculado com urina (pH elevado). Para esse exame faz- se uso de papel indicador com escalas que permitam se avaliar variações de 0,5 unidades. O pH normal do sêmen de touros varia entre 6 e 7 (BLOM, 1950). EXAME LABORATORIAL A concentração espermática pode ser determinada utilizando-se a Câmara de Neubeuer, espectrofotômetro ou contador de células. Para o uso da Câmara de Neubauer, coletam-se 20 l de sêmen em 4 ml de solução de formol salina (BARTH & OKO, 1989). Contam-se 5 quadrados de cada lado da câmara, em diagonal, sem considerar os espermatozóides cujas cabeças esteja sobre as bordas laterais esquerdas e inferior. O total é multiplicado por 10.000 e obtém-se a concentração por mm3 .O exame da morfologia espermática teve seu início no estudo da sub-fertilidade em touros em 1925 por WILLIAMS e SAVAGE. Esses autores relacionaram alterações na forma dos espermatozóides, observados por microscopia, com problemas de fertilidade. Posteriormente, LAGERLÖF (1934), estabeleceu o espermiograma como meio clínico de se diagnosticar alterações reprodutivas em touros. Em 1950, BLOM classificou os defeitos dos espermatozóides em primários (aqueles que se originavam dos testículos) e secundários (aqueles que se originavam após a saída dos espermatozóides dos testículos). Em 1971, RAO, reavaliou o espermiograma de LAGERLÖF (1934) utilizando touros descartados de centrais de inseminação artificial, os quais eram submetidos a exame de sêmen obtido do ejaculado e de diferentes porções do trato genital, associando os defeitos observados com a sua taxa de absorção e com lesões histopatológicas dos órgãos genitais. Mais recentemente, a patologia espermática foi revisada por BARTH & OKO (1989), que discutiram cada defeito dos espermatozóides e suas implicações com a fertilidade. Existem inúmeras maneiras de se examinar a morfologia espermática. Usam-se lâminas coradas (esfregaços) com diferentes tipos de corantes, contrate de fase e contraste interferencial. Os valores do quadro espermático para touros com fertilidade normal, com sêmen coletado com vagina artificial, podem ser resumidos na Tabela 2. . Padrões qualitativos sugeridos para avaliação do sêmen de touros, coletados por vagina artificial. Características do Sêmen Valores Mínimo Volume 3 ml “ Concentração (X106/ml) 500 “ Motilidade (%) 50 “ Vigor (1-5) 3 “ Morfologia espermática (%) “ Normais 60 Máximo Anormalidades de cabeça 10 “ Anormalidades de peçaintermediária 10 “ Anormalidades de cauda 25 “ Gota citoplasmática proximal 10 “ Anormalidades de acrossoma 10 “ Cabeça isolada normal 10 ALTERAÇÕES NO QUADRO ESPERMÁTICO DE TOUROS DEGENERAÇÃO TESTICULAR PROGRESSIVA Fisiologicamente ocorrem processos degenerativos no epitélio seminífero, fazendo com que a eficiência de multiplicação espermatogonial nunca seja de 100 % (CUPPS, 1991). Além disso, nas espécies sujeitas a estacionalidade reprodutiva ocorre uma maior degeneração do epitélio seminífero nos meses de menor atividade sexual, porém ainda dentro dos parâmetros fisiológicos. Porém, em circunstâncias patológicas a magnitude dessa degeneração atinge limites elevados que podem ser diagnosticados através do espermiograma e causar uma sub-fertilidade no rebanho.As causas podem ser diversas, mas sempre aquelas que alteram o equilíbrio homeostático no animal. Podem ser causas de degeneração testicular: transtornos hormonais; térmicos (locais ou sistêmico); desequilíbrios nutricionais (falta de vitaminas, minerais) intoxicações; traumatismos; agentes infecciosos sistêmicos ou locais (ROBERTS, 1986). As principais características do espermiograma de touros com degeneração testicular são: diminuição da motilidade, diminuição da concentração, aumento das anormalidades espermáticas e progressiva deterioração na qualidade do sêmen. O tratamento consiste na eliminação da causa e proporcionar conforto ao animal. Deve-se providenciar para que as necessidades nutricionais e de manejo seja atendidas. Freqüentemente não é detectada a causa dos processos de degeneração testicular. DEGENERAÇÃO TESTICULAR REVERSÍVEL É o processo patológico em que a causa de degeneração testicular incide por um período curto de tempo (como um processo febril, por exemplo) e desaparece, permitindo que o quadro espermático retorne ao normal, num período que pode variar entre 7 e 12 semanas. Esse processo foi reproduzido experimentalmente de diversas maneiras: colocando-se um saco isolante térmico envolvendo a bolsa escrotal e impedindo o processo de termo-regulação testicular; aplicando-se corticóides por uma semana, determinando um bloqueio gonadotrófico; cirurgias testiculares, como biópsia por exemplo. Esse processo cursa com 3 fases distintas: uma fase inicial de queda da motilidade, da concentração, surgimento de espermatozóides decapitados e aumento da gota citoplasmática proximal; essa fase é seguida de uma fase de plateau, que se caracteriza por aumento da percentagem de defeitos de cabeça que se mantém elevada, a motilidade baixa e a concentração também baixa; após a fase de plateau, vem a fase de regeneração que se caracteriza pelo retorno do quadro espermático às suas condições normais. DEGENERAÇÃO TESTICULAR 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Semanas 0 20 40 60 80 100 120 V a ri a v e is Mot. An. Cab . Cab. CabAC ab. GP Conc.. A Figura 1 mostra a dinâmica do processo degenerativo, segundo experimentos realizados com touros. ORQUITE Orquite refere-se a alteração inflamatória dos testículos. Podem ter origem infecciosa, traumática ou auto-imune. Cursa com quadro espermático de degeneração testicular, porém associada a sinais clínicos, tais como aumento de tamanho da gônada, aumento de temperatura, sinais de lesões na bolsa escrotal e, por vezes, pode apresentar leucócitos no ejaculado. O tratamento, assim como na Degeneração testicular deve se fundamentar na eliminação da causa. Quando essa for brucelose ou tuberculose, aconselha-se a eliminação do animal. Em casos unilaterais a orquiectomia pode beneficiar a espermatogênese no testículo contralateral. HIPOPLASIA TESTICULAR A Hipoplasia Testicular é o subdesenvolvimento congênito das gônadas caracterizada por um baixo número de células germinativas nos túbulos seminíferos. Assim como a hipoplasia ovariana, é uma anomalia hereditária causada por um par de genes recessivos de penetrância incompleta e expressividade variável. O quadro espermático é semelhante ao de uma degeneração testicular, porém pode ser diferenciado pelo seu caráter irreversível, enquanto que na degeneração tem um perfil dinâmico. Além disso, está associado a testículos de tamanho reduzido. Histologicamente, a hipoplasia testicular pode ser diferenciada da degeneração, porque nesta última sempre há áreas de fibrose, principalmente espessamento da membrana basal. Na hipoplasia verifica-se uma ausência completa do epitélio germinativo, havendo apenas células de Sertoli no interior dos túbulos seminíferos. Na degeneração há células da linhagem espermática, porém com vacuolização do epitélio em diferentes estágios de comprometimento. Pelo estudo epidemiológico, pode-se identificar a natureza hereditária, já que parentes podem ser sub-férteis e apresentar o defeito, embora de maneira discreta. Não há tratamento e o seu controle é muito dificultado pela variabilidade de manifestação do defeito, além da grande freqüência de portadores heterozigóticos e homozigotos clinicamente normais. A principal atitude a ser tomada é de se evitar a propagação do defeito ao se usar biotécnicas de reprodução animal (inseminação artificial, transferência de embriões e aspiração de ovócitos de vacas portadoras sub-férteis) que permitam a proliferação de descendentes desses animais. Embora não seja uma medida capaz de erradicar o problema, recomenda-se a eliminação dos indivíduos clinicamente diagnosticados. IMATURIDADE SEXUAL Um atraso na puberdade pode ser confundido com Hipoplasia Testicular. Clinicamente o animal apresenta gônadas de tamanho reduzido, quadro espermático típico de hipoplasia, porém a idade é jovem e através de exames repetidos pode-se verificar uma evolução qualitativa no quadro espermático acompanhada de um aumento progressivo no tamanho dos testículos. Deve-se investigar a causa que possa ter determinado o atraso na puberdade. ESPERMIOGÊNESE IMPERFEITA Trata-se de uma hipospermatogênese de natureza congênita, acompanhada, as vezes, de testículos de tamanho reduzido. É hereditária e cursa com infertilidade severa até esterilidade. Difere da hipoplasia testicular clássica por não ter equivalência do defeito nas fêmeas. Ocorre uma falha congênita na espermiogênese, gerando defeitos específicos no ejaculado ou ejaculados de baixíssima qualidade. Neste grupo estão incluídos os casos de “Knobbed Sperm”, Multipolar Spindle Formation e Sticky Chromossome. Não há tratamento e seu controle não deve-se basear apenas na eliminação dos portadores clínicos, mas evitar a difusão de descendentes dos portadores do defeito. TUMOR TESTICULAR Tumores testiculares são mais comuns em touros velhos acima de 7 a 10 anos de idade. Dentre os tumores testiculares, os chamados primários, originam-se das células intersticiais, das células de Sertoli, e do epitélio germinativo. Os tumores das células intersticiais afetam a qualidade do sêmen de touros quando seu diâmetro é superior a 1 cm. Ocorre uma degeneração testicular resultante do excesso de esteróides produzidos por esse tipo de tumor. A palpação esses tumores apresentam-se como massas arredondadas de consistência mais flácida (consistência de fígado). Os outros tipos de tumor são mais raros em touros. Considerando-se a idade e a relação custo benefício, em certos casos pode ser benéfica a castração do testículo comprometido quando for unilateral. A ultra-sonografia tem sido empregada com sucesso no diagnóstico, avaliação e prognóstico desses tipos de alterações. EPIDIDIMITE A epididimite é a principal afeção do epidídimo. Pode ser causada pelos mesmos agentes da orquite ou ser secundária a essa afeção. Dentre os principais agentes infecciosos estão: Brucella abortus, Corynebacterium pyogenes, C. pseudotuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Mycoplasma
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