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Métodos Imunológicos

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NH2
O
O
O- Luz+ +
 
Figura 4. Reação do luminol 
 
 
8 
2.3.3.2 Fosfatase alcalina 
 A fosfatase alcalina é uma enzima que hidrolisa ligações fosfato. Desta forma, os 
cromóforos são compostos que possuem grupos fosfato, e que com a perda deste grupo 
fosfato adquiram cor, como é o caso do p-Nitrofenil-fosfato, que se torna amarelo ao perder o 
grupo fosfato. 
2.3.3.3 Fluoróforo 
 Fluoróforo é um composto que emite luz de uma certo comprimento de onda (λ) 
(coloração) quando excitado por uma luz de um outro λ. A tabela abaixo mostra alguns 
fluoróforos: 
Tabela 1. Fluoróforos com os seus λs de excitação, emissão e coloração. 
Fluoróforo λ de excitação (nm) λ de emissão (nm) Coloração 
Fluoresceína 495 525 verde 
Rhodamina 552 570 vermelho 
 
 Fluoróforos com características diferentes torna possível marcar antígenos diferentes 
com cores diferentes em um mesmo tecido ou célula, permitindo a observação simultânea de 
dois ou mais componentes. 
2.3.4 Metais pesados 
 O principal metal pesado conjugado a anticorpos é ouro. Isto permite localizar antígenos 
através da microscopia eletrônica, permitindo o estudos citológicos bastante específicos. 
2.4 Amplificação do sinal 
 Uma das características mais importantes dos métodos imunológicos de detecção é a 
sua alta sensibilidade. Para que isto seja possível, utiliza-se vários “truques” que amplificam o 
sinal. Quando se utiliza uma enzima para a detecção, esta amplificação provém do fato de 
que aquela enzima poderá produzir vários sinais (fótons de luz, cromóforos, etc), pois a 
enzima continuará ativa enquanto tiver substrato. 
3. Técnicas 
3.1 Purificação 
 
 
9 
 Como discutido anteriormente, uma das principais características dos anticorpos é a sua 
especificidade pelo substrato. Parece óbvio que este especificidade possa ser utilizada para a 
purificação de proteínas. Neste item abordaremos duas técnicas que utilizam anticorpos como 
forma de purificação, a imunoprecipitação e a cromatografia por afinidade. 
3.1.1 Imunoprecipitação 
 Na imunoprecipitação usa-se um anticorpo 
ligado à minúsculas esferas agarose (que é uma 
resina) para precipitar o antígeno. Geralmente esta 
ligação entre anticorpo e agarose é feita através de 
uma proteína A, mas também pode ser feita através 
de outras pontes como a biotina/estreptoavidina (ver 
Ponte 2.3.1). 
 Nesta técnica é importante mencionar que o 
lisado deve ser feito em um meio que permite a 
ligação antígeno/anticorpo, isto é, contendo 
reduzidas concentrações de detergentes não-
iônicos e condição de pH e força iônica adequadas. 
 A este lisados, adiciona-se o anticorpo contra o 
antígeno que se deseja separar e depois a proteína 
A ligada à agarose. Como as esferas de agarose 
possuem um tamanho imenso quando comparadas com os componentes celulares 
encontrados no lisado, pode-se precipitá-las com facilidade usando uma centrifugação a 
baixa velocidade. Após esta centrifugação pode-se dissolver o precipitado (no qual está o 
antígeno ligado à agarose) em uma solução de eletroforese para que esta antígeno possa ser 
analisado através da técnica eletroforética. 
3.1.2 Cromatografia por Afinidade 
 A principal característica que se busca na fase estacionária de uma cromatografia é que 
esta ligue de forma diferenciada os compostos a serem separados. Vários compostos podem 
produzir esta ligação diferencial baseados principalmente em propriedades químicas dos 
compostos. Os anticorpos tem como principal vantagem não ligar apenas de forma 
diferenciada a certos compostos, mas sim selecionar de forma específica um composto. Para 
conseguir isto, ligando-se um anticorpo a uma fase estacionária e se faz passar o lisado que 
contém o antígeno. 
 
Figura 5. Imunoprecipitação. A esquerda uma 
sepação das proteínas da célula. A 
direita uma imunoprecipitação com 
anticorpo específico, que reconhece o 
antígeno e um outro um um anticorpo 
inespecífico 
 
 
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 Após lavar a coluna cromatográfica por um certo período de tempo para retirar os 
componentes não ligados, se elui o antígeno purificado com uma solução contendo condições 
que diminuam a interação antígeno/anticorpo, como, força iônica mais elevada, pH diferente 
do pH fisiológico, detergentes ou solventes apolares. 
 Quando comparado com outras cromatografias, a de afinidade geralmente é a que tem 
um poder de purificação mais elevado. 
3.2 Quantificação e análise 
3.2.1 Imunodetecção 
 A imunodetecção (também denominada “imunoblotting”) é uma técnica que possibilita 
reconhecer e quantificar antígenos a partir de um gel de eletroforese, geralmente SDS-PAGE. 
3.2.1.1 Transferência para a Membranas 
 O gel de eletroforese é um meio pouco apropriado para a imunodetecção, isto é, não é 
um bom suporte para as ligações antígeno/anticorpo. Assim sendo, utiliza-se membranas 
constituídas geralmente de papel, isto é, de celulose, alterada quimicamente. Como exemplo 
pode-se citar a nitrocelulose, que possui grupos nitro ligados à celulose produzindo desta 
forma um suporte com alta afinidade 
por proteínas, fazendo com que 
estas permaneçam presas a sua 
superfície. 
 Para transferir o antígeno do 
gel de eletroforese para a 
membrana utiliza-se um campo 
elétrico (mesmo princípio da 
eletroforese). Neste método, coloca-
se a membrana sobre o ânodo (+) coberto por vários papeis filtro e em seguida o gel, que 
entrará em contato com o cátodo (-), também através de papéis filtro, fazendo com que as 
proteínas, ainda embebidas em SDS (-), possam migrar para o ânodo. Este “sanduíche” é 
mostrado na Figura 6. 
 Um método alternativo, denominado “dot”, permite o uso do lisado celular para a 
detecção do antígeno. Neste caso, não é necessário separar as proteínas por eletroforese, 
sendo uma pequena quantidade do lisado celular (~0,3µl) pingado diretamente sobre a 
membrana. 
 
Figura 6. Transferência das proteínas para a membrana. 
 
 
11 
3.2.1.2 Bloqueio 
 Como a membrana possui uma alta afinidade por proteínas é necessário bloqueá-la, pois 
ao contrário os anticorpos se ligariam a toda a superfície da membrana e não, como 
desejado, especificamente ao antígeno. 
 Para bloquear a membrana geralmente se usa leite em pó desnatado, mas polímeros 
sintéticos como a poli-vinil-pilorridona (PVP) também podem ser usados, principalmente em 
casos nos quais os componentes do leite prejudicam a ligação antígeno/anticorpo. 
3.2.1.3 Primeiro anticorpo 
 Feito isto, adiciona-se o primeiro anticorpo, ou seja, aquele que se ligará ao antígeno. 
Este anticorpo é adicionado em uma solução que mimetiza a solução na qual ele foi 
sintetizado, ou seja, o meio extracelular nos quais os linfócitos B estão embebidos na hora de 
se ligarem ao antígeno e serem selecionados para produzí-lo (um tampão com pH 7,5 e força 
iônica em torno de 1 0sm - 500mM NaCl). A diluição (título) e o tempo de reação, quando não 
especificado pelo fabricante (no caso de anticorpos comerciais) precisam ser determinados 
empiricamente. 
3.2.1.4 Segundo anticorpo 
 
Figura 7. Componentes da imunodetecção 
 
 
12 
 Muitas vezes o primeiro anticorpo já possui um componente que possa ser detectado 
(dispensando o presente item e o seguinte) ou uma molécula ponte que se ligue a uma 
molécula de detecção, dispensando o segundo anticorpo. Quando isto não é o caso, o 
segundo anticorpo se faz necessário. Este anticorpo é desenvolvido contra o IgG do animal 
no qual foi desenvolvido o primeiro anticorpo. 
 Por exemplo: se o primeiro anticorpo foi desenvolvido 
em camundongo, precisaremos neste passo um anticorpo 
anti-IgG de camundongo (obviamente desenvolvido em 
outro animal). 
 Este segundo

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