Biossensor de Pasta de Carbono Modificado para Determinação de Paracetamol

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AUTORES:
VIEIRA,Iolanda Cruz; LUPETTI, Karina Omuro; FATIBELLO-FILHO, Orlando 
ALUNOS:
Fernanda Raye; Guilherme Dias; Uirajá Ruschoni
DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS USANDO UM BIOSSENSOR DE PASTA DE CARBONO MODIFICADO COM EXTRATO BRUTO DE ABOBRINHA (Cucurbita pepo)
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ROTEIRO de apresentação
INTRODUÇÃO A BIOSSENSORES
VOLTAMETRIA
INTRODUÇÃO AO ARTIGO
PARTE EXPERIMENTAL 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
CONCLUSÕES 
REFERÊNCIAS 
Introdução à Biossensores
SENSOR :é um dispositivo que detecta ou mede uma propriedade física e de registros, indicando ou não respostas a ele 
FISICO;
QUIMICO;
BIOSSENSOR;
Introdução à Biossensores
São dispositivos divididos em elementos de reconhecimento, transdutor e processador de sinal.
ELEMENTOS DE RECONHECIMENTO: são frequentemente aplicadas enzimas.
TRANDUTORES: divididos abaixo em quatro categorias 
TRANSDUTORES ELETROQUÍMICOS
Pontenciométricos
Voltamétricos e amperimétricos
condutimétricos
FET-based sensores 
TRANSDUTORES OTICOS
DISPOSITIVO PIEZO-ELETRICO
SENSORES TERMAIS
	
Introdução à Biossensores
PROCESSADOR DE SINAL : software que recebe e converte as mensurações em gráficos ou dados para estudo
VOLTAMETRIA
LINEAR-SWEEP VOLTAMETRIA
VOLTAMETRIA CICLICA
Introdução AO ARTIGO
PARACETAMOL : analgésico e antipirético, que pode causar sérias lesões hepáticas (10 a 15 g) e até ser fatal (20 a 25 g) 
Métodos de identificação são empregados:
cromatografia em camada delgada (CCD);
cromatografia gás-líquido (CGL);
métodos espectrofotométricos;
métodos espectroeletroquímicos;
análise por injeção em fluxo;
VOLTAMÉTRICOS.
Introdução AO ARTIGO
ELETRODO DE PASTA DE CARBONO: ampla aplicabilidade em faixa de potenciais positivos;
Composto por pó de grafite e aglutinante;
Introdução AO ARTIGO
Modificado pela primeira vez com enzima glicose oxidase;
Isso levou ao desenvolvimento de diversos biossensores similares;
Quando modificado diminui o limite de detecção do analito de interesse e aumentar a seletividade das determinações;
Introdução AO ARTIGO
A peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio catalisa a oxidação de alguns substratos doadores de prótons;
É termoestável, sendo recuperada após tratamento termico;
Encontrada em fonte vegetais;
Extratro bruto vs. Enzimas purificadas;
Parte experimental
Os tecidos vegetais usados na obtenção do extrato bruto contendo a enzima peroxidase foram homogeneizados em um liquidificador da Walita, modelo Firenze RI6755.
O BIOSSENSOR CONSTRUIDO E RELATADO NESSE ESTUDO UTILIZA A PASTA DE CARBONO MODIFICADA COM EXTRATO BRUTO DE ABOBRINHA
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Parte experimental
Usou-se na centrifugação do material biológico vegetal, uma centrifuga.
A FIM DE PROMOVER A EXTRACÃO DO EXTRATO BRUTO QUE CONTÉM A ENZIMA PEROXIDASE 
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Parte experimental
CONSTRUÇÃO DO ELETRODO DE PASTA DE CARBONO
Dois tipos de eletrodos de pasta de carbono foram construídos: o primeiro, sem modificador e o segundo modificado com extrato bruto de abobrinha.
Primeiro: homogeneização de diferentes composições em massa de pó de grafite, Nujol e 1% de albumina de soro bovino.
Segundo: A pasta modificada com extrato bruto de abobrinha foi obtida homogeneizando-se 0,375 g de pó de grafite e diferentes concentrações da enzima. Em seguida, foi adicionado nesta mistura 0,120 g de Nujol.
Finalmente, as pastas foram embutidas em seringas e usadas como eletrodos de trabalho.
Parte experimental
O eletrodo de trabalho utilizado foi o de pasta de carbono modificado com extrato bruto de abobrinha (Cucurbita pepo), embutida em uma seringa para insulina com capacidade de 1 mL.
Parte experimental
PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Mediu-se acuradamente uma massa de cada fármaco no intervalo de 5-6 g, transferiu-se para um balão volumétrico de 50 mL e dissolveu-se em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,5. 
Uma alíquota de 1 mL foi transferida para uma célula contendo 10 mL de tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 6,5) com peróxido de hidrogênio 2,0x10-3 mol L-1 e determinado o teor de paracetamol pelo método de adição múltipla de padrão.
Parte experimental
Eletrodo de trabalho: pasta de carbono modificado com extrato bruto de abobrinha.
Eletrodo de Referência: prata cloreto de prata (Ag/AgCl).
Contra eletrodo: platina.
Parte experimental
A corrente devido a redução do analito é utilizada para sua quantificação.
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Parte experimental
PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
A corrente devido a redução ou oxidação do analito é utilizada para sua quantificação.
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Parte experimental
Em geral, o potencial do eletrodo de trabalho é continuamente variado.
 Em determinado valor de potencial:
O eletrodo se tornará tão negativo a ponto de transferir elétrons para o analito, causando sua redução ou
Será tão positivo a ponto de retirar elétrons do analito, causando sua oxidação.
 A corrente devido a redução ou oxidação do analito é utilizada para sua quantificação.
Parte experimental
Reação entre paracetamol, peróxido de hidrogênio e peroxidase no biossensor
Parte experimental
Para se empregar a adição múltipla de padrão, basta construir um gráfico onde o eixo das abscissas represente os valores de concentração referentes ao padrão adicionado e o das ordenadas, o sinal analítico correspondente.
Parte experimental
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA PEROXIDASE
A atividade da peroxidase foi determinada medindo-se a variação de absorbância (λ = 470 nm) do tetraguaiacol formado na reação enzimática.
Esquema da reação onde a enzima peroxidase converte o guaiacol e o peróxido de hidrogênio em tetraguaicol
Parte experimental
A determinação de proteína total e atividade dos extratos brutos foram feitas empregando-se um espectrofotômetro Femto modelo 700.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO ENZIMÁTICO
Foram selecionados os tecidos vegetais de pêssego, inhame, mandioca, alcachofra, batata doce, nabo, rabanete e abobrinha e determinou-se a atividade específica de cada extrato bruto enzimático.
A atividade e a proteína total varia em função do procedimento de extração escolhido.
Estudou-se o efeito do pH, tendo a maior atividade da enzima entre pH 6,0 e 6,5
Várias substancias protetoras/estabilizadoras foram testadas, a fim de minimizar o escurecimento dos tecidos vegetais. O Polyclar Super R foi o mais eficiente
2. DE MODO QUE FEZ-SE NECESSÁRIO UM ESTUDO SISTEMÁTICO SOBRE A EXTRACÃO DA PEROXIDADE.
3. O EFEITO PH FOI ESTUDADA VARIANDO DE 5 A 8 DURANTE A EXTRAÇÃO 
4. COM O OBJETIVO DE MINIMIZAR O ESCURECIMENTO DOS TECIDOS VEGETAIS VÁRIAS SUBSTANCIAS PROTETORAS/ESTABILIZADORAS FORAM TESTADAS. POLYCLAR O + EFICIENTE
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
ESSE ESCURECIMENTO NOTÁVEL EM VEGETAIS QUE FICAM EXPOSTOS DEPOIS DE CORTADOS, ESTÁ RELACIONADA COM AS REACÕES E/S NATURAIS NA PRESENCA DO OXIGENIO MOLECULAR (MEIO EXTERNO). 
POLYCLAR = POLIVINILPIRROLIDONA = PVP SOLÚVEL EM ÁGUA. CAPAZ DE REMOVER COMPOSTOS FENÓLICOS EM SOLUCÕES 
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Atividade enzimática de diferentes tecidos vegetais
Maiores atividades específicas foram encontradas para nabo, rabanete e abobrinha
DEPOIS DE PRONTOS OS EXTRATOS BRUTOS ENZIMÁTICOS, FOI POSSIVEL OBSERVAR OS RESULTADOS APRESENTADOS AQUI NESTA TABELA
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os extratos brutos obtidos da abobrinha, rabanete, batata doce e nabo, em Polyclar Super R foram estocados em um refrigerador a 4 oC e suas atividades foram determinadas periodicamente durante vários dias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
ELETRODOS DE PASTA DE CARBONO E PASTA DE CARBONO MODIFICADO COM EXTRATO BRUTO DE ABOBRINHA
Inicialmente, foram estudadas diferentes composições de grafite e Nujol sobre a resposta do eletrodo de pasta de carbono.
O melhor desempenho analítico do eletrodo de pasta de carbono foi observado para aquele eletrodo contendo 75% de grafite, 24% de Nujol e 1% de albumina de soro bovino.
Catálise enzimática – [Enzima]  A melhor resposta desse biossensor foi obtida usando 200 unidades de peroxidase (400 unidades/g depasta de carbono).
1.COMO FOI DITO ANTERIORMENTE FORAM FEITOS 2 TIPOS ELETRODOS DE PASTA DE CARBONO. O PRIMEIRO NÃO MODIFICADO E O SEGUNDO MODIFICADO COM O ESTRATO DE ABOBRINHA.
2.PARA A REPRODUCÃO DESSES 2 ELETRODOS FORAM ESTUDADAS DIFERENTES COMPOSICÕES DE GRAFITE E NUJOL
A MELHOR COMPOSICÃO PARA ESSA COMBINACÃO DE GRAFITE E NUJOL ENCONTRADA FOI DE 75% GRAF, 24 NUJ, 1 ALBUMINA
3. NA CATÁLISE ENZMÁTICA, MAS TEM UM LIMITE, QDO ALCANCADA CERTA [ ] A VELOCIDADE [E ESTABILIZADA;
+ QUE 200 UNI DE PEROXIDADES AUMENTA A RESISTENCIA ELÉTRICA, DIFICULTANDO A TRANSFERENCIA DE ELETRONS NO BIOSSENSOR
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
 NA CATÁLISE ENZMÁTICA, MAS TEM UM LIMITE, QDO ALCANCADA CERTA [ ] A VELOCIDADE [E ESTABILIZADA;
+ QUE 200 UNI DE PEROXIDADES AUMENTA A RESISTENCIA ELÉTRICA, DIFICULTANDO A TRANSFERENCIA DE ELETRONS NO BIOSSENSOR
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
EFEITO DO PH E DA CONCENTRAÇÃO DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO
O pH exerce grande influência sobre as reações enzimáticas.
A melhor resposta do biossensor foi verificada em pH 6,0.
A peroxidase catalisa a reação de oxidação de substratos doadores de prótons na presença de solução de peróxido de hidrogênio.
Selecionou-se então a concentração de 2,0x10-3 mol L-1 de peróxido de hidrogênio para o desenvolvimento deste trabalho.
AS ENZIMAS APRESENTAM PH ÓTIMO ONDE A ATIVIDADE E VELOCIDADE DA REACÃO SÃO MAXIMAS 
PH ONDE SE VERIFICOU MAIOR ATIVIDADE ENZ = 6
A REACÃO CATÁLITICA ENTRE O PARACETAMOL E A PEROXIDASE, OCORRE NA PRESENCA DE PEROXIDO DE HIDROGENIO
CRESCEU ATÉ 2.,0X10 -3 MANTEVE-SE CONSTANTE EM 1,2 x 10 -2
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
REAÇÃO DO PARACETAMOL COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO E PEROXIDASE
A peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio catalisa a oxidação do paracetamol levando à formação de N-acetil-p-benzoquinonaimina.
Em seguida, esse composto é reduzido eletroquimicamente ao substrato de partida.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
As medidas voltamétricas foram feitas no potencial de + 0,5 a - 0,5 V com uma velocidade de varredura de 100 mV/s
A curva analítica (Ipc=3,115 + 15086 [paracetamol], r=0,9965) foi construída a partir das correntes de pico catódicas (Ipc), medidas no potencial de -0,10 V, em função da concentração de paracetamol.
MEDIDAS VOLTAMÉTRICAS GERADAS EM POTENCIOSTATO.
CORRENTE CATÓDICAS = CORRENTE DE REDUCÃO
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
MEDIDAS VOLTAMÉTRICAS GERADAS EM POTENCIOSTATO.
CORRENTE CATÓDICAS = CORRENTE DE REDUCÃO
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Obteve-se uma relação linear entre as correntes de pico catódicas (μA)e as concentrações de paracetamol no intervalo de 1,2x10-4 a 2,5x10 -3 mol L-1
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
EFEITO DE SUBSTÂNCIAS CONCOMITANTES
Substâncias concomitantes ou excipientes presentes nas amostras de paracetamol:
Ácido cítrico, benzoato de sódio, metabissulfito de sódio, estearato de magnésio e sacarina.
As razões de concentração entre paracetamol e os excipientes foram fixadas em 0,1, 1,0 e 10. Nenhuma dessas substâncias interferiu na resposta do biossensor com exceção do metabissulfito em proporções 10 vezes maiores.
No entanto, essa relação de concentrações não é encontrada em nenhum dos produtos farmacêuticos empregados nesse trabalho.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
ESTUDOS DE ADIÇÃO E RECUPERAÇÃO
SuOs resultados obtidos no estudo de adição e recuperação de paracetamol em amostras de Resfenol e Resprin (n=5) estão apresentados na Tabela 2. 
Os valores de recuperação de paracetamol nestas amostras variaram de 97,3 a 106% indicando, assim, que o procedimento analítico proposto não sofre interferência das matrizes dessas amostras.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
O biossensor apresentou um bom desempenho analítico e um tempo de vida superior a 7 meses (mais de 900 determinações por quantidade de pasta embutida em cada seringa). 
Cabe ressaltar que o emprego desse extrato bruto vegetal proporcionou um tempo de vida do biossensor muito superior a aqueles tempos de vida de biossensores de pasta de carbono usando peroxidase purificada14
RESULTADOS E DISCUSSÃO
conclusão
O biossensor de pasta de carbono modificado com extrato bruto de abobrinha para determinação de paracetamol em produtos farmacêuticos desenvolvido neste trabalho possui várias vantagens como:
baixo custo; 
facilidade de construção; 
alta estabilidade e; 
tempo de vida superior aos biossensores usando enzima purificada. 
A metodologia proposta é simples e poderá ser uma alternativa aos métodos cromatográficos de determinação desse fármaco.
Referências
EGGINS, B.R. Chemical Sensors and Biosensors; Northern Ireland: John Wiley and Sons 2003.
HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa; tradução e revisão técnica de: Oswaldo Esteves Barcia, Júlio Carlos Afonso - Rio de Janeiro: LTC 2013. 8.ed.
ViEIRA,Iolanda Cruz; LUPETTI, Karina Omuro; FATIBELLO-FILHO, Orlando ............