ac nucleicos

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Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ)
IC 392 – Bioquímica I A
Turma T02
ÁCIDOS NUCLEICOS
2019-I
ÁCIDOS NUCLEICOS
OLIVEIRA JMS¹
¹Alunos do curso de Engenharia Química da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Instituto de Tecnologia, Departamento de Engenharia Química
e-mail: julia.aa271996@gmail.com
RESUMO – Nucleotídeos apresentam uma variedade de funções no metabolismo celular. Eles são a moeda energética nas transações metabólicas. O DNA (ácido desoxirribonucleico) e o RNA (ácido ribonucleico) são longos polímeros lineares, chamados de ácidos nucleicos, que carregam a informação de uma maneira que pode ser passada de uma geração para a próxima, isto é, são repositórios moleculares da informação genética. Vale ressaltar que a capacidade de armazenar e transmitir a informação genética de uma geração a outra é condição fundamental para a vida. Desta forma, o presente trabalho tem como intuito elencar os tipos de DNA, sua síntese e de outros compostos como RNAt, RNAr e RNAm além de técnicas e reações que estão presentes neste tema.
IC 392 – Bioquímica I A
ÁCIDOS NUCLEICOS
Professor: Cristiano Jorge Riger
	Aluno
	Matrícula
	Rubrica
	Julia Mendonça dos Santos de Oliveira
	201602043-1
	
Seropédica, Rio de Janeiro
2019
Tabela 1. Evidências da literatura para possíveis papéis biológicos das formas A e Z.	11
Tabela 2. Proteínas do replissomo de E. coli.	21
Figura 1. Estrutura de Ácidos Nucleicos.	6
Figura 2. Estrutura de um nucleotídeo.	7
Figura 3. Estrutura da pirimidina e da purina.	7
Figura 4. Estrutura das bases púricas e pirimídicas.	7
Figura 5. Conformação das formas A,B e Z do DNA.	9
Figura 6. Representação esquemática de duplas hélices nas conformações B e Z-DNA	10
Figura 7. Biossíntese do DNA.	12
Figura 8. Síntese do DNA.	13
Figura 9. Atividade da DNA polimerase I.	14
Figura 10. Núcleo das polimerases.	14
Figura 11. Exemplo de correção de erro pela atividade de exonuclease 3’-5’ da DNA polimerase I.	15
Figura 12. Tradução de corte	16
Figura 13. DNA polimerase III.	17
Figura 14. Modelo para iniciação da replicação na origem de E. coli, oriC.	18
Figura 15. Síntese dos fragmentos de Okazaki.	19
Figura 16. Síntese do DNA nas fitas líder e retardada.	20
Figura 17. Etapas finais na síntese dos segmentos da fita retardada.	21
Figura 18. Terminação da replicação dos cromossomos em E. coli	22
Figura 19. Etapas da transformação genética.	23
Figura 20. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrição.	24
Figura 21. Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição.	25
Figura 22. Fitas molde e codificante.	26
Figura 23. Mecanismo de alongamento.	27
Figura 24. Translocação	27
Figura 25. Retrocesso.	28
Figura 26. Sequência de promotores bacterianos.	28
Figura 27. Desenrolamento do DNA.	29
Figura 28. Bolha de Transcrição	30
Figura 29. Sinal de Terminação	31
Figura 30. Mecanismo para o término da transcrição pela proteína ρ	32
Figura 31. Transcrito primário.	32
Figura 32. Elementos promotores eucarióticos comuns	34
Figura 33. Estrutura geral das moléculas de tRNA	39
Figura 34. Técnicas de Southern e Northern blotting para isolamento e identificação de DNA e RNA, respectivamente.	40
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
1.	INTRODUÇÃO	7
2.	OBJETIVO	9
3.	TIPOS DE DNA	9
4.	SÍNTESE DO DNA	13
4.1	Iniciação	19
4.2	Alongamento	19
4.3	Terminação	22
5.	TÉCNICA DO DNA RECOMBINANTE	23
6.	SÍNTESE DE RNAt, RNAr e RNAm	26
7.	SÍNTESE DE PROTEÍNAS	37
8.	REAÇÕES DE RT-PCR: NORTHERN BLOT E SOUTHERN BLOT	41
9.	REFERÊNCIAS	44
1. INTRODUÇÃO
Ácidos nucleicos, e DNA em particular, são macromoléculas chave para a continuidade da vida. O DNA carrega a informação hereditária que é passada de pais para filhos, fornecendo instruções de como (e quando) fazer as muitas proteínas necessárias para construir e manter o funcionamento das células, tecidos e organismos.
Os ácidos nucléicos são substâncias ácidas presentes no núcleo das células, e estão envolvidas no armazenamento, na transmissão e no processamento das informações genéticas de uma célula. Existem dois tipos de ácidos nucléicos: o ácido desoxirribonucléico (DNA) e o ácido ribonucléico (RNA). O DNA codifica a informação hereditária de um organismo e controla o crescimento e a divisão das células. Ambos são biopolímeros (polinucleotídeos) constituídos de subunidades de nucleotídeos unidas por ligações fosfodiéster (Figura 1). Um dinucleotídeo contém duas subunidades de nucleotídeo, um oligonucleotídeo contém de três a dez subunidades e um polinucleotídeo contém muitas subunidades. Cada nucleotídeo é composto por um carboidrato do grupo das pentoses, um radical fosfato e um composto aromático heterocíclico (Figura 2). Os compostos aromáticos heterocíclicos são chamados bases purínicas e pirimidínicas. Dois compostos aromáticos heterocíclicos contendo nitrogênio (pirimidina e purina), constitui uma unidade estrutural chave dos ácidos nucléicos (Figura 3).
Figura 1: Estrutura de Ácidos Nucleicos.
Figura 2: Estrutura de um nucleotídeo.
Figura 3: Estrutura da pirimidina e da purina.
A pirimidina e a purina são as bases que constituem os ácidos nucléicos. Uma diferença importante entre as moléculas de DNA e de RNA diz respeito a essas bases nitrogenadas. No DNA existem quatro bases: duas são purinas (adenina e guanina) e duas são pirimidinas (citosina e timina). O RNA também é constituído por somente quatro bases. Três são as mes- mas de DNA (adenina, guanina e citosina) e a quarta é a uracila em vez da timina. A timina diferencia da uracila somente por um grupo metila. As bases púricas e as bases pirimídicas são mostradas na figura 4.
Figura 4: Estrutura das bases púricas e pirimídicas.
A sequência de aminoácidos de cada proteína na célula e a sequência nucleotídica de cada RNA são especificadas pela sequência nucleotídica do DNA da célula. Um segmento de uma molécula de DNA que contém a informação necessária para a síntese de um produto biologicamente funcional, seja proteína ou RNA, é denominado gene. Uma célula costuma ter muitos milhares de genes, e moléculas de DNA, não surpreendentemente, tendem a ser muito grandes. O armazenamento e a transferência da informação biológica são as únicas funções conhecidas do DNA. O RNA tem uma ampla variedade de funções e muitas classes são encontradas nas células. Os RNA ribossomais (rRNAs) são componentes dos ribossomos, os complexos que executam a síntese proteica. Os RNAs mensageiros (mRNAs) são intermediários, carregando a informação genética de um ou poucos genes para o ribossomo, onde as proteínas correspondentes podem ser sintetizadas. Os RNAs transportadores (tRNAs) são moléculas adaptadoras que traduzem fielmente a informação no mRNA em uma sequência específica de aminoácidos. 
2. OBJETIVO
Descrever os tipos de DNA, sua síntese e do RNAt, RNAr e RNAm além de explicar o funcionamento da técnica do DNA Recombinante e sua função. Por fim, apresentar como ocorre a síntese de proteínas e as reações de RT-PCR. 
3. TIPOS DE DNA
O DNA pode existir em muitas formações diferentes. As formações mais comuns são: DNA-A, DNA-B, DNA-C, DNA-D, DNA-E, DNA-H, DNA-L, DNA-P, e DNA-Z.
A Conformação B é a mais estudada por ser a predominante no meio celular. As formas A e Z podem ser induzidas por uma série de fatores ambientais ou estruturais, ou pela ligação de moléculas indutoras.
Em 1951, Rosalind Franklin, com objetivo de aprimorar imagens do padrão de difração de raios-X de diversas amostras de DNA, realizou estudos onde a umidade relativa dos meios de cristalização era variada. Ela observou que, em 75% de umidade, o DNA encontrava-se no estado cristalino que já havia sido observado (e que ela chamou de forma A). No entanto, quando a umidade era elevada para aproximadamente 92%, as fibras de DNA assumiam um estado para-cristalino, se tornando mais alongadas e finas (forma B) e produzindo imagens mais nítidas. (Franklin & Gosling, 1953).
Foi a partir de uma imagem da forma B
do DNA obtida por Franklin, a qual Watson e Crick tiveram acesso através de meios no mínimo questionáveis (Maddox, 2003), que a dupla propôs, em 1953, o famoso modelo de dupla hélice e pareamento específico das bases, pelo qual ganharam o prêmio Nobel de Fisiologia em 1962 (Watson & Crick, 1953). Nas décadas seguintes, esse modelo tornou-se bem estabelecido tanto para a forma A como para a forma B.
A partir da década de 1970, foram desenvolvidos métodos de síntese de DNA (Itakura et al., 1975; Aretzen & Reese, 1977), que tornaram possível a obtenção de pequenos fragmentos puros de DNA – de sequencia definida e pré-determinada – em quantidades suficientes para se produzir cristais. Assim, tiveram início os primeiros estudos de DNA por cristalografia de difração de raios-X de monocristal (single-cristal X-ray diffration). 
Em 1979, o primeiro hexâmero a ter sua estrutura desvendada, de sequencia poli(dC-dG)3, adotou uma conformação nova e inusitada, com inversão do sentido da dupla hélice em relação às formas A e B (Wang et al., 1979). Nessa conformação, além das hélices possuírem sentido de mão esquerda ao invés do sentido de mão direita, a cadeia principal possui um formato em zigue-e-zague, razão pela qual a conformação foi chamada de Z-DNA. (Rich & Zhang, 2003).
Figura 5: Comparação das formas A, B e Z do DNA.
Figura 6: Representação esquemática de duplas hélices nas conformações B e Z do DNA.
À medida que aumentava a quantidade de estruturas de DNA analisadas pro cristalografia de raios-X, tornou-se bem estabelecido que a forma mais representativa in vivo é a forma B. Por sua vez, observou-se que a adoção das formas A e Z podia ser induzida por uma série de fatores ambientais ou estruturais. Os primeiros desses fatores a se tornarem bem conhecidos foram os ambientais, normalmente ligados às características experimentais: baixa umidade relativa, percentual de álcoois em solução ou na presença de contra-íons (Fraklin & Gosling, 1953; Pohl & Jovin, 1972; Thamann et al., 1981). Posteriormente, foram sendo descobertos outros fatores indutores das conformações A ou Z, que não estão restritos aos meios experimentais, como a sequência de pares de bases (Calladine & Drew, 1984), a presença de poliaminas (Thomas & Messner, 1986; Thomas et al, 1991; Thomas & Thomas, 1994) ou o estresse topológico (Nordheim et al., 1982; Peck et al., 1982). Enquanto que a sequencia de pares de bases é uma características intrínseca da molécula, a presença de poliaminas, bem como o estresse topológico, são de ocorrência frequente no meio celular.
Ainda, mais recentemente, foram descobertas proteínas e enzimas capazes de reconhecer, de forma específica, ou induzir determinadas conformações, sugerindo o envolvimento destas em processos celulares (Kim et al., 1993a; Hebert et al., 1995; Ivanov et al., 1995; Dóstal et al., 1998; Brandit & Jacobs, 2001; Schwartz et al., 2001).
As primeiras evidências de um papel biológico da forma Z-DNA se deram com a descoberta de que esta conformação é induzida in vivo por superespiralamento negativo que alternam algumas bases púricas e pirimídicas. Este processo, por sua vez, pode ser causado pela ligação de proteínas ao DNA, entre elas, enzimas envolvidas no processo de transcrição. 
Tabela 1: Evidências da literatura para possíveis papéis biológicos das formas A e Z.
 
4. SÍNTESE DO DNA
Os nucleotídeos apresentam uma variedade de importantes funções em todas as células. Eles são precursores do DNA e do RNA. Os desoxirribonucleotídeos, os blocos constitutivos do DNA, são produzidos a partir dos ribonucleotídeos correspondentes, por redução direta do átomo de carbono 29 da D-ribose, formando o derivado 29-desóxi.
O DNA é sintetizado por enzimas chamadas DNA polimerases. Como dito anteriormente, o DNA é sintetizado a partir de várias unidades de nucleotídeos (desoxirribonucleotídeos) unidas por ligações fosfodiéster. Essas junções unem o grupo 3’-OH de um nucleotídeo ao grupo 5’-OH do próximo nucleotídeo. Isso significa que o DNA é sintetizado na direção 5’→3’. O DNA é formado por duas fitas complementares unidas por ligações de hidrogênios entre as bases, adenina (A) com timina (T), unidas por duas ligações de hidrogênio, e citosina (C) com guanina (G), unidas por três ligações de hidrogênio. Essas fitas são antiparalelas porque uma cresce no sentido 5’→3’ e a outra 3’→5’.
Figura 7: Biossíntese do DNA.
As enzimas que sintetizam o DNA podem copiar moléculas de DNA que contêm milhões de bases. Elas o fazem com fidelidade e velocidade extraordinárias, apesar do substrato de DNA ser altamente compactado e ligado a outras proteínas. A formação das ligações de fosfodiésteres para unir nucleotídeos no esqueleto de uma fita de DNA em formação é, portanto, apenas parte de um processo elaborado que requer inúmeras proteínas e enzimas.
A busca por uma enzima que poderia sintetizar o DNA começou em 1955. O trabalho de Arthur Kornberg e colaboradores levou à purificação e caracterização de uma DNA-polimerase de células de E. coli, uma enzima de um único polipeptídeo atualmente denominada DNA-polimerase I (Mr 103.000; codificada pelo gene polA). Bem mais tarde, investigadores descobriram que a E. coli contém, pelo menos, quatro outras DNA-polimerases distintas. 
Estudos detalhados da DNA-polimerase I revelaram características do processo de síntese do DNA que agora se sabem são comuns a todas as DNA-polimerases. A reação fundamental é a transferência do grupo fosforil. O nucleófilo é o grupo 39-hidroxila do nucleotídeo na extremidade 39 da fita em crescimento. O ataque nucleofílico ocorre no fósforo a do desoxinucleosídeo-59-trifosfato que chega. O pirofosfato inorgânico é liberado na reação. A reação geral é:
(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi
Onde dNMP e dNTP são desoxinucleosídeos 59-monofosfato e 59-trifosfato, respectivamente. A catálise por praticamente todas as DNA-polimerases envolve principalmente dois íons de Mg21 no sítio ativo. Um desses auxilia a retirar o próton do grupo 39-hidroxila, tornando-o um nucleófilo mais eficaz. O outro se liga ao dNTP de entrada e facilita sua saída do pirofosfato.
Figura 8: Síntese de DNA.
A reação parece prosseguir com apenas uma alteração mínima na energia livre, uma vez que uma ligação fosfodiéster é formada à custa de um anidrido fosfato um pouco menos estável. Entretanto, o empilhamento de bases não covalentes e as interações de pareamento de bases fornecem estabilização adicional ao produto alongado de DNA em relação ao nucleotídeo livre. Além disso, a formação de produtos é facilitada na célula pelos 19 kJ/mol gerados na posterior hidrólise do produto de pirofosfato, pela enzima pirofosfatase. 
Trabalhos recentes com a DNA-polimerase I levaram à definição de duas exigências centrais para a polimerização do DNA. Em primeiro lugar, todas as DNA-polimerases precisam de um molde. A reação de polimerização é guiada por uma fita-molde de DNA, de acordo com as regras de pareamento de bases previstas por Watson e Crick: onde uma guanina está presente em um molde, um desoxinucleotídeo citosina é adicionado à nova fita, e assim por diante. Essa foi uma descoberta particularmente importante, não apenas porque forneceu uma base química para uma replicação de DNA semiconservativa precisa, mas também porque representou o primeiro exemplo da utilização de um molde como guia para uma reação biossintética.
Em segundo lugar, as polimerases precisam de um primer (iniciador). Um iniciador é um segmento de fita (complementar ao molde) com um grupo 39-hidroxila livre, ao qual um nucleotídeo pode ser adicionado; a extremidade 39 livre do iniciador é chamada de terminal do iniciador. Em outras palavras, parte dessa nova fita já deve estar no lugar: todas as DNA-polimerases só podem adicionar nucleotídeos a uma fita preexistente. Muitos iniciadores são oligonucleotídeos de RNA em vez de DNA, e enzimas especializadas sintetizam iniciadores quando e onde são necessários.
Um sítio ativo de DNA-polimerase tem duas partes (Figura 9). O nucleotídeo que chega é inicialmente posicionado
no sítio de inserção. Uma vez que a ligação fosfodiéster é formada, a polimerase desliza para frente no DNA e um novo par de bases é posicionado no sítio de pós- -inserção. Esses elementos estão localizados em um bolso que se assemelha à palma de uma mão (Figura 10).
Figura 9: A atividade da DNA-polimerase I também precisa de uma fita simples não pareada para atuar como molde e uma fita iniciadora.
Figura 10: O núcleo da maioria das polimerases tem um formato semelhante ao de uma mão humana que envolve o sítio ativo.
Após a adição de um nucleotídeo em uma fita de DNA em crescimento, uma DNA-polimerase pode tanto se dissociar como se mover ao longo do molde e adicionar outro nucleotídeo. A dissociação e a reassociação da polimerase podem limitar a taxa de polimerização geral – o processo é geralmente mais rápido quando uma polimerase adiciona mais nucleotídeos sem se dissociar do molde. O número médio de nucleotídeos adicionados antes da dissociação de uma polimerase define sua processividade. DNA-polimerases variam muito em processividade; algumas adicionam apenas alguns poucos nucleotídeos antes de sua dissociação, outras adicionam muitos milhares.
Uma busca por outras DNA-polimerases, ocasionada pelas evidências de que ela não agia sozinha devido à sua relativa processividade lenta e outros fatores, levou à descoberta da DNA-polimerase II e da DNA-polimerase III de E. coli no início da década de 1970. A DNA-polimerase II é uma enzima envolvida em um tipo de reparo do DNA. Já a DNA-polimerase III é a principal enzima de replicação em E. coli. As DNA-polimerases IV e V, identificadas em 1999, estão envolvidas em uma forma incomum de reparo do DNA.
A DNA-polimerase I, logo, não é a enzima principal da replicação; em vez disso, ela executa funções de limpeza durante a replicação, recombinação e reparo. As funções especiais das polimerases são potencializadas por sua atividade de exonuclease 5’3’. Essa atividade, diferente da atividade de revisão da exonuclease 3’5’ (Figura 11), está localizada em um domínio estrutural que pode ser separado da enzima por um tratamento com protease fraca.Figura 11: Exemplo de correção de erro pela atividade de exonuclease 3’5’ da DNA-polimerase I. A análise estrutural localizou a atividade de exonuclease por trás da atividade de polimerase uma vez que a enzima é orientada em seu movimento ao longo do DNA. Uma base mal pareada (aqui um pareamento errado C–T) impede a translocação da DNA- -polimerase I para o próximo sítio. O DNA ligado à enzima desliza para trás para o sítio da exonuclease, e a enzima corrige o erro com sua atividade de exonuclease 3’5’. A enzima então reassume sua atividade de polimerase na direção 5’3’.
Quando o domínio de exonuclease 5’3’ é removido, o fragmento remanescente (Mr 68.000), o fragmento grande ou fragmento de Klenow, mantém as atividades de polimerização e revisão. A atividade de exonuclease 5’3’ da DNA-polimerase I intacta pode substituir um segmento de DNA (ou RNA) pareado com a fita-molde, em um processo conhecido como tradução de corte (nick translation) (Figura 12). A maior parte das outras DNA-polimerases não tem a atividade de exonuclease 5’3’.
Figura 12: Tradução de corte.
A DNA-polimerase III é muito mais complexa do que a DNA-polimerase I. O conjunto completo de 13 subunidades de proteínas (nove tipos diferentes) é chamado de DNA-polimerase III*(Figura 13). A DNA-polimerase III* pode polimerizar o DNA, mas com uma processividade muito menor do que seria de esperar para a replicação organizada de um cromossomo inteiro.
Figura 13: DNA-polimerase III.
A DNA-polimerase III* pode polimerizar o DNA, mas com uma processividade muito menor do que seria de esperar para a replicação organizada de um cromossomo inteiro.
A replicação em E. coli não precisa apenas de uma única DNA-polimerase, mas de 20 ou mais enzimas e proteínas diferentes, cada uma realizando uma tarefa específica. O complexo inteiro foi denominado de sistema de DNA replicase ou replissomo. A complexidade enzimática da replicação reflete as limitações impostas pela estrutura do DNA e pelas necessidades de precisão. As principais classes de enzimas de replicação são consideradas aqui em termos de problemas por elas superados. 
O acesso às fitas de DNA que atuam como moldes requer a separação das duas fitas parentais. Isso geralmente é conseguido pelas helicases, enzimas que se deslocam ao longo do DNA e separam suas fitas, utilizando energia química a partir do ATP. A separação das fitas cria um estresse topológico na estrutura helicoidal do DNA, que é aliviado pela ação de topoisomerases. As fitas separadas são estabilizadas por proteínas de ligação de DNA. Como observado anteriormente, antes das DNA-polimerases poderem começar a sintetizar DNA, iniciadores devem estar presentes no molde – geralmente, pequenos segmentos de RNA sintetizados por enzimas conhecidas como primases. Em última análise, os iniciadores de RNA são removidos e substituídos por DNA; em E. coli, essa é uma das muitas funções da DNA- -polimerase I. Após a remoção de um iniciador de RNA e do intervalo ser preenchido por DNA, permanece um corte (nick) no esqueleto de DNA na forma de uma ligação fosfodiéster rompida. Esses cortes são selados por DNA-ligases. Todos esses processos necessitam de coordenação e regulação, uma ação combinada mais bem caracterizada no sistema de E. coli.
Em suma, a síntese de uma molécula de DNA pode ser dividida em três estágios: iniciação, alongamento e terminação, diferenciando-se tanto pelas reações que ocorrem como pelas enzimas necessárias. Vale ressaltar que, os eventos descritos a seguir refletem a informação derivada principalmente de experimentos in vitro utilizando proteínas purificadas de E. coli, embora os princípios sejam altamente conservados em todos os sistemas de replicação.
4.1 Iniciação
Pelo menos 10 enzimas ou proteínas diferentes participam da fase de iniciação da replicação. Elas abrem a hélice do DNA na origem e estabelecem um complexo de pré-iniciação para reações subsequentes. O componente crucial no processo de iniciação é a proteína DnaA, um membro da família de proteínas AAA1 ATPase (ATPases associadas a diversas atividades celulares). Oito moléculas da proteína DnaA, cada uma com um ATP ligado, ligam-se nos sítios R e I na origem. O DNA está enrolado em volta deste complexo, formando uma estrutura helicoidal virada para direita. A região DUE rica em A=T é desnaturada como resultado da tensão deferida pela ligação adjacente da DnaA. A formação do complexo DnaA helicoidal é facilitada pelas proteínas HU, IHF e FIS, que não são mostradas porque seus papéis estruturais detalhados ainda não foram definidos. Hexâmeros da proteína DnaB se ligam a cada fita, com o auxílio da proteína DnaC. A atividade da helicase da DnaB ainda desenrola o DNA na preparação para a síntese do iniciador e do DNA.
Figura 14: Modelo para iniciação da replicação na origem de E. coli, oriC.
4.2 Alongamento
A fase de alongamento da replicação inclui duas operações distintas, porém relacionadas: a síntese da fita líder e a síntese da fita retardada. Várias enzimas na forquilha de replicação são importantes para a síntese de ambas as fitas. O DNA parental é inicialmente desenrolado pelas DNA-helicases, e o resultante estresse topológico é aliviado pelas topoisomerases. Cada fita separada é, então, estabilizada pela SSB. A partir desse ponto, a síntese das fitas líder e retardada é completamente diferente.
A síntese da fita líder, a mais direta das duas, começa com a síntese pela primase (proteína DnaG) de um iniciador curto de RNA (10 a 60 nucleotídeos) na origem de replicação. A DnaG interage com a helicase DnaB para realizar essa reação, e o iniciador é sintetizado na direção oposta àquela em que a helicase DnaB está se movendo. Com efeito, a helicase DnaB se move ao longo da fita que se torna a fita retardada na síntese do DNA; entretanto, o primeiro iniciador formado na primeira interação DnaG-DnaB funciona como iniciador da síntese da fita líder de DNA na direção
oposta. Desoxirribonucleotídeos são adicionados a esse iniciador por um complexo DNA-polimerase III ligado à helicase DnaB presa à fita de DNA oposta. A síntese da fita líder prossegue então continuamente, acompanhando o desenrolamento do DNA na forquilha de replicação. A síntese da fita retardada, como já foi observado, é realizada em fragmentos curtos de Okazaki (Figura 15a). Inicialmente, um iniciador de RNA é sintetizado pela primase e, como na síntese da fita líder, a DNA-polimerase III se liga ao iniciador de RNA e adiciona desoxirribonucleotídeos (Figura 15b). Nesse nível, a síntese de cada fragmento de Okazaki parece ser direta, mas a realidade é muito complexa. A complexidade reside na coordenação da síntese das fitas líder e retardada. 
Figura 15: Síntese dos fragmentos de Okazaki.
Ambas as fitas são produzidas por um único dímero assimétrico de DNA-polimerase III; isso é conseguido fazendo uma volta na fita retardada de DNA, como mostrado na Figura 17, que coloca juntos os dois pontos de polimerização. A síntese dos fragmentos de Okazaki na fita retardada implica uma coreografia enzimática elegante. A helicase DnaB e a primase DnaG constituem uma unidade funcional no interior do complexo de replicação, o primossomo. A DNA-polimerase III utiliza um conjunto de suas subunidades centrais (a polimerase central) para sintetizar a fita líder continuamente, enquanto o outro conjunto de subunidades centrais realiza o ciclo de um fragmento de Okazaki para o próximo na fita retardada em alça. A helicase DnaB, ligada na frente da DNA-polimerase III, desenrola o DNA na forquilha de replicação (Figura 16a) à medida que ele viaja ao longo do molde da fita retardada na direção 59S39. A primase DnaG ocasionalmente se associa à helicase DnaB e sintetiza um iniciador de RNA curto (Figura 16b). Uma nova braçadeira b deslizante é, então, posicionada no iniciador pelo complexo carregador de braçadeiras da DNA-polimerase III (Figura 16c). Quando a síntese de um fragmento de Okazaki se completa, a replicação para e as subunidades centrais de DNA-polimerase III se dissociam de sua braçadeira b deslizante (e do fragmento completo de Okazaki) e se associam à nova braçadeira (Figura 16d, 16e). Isso inicia a síntese de um novo fragmento de Okazaki. Como observado anteriormente, o complexo inteiro responsável pela síntese coordenada de DNA na forquilha de replicação é conhecido como replissomo. As proteínas que atuam na forquilha de replicação são resumidas na Tabela 2.Figura 16: Síntese do DNA nas fitas líder e retardada.
Tabela 2: Proteínas do replissomo de E. coli.
O replissomo promove a rápida síntese do DNA, adicionando aproximadamente 1.000 nucleotídeos/s para cada fita (líder ou retardada). Uma vez que um fragmento de Okazaki tenha se completado, seu iniciador de RNA é removido e substituído por DNA pela DNA-polimerase I e o corte (nick) remanescente selado pela DNA-ligase (Figura 17).
Figura 17: Etapas finais na síntese dos segmentos da fita retardada.
A DNA-ligase catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre 39-hidroxila na extremidade de uma fita de DNA e 59-fosfato na extremidade da outra fita. O fosfato deve ser ativado por adenilação. A DNA-ligase é outra enzima do metabolismo de DNA que se tornou um importante reagente em experimentos de DNA recombinante.
4.3 Terminação
Por fim, as duas forquilhas de replicação do cromossomo circular de E. coli se encontram em uma região terminal que contém cópias múltiplas de uma sequência de 20 pb denominada Ter (Figura 18). As sequências Ter são arrumadas no cromossomo para criar uma armadilha na qual a forquilha de replicação possa entrar, mas não sair. As sequências Ter funcionam como sítios de ligação para a proteína Tus (substância de utilização de terminal).
O complexo Tus-Ter pode sequestrar uma forquilha de replicação a partir de apenas uma direção. Apenas um complexo Tus-Ter funciona por ciclo de replicação – o primeiro complexo encontrado por qualquer forquilha de replicação. Uma vez que as forquilhas de replicação opostas geralmente param quando colidem, as sequências Ter não parecem ser essenciais, mas elas podem evitar o excesso de replicação por uma forquilha no evento no qual a outra está atrasada ou interrompida por um encontro com um dano no DNA ou algum outro obstáculo.
Figura 18: Terminação da replicação de cromossosmos em E. coli.
Assim, quando qualquer uma das forquilhas de replicação encontra um complexo Tus-Ter funcional, ela para; a outra forquilha para quando encontra a primeira forquilha (presa). As poucas centenas finais de pares de bases de DNA entre esses grandes complexos proteicos são, então, replicados (por um mecanismo ainda desconhecido), completando dois cromossomos circulares topologicamente interligados (catenados). Os círculos de DNA ligados desse modo são conhecidos como catenanos. A separação desses círculos catenados em E. coli precisa da topoisomerase IV (topoisomerase de tipo II). Os cromossomos separados então se segregam em células-filhas na divisão celular. 
Por fim, vale ressaltar que a replicação em células eucarióticas é semelhante, porém mais complexa. A principal DNA-polimerase replicativa em eucariontes é a DNA-polimerase d. A DNA-polimerase a funciona na síntese de iniciadores. A DNA-polimerase « atua no reparo do DNA.
5. TÉCNICA DO DNA RECOMBINANTE
Segundo Stryer (2010), o trabalho pioneiro de Paul Berg, Herbert Boyer e Stanley Cohen no início da década de 1970 promoveu o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, o que elevou a biologia, até então uma ciência exclusivamente analítica, a uma ciência sintética. Novas combinações de genes não relacionados podem ser construídas nos laboratórios por meio da aplicação das técnicas de DNA recombinante. Estas novas combinações podem ser clonadas – amplificadas muitas vezes – por meio de sua introdução em células adequadas, onde elas podem ser replicadas pelo maquinário de síntese de DNA do hospedeiro. Os genes inseridos são geralmente transcritos e traduzidos em seu novo contexto. O mais incrível é que o arcabouço genético do hospedeiro pode ser permanentemente alterado de uma maneira programada.
A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de técnicas, tem uma ampla aplicação. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da seqüência de um gene e conseqüentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável.
A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do 2 DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.
Em suma, a tecnologia do DNA recombinante que permite a transferência de genes de um organismo para outro, mesmo se eles estão distantes na cadeia evolutiva e isso seria impossível através do cruzamento convencional, resultando um organismo geneticamente modificado (OGM), também denominado organismo transgênico, que irá conter uma ou mais características modificadas codificadas pelo gene ou pelos genes introduzidos (COSTA et al., 2011).
Pela tecnologia do DNA recombinante, podem ser isolados genes de praticamente qualquer organismo,
podem ser caracterizados, modificados e transferidos para outro organismo, onde se expressam em quantidades desejadas em células e tecidos específicos, com a ajuda de promotores adequados (Figura 19). Essa transformação genética, principalmente em vegetais, promove à introdução de genes específicos, permitindo um melhoramento nutricional, que seriam impossíveis através do cruzamento sexual ou fusão de gametas (LACERDA, 2006).
Figura 19: Etapas da transformação genética. 
Outro conceito importante neste método refere-se as enzimas de restrição, que são capazes de reconhecer uma pequena sequência de pares de bases e cortar o DNA neste sítio de reconhecimento ou de corte, da mesma forma existem outras enzimas que são capazes de ligar dois fragmentos de DNA. Assim, o DNA de uma espécie pode ser cortado e ligado ao DNA da mesma ou de outra espécie. Estes procedimentos também podem ser conhecidos como: engenharia genética ou tecnologia do DNA recombinante e seus produtos são denominados Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) (GUERRA; NODARI 2001).
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, são proteinas monoméricas ou diméricas e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüência palindrômica, isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta.
Figura 20: Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrição. As setas indicam os sítios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequência.
O interesse por estas enzimas de restrição aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligação dos fragmentos. Isto significava que a recombinação poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Além disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar proteínas de culturas bacterianas.
Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma seqüência única de bases. DNAs de origens diferentes sob a ação da mesma enzima de restrição produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de S e n t i d o d a m i g r a ç ã o Pares de base 6 dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples. Além disto, se a ligação for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos serão ligados permanentemente. A técnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmídeo.
Figura 21: Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição. 
A figura 21 mostra uma molécula de DNA de plasmídeo que tem somente um sítio de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria através de transformação e então o inserto será replicado como parte do plasmídeo. Geralmente, antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmídeos (o plasmídeo usado para esta finalidade porta resistência a pelo menos um antibiótico).
Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia. A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactérias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofator. Os tipos de fragmentos que são ligados pela DNA ligase são os com extremidades coesivas ou não coesivas. 
6. SÍNTESE DE RNAt, RNAr e RNAm
A síntese de RNA constitui uma etapa essencial na expressão da informação genética. Para as células eucarióticas, o RNA transcrito inicial (o precursor do mRNA) frequentemente sofre splicing, removendo íntrons que não codificam sequências de proteínas. Em geral, o mesmo pré-mRNA sofre splicing diferente em tipos distintos de células ou em diferentes estágios do desenvolvimento. 
A síntese de RNA é catalisada por grandes enzimas, denominadas RNA polimerases, e ocorre em três estágios: iniciação, alongamento e término. As RNA polimerases desempenham múltiplas funções nesse processo:
1) Elas rastreiam o DNA à procura de sítios de iniciação, também denominados sítios promotores ou, simplesmente, promotores. Por exemplo, o DNA de E. coli tem cerca de 2.000 sítios promotores em seu genoma de 4,8 × 10 6 pb.
2) Elas desenrolam um curto segmento da dupla-hélice de DNA, produzindo moldes de DNA de fita simples, a partir dos quais a sequência de bases pode ser facilmente lida. 
3) Elas selecionam o ribonucleosídio trifosfato correto e catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster. Esse processo é repetido muitas vezes à medida que a enzima se move ao longo do molde de DNA. A RNA polimerase é totalmente processiva – um transcrito é sintetizado do início ao fim por uma única molécula de RNA polimerase. 
4) Elas detectam sinais de término que especificam o local onde termina um transcrito. 
5) Elas interagem com proteínas ativadoras e repressoras, que modulam a taxa de iniciação da transcrição em uma ampla faixa. A expressão gênica é controlada substancialmente no nível da transcrição.
Vale ressaltar que a química da síntese de RNA é idêntica para todas as formas de RNA, incluindo RNA mensageiro, RNA transportador, RNA ribossômico e RNA regulador pequeno. Seus processos de síntese diferem principalmente na regulação, no processamento pós-transcrição e na RNA polimerase específica que participa.
A reação fundamental da síntese de RNA é a formação de uma ligação fosfodiéster. O grupo hidroxila 3′ do último nucleotídio na cadeia faz um ataque nucleofílico ao grupo α-fosforila do nucleosídio trifosfato que chega, com liberação concomitante de um pirofosfato.
Inicia-se o exame da transcrição ao considerarmos o molde de DNA. O primeiro nucleotídio (sítio de iniciação) de uma sequência de DNA a ser transcrita é indicado como +1, e o segundo, como +2; e o nucleotídio que precede o sítio de iniciação é indicado como –1. Essas designações referem-se à fita codificante do DNA. Convém lembrar que a sequência da fita-molde do DNA é o complemento da fita do RNA transcrito (Figura 22). 
Figura 22: Fitas-molde e codificante. A fita-molde ou antissenso (–) é complementar na sua sequência ao transcrito de RNA.
Em contrapartida, a fita codificante do DNA tem a mesma sequência que o transcrito de RNA, com a exceção da timina (T) em lugar da uracila (U). A fita codificante é também conhecida como fita senso (+), e a fita-molde, como fita antissenso (–). Diferentemente da síntese de DNA, a síntese de RNA pode começar de novo, sem a necessidade de um iniciador (primer). A presença de trifosfato confirma que a síntese de RNA começa na extremidade 5′.
Após a ocorrência da iniciação, a RNA polimerase procede ao alongamento da cadeia de ácido nucleico da seguinte maneira (Figura 23). Um ribonucleosídio trifosfato liga-se ao sítio ativo da RNA polimerase, em local diretamente adjacente à cadeia de RNA em crescimento. O ribonucleosídio trifosfato que chega forma um par de bases de Watson-Crick com a fita-molde. O grupo hidroxila 3′ da cadeia de RNA em crescimento, orientado
e ativado pelo íon metálico firmemente ligado, ataca o grupo α-fosforila para formar uma nova ligação fosfodiéster, deslocando o pirofosfato.
Figura 23: Mecanismo de alongamento.
Para prosseguir na próxima etapa, o híbrido RNA–DNA precisa se mover em relação à polimerase para que a extremidade 3′ do nucleotídio recém-adicionado fique na posição apropriada para a adição do próximo nucleotídio (Figura 24). Essa etapa de translocação não inclui a ruptura de nenhuma ligação entre pares de bases e é reversível; todavia, uma vez ocorrida, a adição do próximo nucleotídio, favorecida pela clivagem do trifosfato e liberação e clivagem do pirofosfato, aciona a reação de polimerização.
Figura 24: Translocação.
Os comprimentos do híbrido RNA–DNA e da região desenrolada do DNA permanecem bastante constantes à medida que a RNA polimerase se move ao longo do molde de DNA. O comprimento do híbrido RNA–DNA é determinado por uma estrutura dentro da enzima que força o híbrido a se separar, deixando a cadeia de RNA sair da enzima e a cadeia de DNA se unir a seu DNA parceiro
O híbrido RNA-DNA também pode se mover no sentido oposto ao do alongamento (Figura 25). Esse retrocesso é, do ponto de vista energético, menos favorável do que o movimento para frente, visto que ele quebra as ligações entre um par de bases. Entretanto, o retrocesso é muito importante para a revisão. A incorporação de um nucleotídio incorreto introduz um par de bases não WatsonCrick. Nesse caso, a ruptura das ligações entre esse par de bases e o retrocesso são de menor custo energético. Após o retrocesso da polimerase, a ligação fosfodiéster um par de bases antes da recémformada está adjacente ao íon metálico no sítio ativo. Nessa posição, uma reação de hidrólise, em que uma molécula de água ataca o fosfato, pode resultar na clivagem da ligação fosfodiéster e na liberação de um dinucleotídio que inclua o nucleotídio incorreto.
Figura 25: Retrocesso.
O processo de alongamento é comum a todos os organismos. Por outro lado, os processos de iniciação e término diferem substancialmente nas bactérias e nos eucariotos. Iniciaremos com uma descrição desses processos em bactérias, começando com o processo de iniciação da transcrição. 
A RNA polimerase bacteriana, com a composição α2ββ′ω refere-se ao cerne da enzima. A inclusão de uma subunidade adicional produz a holoenzima, com composição σ2ββ′ωσ. A subunidade σ ajuda a encontrar locais no DNA onde a transcrição começa, denominados sítios promotores ou, simplesmente, promotores. Nesses locais, a subunidade participa na iniciação da síntese de RNA e, em seguida, dissocia-se do restante da enzima. As sequências a montante (upstream) do sítio promotor são importantes para determinar onde começa a transcrição. 
Um padrão notável tornou-se evidente quando as sequências de promotores bacterianos foram comparadas. Dois temas comuns estão presentes a montante do sítio de iniciação da transcrição. São conhecidos como a sequência –10 e a sequência –35, visto que estão centrados a cerca de 10 e 35 nucleotídios antecedentes ao sítio de iniciação. A região que contém essas sequências é denominada cerne do promotor. As sequências –10 e –35 têm, cada uma delas, um comprimento de 6 pb. Suas sequências de consenso, deduzidas das análises de muitos promotores (Figura 26), são:
Figura 26: Sequência de promotores bacterianos.
Os promotores diferem acentuadamente na sua eficácia. Alguns genes são transcritos com frequência – em uma frequência de até cada 2 s em E. coli. Os promotores para esses genes são designados como promotores fortes. Em contrapartida, outros genes são transcritos com muito menos frequência, uma vez em 10 min; os promotores desses genes são conhecidos como promotores fracos. As regiões –10 e –35 dos promotores mais fortes apresentam sequências que correspondem estreitamente às sequências de consenso, enquanto os promotores fracos tendem a ter múltiplas substituições nesses locais. Com efeito, uma mutação de uma única base na sequência –10 ou sequência –35 pode diminuir a atividade do promotor. A distância entre essas sequências conservadas também é importante, e o ideal é uma separação de 17 nucleotídios. Por conseguinte, a eficiência ou força de uma sequência promotora serve para regular a transcrição. As proteínas reguladoras que se ligam a sequências específicas perto dos promotores e que interagem com a RNA polimerase (Capítulo 31) também influenciam acentuadamente a frequência de transcrição de muitos genes
Para iniciar a transcrição, o cerne α2ββ′ω da RNA polimerase deve ligar-se ao promotor. Entretanto, é a subunidade σ que possibilita essa ligação, tornando a RNA polimerase capaz de reconhecer sítios promotores. Na presença da subunidade σ, a RNA polimerase liga-se fracamente ao DNA e desliza ao longo da dupla-hélice até se dissociar ou encontrar um promotor. A subunidade σ reconhece o promotor mediante várias interações com as bases nucleotídicas do DNA promotor. A estrutura de uma holoenzima RNA polimerase bacteriana ligada a um sítio promotor mostra a interação da subunidade σ com o DNA nas regiões –10 e –35, que são essenciais para o reconhecimento do promotor. Por conseguinte, a subunidade σ é responsável pela ligação específica da RNA polimerase a um promotor no molde de DNA.
Embora as RNA polimerases possam procurar sítios promotores quando ligados ao DNA de duplahélice, um segmento desse DNA de dupla-hélice precisa ser desenrolado para que a síntese possa começar. A transição do complexo promotor fechado (em que o DNA se encontra na forma de duplahélice) para o complexo promotor aberto (em que um segmento de DNA está desenrolado) constitui um evento essencial no processo de transcrição (Figura 27). 
Figura 27: Desenrolamento do DNA.
A energia livre necessária para romper as ligações entre aproximadamente 17 pares de bases na dupla-hélice provém de interações adicionais que são possíveis quando o DNA se desenrola para envolver a RNA polimerase, bem como de interações entre regiões de DNA de fita simples e outras partes da enzima. Essas interações estabilizam o complexo promotor aberto e ajudam a trazer a fita-molde dentro do sítio ativo. O elemento –35 permanece em um estado de dupla-hélice, enquanto o elemento –10 é desenrolado. O palco agora está preparado para a formação da primeira ligação fosfodiéster da nova cadeia de RNA.
A fase de alongamento da síntese de RNA começa com a formação da primeira ligação fosfodiéster. Nesse estágio, podem ocorrer ciclos repetidos de adição de nucleotídios. Entretanto, até que cerca de 10 nucleotídios tenham sido adicionados, a RNA polimerase algumas vezes libera o RNA curto, que se dissocia do DNA. Quando a RNA polimerase passa por esse ponto, a enzima fica ligada a seu molde até que seja alcançado um sinal de terminação. A região contendo a RNA polimerase, o DNA e o RNA nascente corresponde à bolha de transcrição (Figura 28). 
Figura 28: Bolha de Transcrição.
O RNA recém-sintetizado forma uma hélice híbrida com a fita-molde de DNA. Essa hélice RNA–DNA tem cerca de 8 pb de comprimento, o que corresponde a quase um giro de uma dupla-hélice. O grupo hidroxila 3′ do RNA nessa hélice híbrida está posicionado de modo que possa atacar o átomo de fósforo α de um ribonucleosídio trifosfato que chega. O cerne da enzima também contém um sítio de ligação para a fita codificante do DNA. Cerca de 17 pb do DNA são desenrolados durante a fase de alongamento, como na fase de iniciação. A bolha de transcrição move-se a uma distância de 170 Å (17 nm) em um segundo, o que corresponde a uma velocidade de alongamento de cerca de 50 nucleotídios por segundo. Embora rápida, é muito mais lenta do que a velocidade de síntese de DNA, que é de 800 nucleotídios por segundo.
Nas bactérias, o término da transcrição é controlado com tanta precisão quanto a sua iniciação. Na fase de término da transcrição, a formação de ligações fosfodiéster cessa, o híbrido RNA-DNA se dissocia, a região desenrolada do DNA volta a se enrolar, e a RNA polimerase libera o DNA. As regiões transcritas
dos moldes de DNA contêm sinais de parada. O mais simples é uma região palindrômica rica em GC, seguida de uma região rica em AT. O RNA transcrito desse palíndromo de DNA é autocomplementar (Figura 29). 
Figura 29: Sinal de Terminação. 
Em primeiro lugar, é provável que a RNA polimerase faça uma pausa imediatamente após ter sintetizado um segmento de RNA que se dobra em grampo. Além disso, a hélice híbrida RNA–DNA produzida depois do grampo é instável, visto que seus pares de bases rU-dA são os mais fracos dos quatro tipos. Assim, a pausa na transcrição ocasionada pelo grampo faz com que o RNA nascente fracamente ligado se dissocie do molde de DNA e, em seguida, da enzima. A fita-molde solitária do DNA volta a se juntar a seu parceiro para reconstituir o dúplex de DNA, e a bolha de transcrição se fecha.
A RNA polimerase não precisa de ajuda para terminar a transcrição em um grampo seguido de vários resíduos U. Entretanto, em outros locais, o término requer a participação de um fator adicional. Essa descoberta foi obtida com a observação de que algumas moléculas de RNA sintetizadas in vitro pela RNA polimerase atuando sozinha são mais longas do que aquelas sintetizadas in vivo. O fator ausente, uma proteína que causa o término correto, foi isolado e denominado rho (ρ). 
Um indício importante que permite explicar como se termina o processo, é o fato de que a proteína ρ hidrolisa o ATP na presença de RNA de fita simples, mas não na presença de DNA ou de RNA dúplex. A proteína ρ hexamérica é uma helicase, homóloga à helicase da replicação do DNA. Um segmento de nucleotídios liga-se de tal modo que o RNA passa pelo centro da estrutura (Figura 30). A proteína ρ é acionada por sequências localizadas no RNA nascente que são ricas em citosina e pobres em guanina. A atividade de helicase de ρ faz com que a proteína afaste o RNA nascente, enquanto segue a RNA polimerase. Quando alcança a RNA polimerase na bolha de transcrição, ela rompe a hélice do híbrido RNA–DNA, atuando como uma RNA–DNA.
Figura 30: Mecanismo para o término da transcrição pela proteína ρ.
Outras proteínas, além de ρ, podem provocar o término. Por exemplo, a proteína nusA faz com que a RNA polimerase de E. coli reconheça uma classe característica de sítios de terminação. Uma característica comum ao término independente e dependente de proteína é o fato de que os sinais funcionais residem no RNA recém-sintetizado, e não no molde de DNA.
Nos procariotos, as moléculas de RNA mensageiro sofrem pouca ou nenhuma modificação após a sua síntese pela RNA polimerase. Com efeito, muitas moléculas de mRNA são traduzidas enquanto estão sendo transcritas. Por outro lado, as moléculas de RNA transportador e RNA ribossômico são produzidas por clivagem e outras modificações de cadeias nascentes de RNA. Por exemplo, em E. coli, os três rRNA e um tRNA são excisados de um único RNA transcrito primário, que também contém regiões espaçadoras (Figura 31). 
Figura 31: Transcrito primário.
Outros transcritos contêm grupos de vários tipos de tRNA ou de várias cópias do mesmo tRNA. As nucleases que clivam e aparam esses precursores de rRNA e tRNA são altamente precisas. A ribonuclease P (RNase P), por exemplo, gera a extremidade 5′ terminal correta de todas as moléculas de tRNA em E. coli. Sidney Altman e colaboradores mostraram que essa interessante enzima contém uma molécula de RNA cataliticamente ativa. A ribonuclease III (RNase III) remove os precursores de rRNA de 5S, 16S e 23S do transcrito primário pela clivagem de regiões em grampo de dupla-hélice em sítios específicos.
Um segundo tipo de processamento é a adição de nucleotídios às terminações de algumas cadeias de RNA. Por exemplo, CCA, uma sequência terminal necessária para a função de todos os tRNA, é acrescentada às extremidades 3′ de moléculas de tRNA para as quais essa sequência terminal não é codificada no DNA. A enzima que catalisa a adição de CCA é atípica para uma RNA polimerase, visto que ela não utiliza um molde de DNA. Um terceiro tipo de processamento é a modificação de unidades de bases e de ribose dos RNA ribossômicos. Nos procariotos, algumas bases de rRNA são metiladas. São encontradas bases incomuns em todas as moléculas de tRNA. Elas são formadas pela modificação enzimática de um ribonucleotídio padrão em um precursor de tRNA. Por exemplo, resíduos de uridilato são modificados após a transcrição, formando ribotimidilato e pseudouridilato. Essas modificações geram diversidade, possibilitando maior versatilidade estrutural e funcional.
Nos eucariotos, a transcrição se trata de um processo muito mais complexo do que nas bactérias. Isto é, os eucariotos multicelulares utilizam uma regulação diferencial da transcrição para criar tipos celulares diferentes. Nos eucariotos, a transcrição e a tradução ocorrem em compartimentos celulares diferentes: a transcrição ocorre no núcleo delimitado por membrana, enquanto a tradução ocorre fora do núcleo, no citoplasma. Isto permite uma regulação da expressão gênica de modo muito mais complexo, contribuindo para a riqueza da forma e função dos eucariotos.
Nas bactérias, o RNA é sintetizado por um único tipo de polimerase. Em contrapartida, o núcleo de uma célula eucariótica típica contém três tipos de RNA polimerase que diferem na especificidade pelo molde e localização no núcleo. A RNA polimerase I está localizada em estruturas especializadas dentro do núcleo, denominadas nucléolos, onde transcreve o conjunto de genes sequenciais para o RNA ribossômico 18S, 5,8S e 28S. A outra molécula de RNA ribossômico (rRNA 5S) e todas as moléculas de RNA transportador são sintetizadas pela RNA polimerase III, que está localizada no nucleoplasma, mas não nos nucléolos. A RNA polimerase II, que também está localizada no nucleoplasma, sintetiza os precursores do RNA mensageiro, bem como várias moléculas de RNA pequeno, como as do aparelho de splicing e muitos dos precursores dos RNA reguladores pequenos. Embora todas as RNA polimerases eucarióticas sejam homólogas entre si e com as RNA polimerases procarióticas, a RNA polimerase II contém um domínio carboxiterminal singular na subunidade de 220 kDa, denominado CTD; esse domínio é incomum, visto que ele contém múltiplas repetições de uma sequência de consenso YSPTSPS. A atividade da RNA polimerase II é regulada por fosforilação, principalmente nos resíduos de serina do CTD.
Além disso, as polimerases eucarióticas também diferem umas das outras nos promotores aos quais se ligam. Os genes eucarióticos, como os procarióticos, necessitam de promotores para a iniciação da transcrição. À semelhança dos promotores procarióticos, os promotores eucarióticos são constituídos de sequências conservadas que servem para atrair a polimerase ao sítio de iniciação. Entretanto, os promotores eucarióticos diferem nitidamente na sua sequência e posição, dependendo do tipo RNA polimerase à qual se ligam (Figura 32).
Figura 32: Elementos promotores eucarióticos comuns.
RNA polimerase I:. o DNA ribossômico (rDNA) transcrito pela polimerase I é disposto em várias centenas de repetições em série, cada uma delas contendo uma cópia de cada um dos três genes de rRNA. As sequências promotoras estão localizadas em segmentos de DNA que separam os genes. No sítio de iniciação da transcrição, existe uma sequência semelhante a TATA, denominada elemento iniciador ribossômico (rInr, do inglês ribosomal initiator element). A montante, a uma distância de 150 a 200 pb do sítio de iniciação, encontra-se o elemento promotor a montante (UPE, do inglês upstream promotor element). Ambos os elementos ajudam a transcrição, ligando-se a proteínas que recrutam a RNA polimerase I.
RNA polimerase II: os promotores para a RNA polimerase II, à semelhança dos promotores procarióticos, incluem um conjunto de sequências de consenso que definem o sítio de iniciação e que recrutam a polimerase. Todavia, o promotor pode conter qualquer combinação de várias sequências de consenso possíveis. Eles também incluem elementos amplificadores (enhancers), que podem estar muito distantes
(mais de 1 kb) do sítio de iniciação, constituindo uma característica exclusiva dos eucariotos.
 RNA polimerase III: os promotores para a RNA polimerase III estão dentro da sequência transcrita, a jusante do sítio de iniciação. Existem dois tipos de promotores intergênicos para a RNA polimerase III. Os promotores tipo I, encontrados no gene de rRNA 5S, contêm duas sequências conservadas curtas, conhecidas como bloco A e bloco C. Os promotores tipo II, encontrados nos genes de tRNA, consistem em duas sequências de 11 pb, o bloco A e o bloco B, situadas a cerca de 15 pb de ambas as extremidades do gene.
Várias moléculas de RNA são componentes-chave dos ribossomos. A transcrição pela RNA polimerase I produz um único precursor (45S nos mamíferos), que codifica três componentes de RNA do ribossomo: o rRNA 18S, o rRNA 28S e o rRNA 5,8S. O rRNA 18S é o componente de RNA da subunidade ribossômica pequena (40S), enquanto os rRNA 28S e 5,8S são os dois componentes de RNA da subunidade ribossômica grande (60S). O outro RNA componente da subunidade ribossômica grande, o rRNA 5S, é transcrito pela RNA polimerase III como transcrito separado. 
Por fim, a clivagem do rRNA (algumas vezes acopladas a etapas adicionais de processamento) libera os rRNA maduros montados com proteínas ribossômicas, na forma de ribossomos. Como na própria transcrição da RNA polimerase I, a maioria dessas etapas de processamento ocorre no nucléolo da célula, um subcompartimento nuclear. 
Os tRNA transcritos eucarióticos estão entre os mais processados de todos os transcritos da RNA polimerase III. Como nos tRNA procarióticos, o líder 5′ é clivado pela RNase P, o trailer 3′ é removido, e ocorre adição de CCA pela enzima de adição de CCA. Os tRNA eucarióticos também são intensamente modificados nas frações de base e ribose. Essas modificações são importantes para a função. Diferentemente dos tRNA procarióticos, muitos pré-tRNA eucarióticos também sofrem splicing por uma endonuclease e uma ligase para remover um íntron.
7. SÍNTESE DE PROTEÍNAS
As proteínas são os produtos finais da maioria das vias de informação. A toda hora, uma célula típica requer milhares de proteínas diferentes, as quais precisam ser sintetizadas em resposta às necessidades da célula naquele momento, transportadas (direcionadas) para seus locais apropriados na célula e degradadas quando não mais se fizerem necessárias.
Estágio 1: Ativação de aminoácidos: para a síntese de um polipeptídeo de sequência definida, dois requerimentos químicos fundamentais devem ser alcançados: (1) o grupamento carboxil de cada aminoácido deve ser ativado para facilitar a formação da ligação peptídica, e (2) um elo deve ser estabelecido entre cada novo aminoácido e a informação contida no mRNA que o codifica. Ambos os requerimentos são cumpridos ligando-se o aminoácido a um tRNA no primeiro estágio da síntese proteica. A ligação do aminoácido certo ao tRNA certo é fundamental nesse processo. Essa reação ocorre no citosol, e não no ribossomo. Cada um dos 20 aminoácidos é covalentemente ligado a um tRNA específico, às custas da energia do ATP, utilizando enzimas ativadoras dependentes de Mg21, conhecidas como aminoacil-tRNA- -sintases. Quando ligados aos seus aminoácidos (aminoacilados), os tRNAs são considerados “carregados”.
Estágio 2: Iniciação: o mRNA contendo o código para a síntese do polipeptídeo se liga à subunidade menor do ribossomo e ao aminoacil-tRNA iniciador. A subunidade ribossomal maior se liga então para formar um complexo de iniciação. O aminoacil-tRNA iniciador estabelece um pareamento de bases com o códon AUG do mRNA, que sinaliza o começo do polipeptídeo. Esse processo, que requer GTP, é promovido por proteínas citosólicas denominadas fatores de iniciação.
Estágio 3: Alongamento: o polipeptídeo nascente é alongado pela adição de unidades sucessivas de aminoácidos, as quais são ligadas covalentemente após serem levadas até o ribossomo e posicionadas corretamente pelo respectivo tRNA, o qual, por sua vez, realiza um pareamento de bases com o códon correspondente no mRNA. O alongamento requer proteínas citosólicas conhecidas como fatores de alongamento. A ligação de cada aminoacil-tRNA que entra e o movimento do ribossomo ao longo do mRNA são facilitados pela hidrólise de GTP à medida que cada resíduo é adicionado ao polipeptídeo nascente.
Estágio 4: Terminação e reciclagem do ribossomo: a conclusão da cadeia polipeptídica é sinalizada por um códon de parada no mRNA. O novo polipeptídeo é liberado do ribossomo, auxiliado por proteínas denominadas fatores de liberação, e o ribossomo é reciclado para um novo ciclo de síntese.
Estágio 5: Enovelamento e processamento pós-traducional: para que possa atingir sua forma biologicamente ativa, o novo polipeptídeo precisa dobrar-se em sua conformação tridimensional apropriada. Antes ou depois de dobrar-se, o novo polipeptídeo pode sofrer processamento enzimático, incluindo remoção de um ou mais aminoácidos (geralmente da extremidade aminoterminal); adição de grupamentos acetil, fosforil, metil, carboxil, ou outros grupos a certos resíduos de aminoácidos; clivagem proteolítica, e/ou ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos.
A síntese de proteínas ocorre nos ribossomos – enormes complexos que contêm três grandes moléculas de RNA e mais de 50 proteínas. Entre os maiores triunfos da bioquímica nos últimos anos, está a determinação da estrutura do ribossomo e seus componentes, de modo que a sua função já pode ser examinada com detalhes anatômicos. Talvez a conclusão mais significativa desses estudos seja a de que o ribossomo é uma ribozima, isto é, o componente de RNA desempenha os papeis mais fundamentais. Essas observações sustentam fortemente a noção de que a vida evoluiu a partir de um mundo de RNA e que o ribossomo é um sobrevivente desse mundo. 
As moléculas de RNA transportador (tRNA) e o RNA mensageiro (mRNA) também são participantes fundamentais no processo de síntese de proteínas. A ligação entre os aminoácidos e os ácidos nucleicos é inicialmente feita por enzimas denominadas aminoacil-tRNA sintetases. Ao ligar especificamente um determinado aminoácido a cada tRNA, essas enzimas traduzem o código genético.
Um mRNA é descodificado ou lido na direção 5′ para 3′, um códon de cada vez, e a proteína correspondente é sintetizada na direção aminoterminal para carboxiterminal pela adição sequencial de aminoácidos à extremidade carboxila da cadeia peptídica em crescimento. Os aminoácidos chegam à cadeia em crescimento na forma ativada, como aminoacil-tRNA, criados pela união do grupo carboxila de um aminoácido com a extremidade 3′ de uma molécula de tRNA. A ligação de um aminoácido a seu tRNA correspondente é catalisada por uma aminoacil-tRNA sintetase. A clivagem do ATP aciona essa reação de ativação. Para cada aminoácido, existe habitualmente uma enzima ativadora e pelo menos um tipo de tRNA.
A fidelidade da síntese de proteínas exige o reconhecimento acurado de códons de três bases no RNA mensageiro. Convém lembrar que o código genético correlaciona cada aminoácido a um códon de três letras. Um aminoácido não pode por si só reconhecer um códon; consequentemente, o aminoácido é ligado a uma molécula específica de tRNA que á capaz de reconhecer o códon pelo pareamento de bases de Watson-Crick. O RNA transportador atua como molécula adaptadora, que se liga a um códon específico e carrega com ele um aminoácido para a sua incorporação na cadeia polipeptídica.
Todas as moléculas conhecidas de RNA transportador têm as seguintes características:
1) Cada uma delas consiste em uma única cadeia contendo entre 73 e 93 ribonucleotídios.
2) Elas contêm muitas bases incomuns, tipicamente entre 7 e 15 por molécula. Algumas dessas bases são derivados metilados ou dimetilados de A, U, C e G, formados pela modificação enzimática de um tRNA precursor. Algumas metilações impedem a prevenção de alguns pares de bases, tornando, assim, essas bases acessíveis para interagirem com outras bases. Além disso, a metilação confere um caráter hidrofóbico
a algumas regiões dos tRNA, o que pode ser importante para a sua interação com sintetases e proteínas ribossômicas e algumas outras modificações alteram o reconhecimento de códons.
3) A molécula tem uma forma em L.
4) Cerca da metade dos nucleotídios nos tRNA forma pares de bases, produzindo duplas-hélices. As quatro regiões helicoidais são dispostas para formar dois segmentos aparentemente contínuos de dupla-hélice. Esses segmentos assemelham-se ao DNA em forma de A, conforme esperado de uma hélice de RNA. Uma das hélices, contendo as extremidades 5′ e 3′ e a outra hélice, que contém o anticódon e segue verticalmente, formando o outro braço do L.
5) A extremidade 5′ de um tRNA é fosforilada. O resíduo 5′-terminal é habitualmente pG.
6) Um aminoácido ativado é ligado a um grupo hidroxila do resíduo de adenosina no sítio de ligação de aminoácido, localizado na extremidade do componente 3′CCA da haste aceptora. Essa região de fita simples pode mudar de conformação durante a ativação do aminoácido e a síntese de proteína.
7) A alça do anticódon, que está presente em uma alça próxima ao centro da sequência, encontra-se na outra extremidade do L, tornando acessíveis as três bases que compõem o anticódon.
Figura 33: Estrutura geral das moléculas de tRNA.
Uma hipótese simples sustenta que cada uma das bases do códon forma um par de bases do tipo WatsonCrick com uma base complementar no anticódon do tRNA. O códon e o anticódon estariam, então, alinhados de modo antiparalelo. No diagrama da margem, o apóstrofo indica a base complementar. Assim, X e X′ seriam A e U (ou U e A) ou G e C (ou C e G). De acordo com esse modelo, um determinado anticódon pode reconhecer apenas um códon.
Todavia, conforme observado experimentalmente, algumas moléculas de tRNA podem reconhecer mais de um códon. Por exemplo, o alanil-tRNA de levedura liga-se a três códons: GCU, GCC e GCA. As primeiras duas bases desses códons são as mesmas, enquanto a terceira é diferente. Esta hipótese de oscilação da terceira base está, hoje em dia, firmemente. Os anticódons dos tRNA de sequência conhecida ligam-se aos códons previstos por esta hipótese. Por exemplo, o anticódon do alanil-tRNA de levedura é IGC. Esse tRNA reconhece os códons GCU, GCC e GCA. Convém lembrar que, por convenção, as sequências de nucleotídios são escritas no sentido 5′ 3′, a menos que indicado de outro modo. Por conseguinte, I (a base 5′ desse anticódon) emparelha com U, C ou A (a base 3′ do códon), conforme previsto.
Duas generalizações podem ser feitas no que concerne à interação códon-anticódon:
1) O pareamento das duas primeiras bases de um códon ocorre de acordo com o modo padrão. O reconhecimento é preciso. Assim, os códons que diferem em uma de suas duas primeiras bases devem ser reconhecidos por tRNA diferentes. Por exemplo, tanto UUA quanto CUA codificam a leucina, porém são lidos por tRNA diferentes.
2) A primeira base de um anticódon determina se uma determinada molécula de tRNA faz a leitura de 1,2 ou 3 tipos de códons: C ou A (um códon), U ou G (dois códons) ou I (três códons). Assim, parte da degeneração do código genético surge da imprecisão (oscilação) no pareamento da terceira base do códon com a primeira base do anticódon.
O prefixo ribo no nome ribossomo é apropriado, visto que o RNA constitui quase dois terços da massa dessas grandes montagens moleculares. Os três RNA presentes – 5S, 16S e 23S – são críticos para arquitetura e a função do ribossomo. São formados pela clivagem de transcritos 30S primários e outros processamentos. Essas moléculas dobram-se e formam estruturas que possibilitam a formação de pares de bases internos. Seus padrões de pareamento de bases foram deduzidos comparando as sequências de nucleotídios de muitas espécies para detectar sequências conservadas, bem como pareamentos de bases conservados. Por exemplo, o RNA 16S de uma espécie pode ter um par de bases G–C, enquanto outro pode ter um par A–U, porém a localização do par de bases é a mesma em ambas as moléculas. Experimentos de modificação química e digestão apoiaram as estruturas deduzidas de comparações de sequências.
Durante muitos anos, acreditou-se que as proteínas ribossômicas eram as que coordenavam a síntese de proteínas, enquanto os RNA ribossômicos serviam principalmente como arcabouços estruturais. A visão atual é quase o inverso. A descoberta do RNA catalítico tornou os bioquímicos mais abertos à possibilidade de que o RNA desempenhe um papel muito mais ativo no funcionamento do ribossomo. As estruturas detalhadas tornaram claro que os principais sítios no ribossomo, como os que catalisam a formação da ligação peptídica e interagem com o mRNA e o tRNA, são compostos quase totalmente de RNA. As contribuições das proteínas são mínimas. Muitas das proteínas apresentam estruturas alongadas que “abrem seu caminho” na matriz do RNA.
8. REAÇÕES DE RT-PCR: NORTHERN BLOT E SOUTHERN BLOT
Para melhor entendimento das técnicas utilizou-se como referência principal o artigo “Aplicabilidade das técnicas de biologia molecular para a compreensão da foliculogênese inicial em mamíferos” que enlista e exemplifica o uso dos métodos de análise da biologia molecular a serem estudados neste tópico.
A técnica denominada RT-PCR permite amplificar os trechos codificantes diretamente a partir de moléculas de RNAm. Após a extração do RNA, sintetiza-se uma fita única de DNA complementar ao RNAm (DNAc) empregando-se a enzima transcriptase reversa de origem viral. A fita de RNA do híbrido RNA/DNA é digerida com RNAse, e a fita de DNAc é replicada por uma DNA polimerase. A partir do DNAc, emprega-se o método de PCR usual para amplificação (Silva e Andrade, 2001).
A RT-PCR é um método in vitro utilizado para amplificar enzimaticamente determinadas sequências de RNA (Rappolee et al., 1988), sendo a técnica mais sensível para a detecção e quantificação de RNAm atualmente disponível. Comparada com as outras duas técnicas comumente usadas para quantificar RNAm, análise de Northern blot e ensaio de proteção de RNAse, a RT-PCR pode ser utilizada para a quantificação de RNAm em amostras muito menores. De fato, esta técnica é sensível o suficiente para permitir a quantificação aproximada de RNA a partir de uma única célula. É o mais sensível e mais flexível método de quantificação (Wang e Brown, 1999) e pode ser usado para comparar quantidades de RNAm em diferentes populações de amostras, para caracterizar os padrões de expressão de RNAm, para discriminar entre RNAm estreitamente relacionados e para analisar a estrutura do RNA (Bustin, 2000). RT-PCR também pode contornar etapas demoradas e de grande exigência técnica e geração de reagentes, tais como inserções da cadeia completa de DNA complementar (DNAc) para clonagem (Borson et al., 1992).
O advento do PCR e RT-PCR em tempo real mudou drasticamente o campo da mensuração da expressão gênica. Atualmente, a técnica mais utilizada para quantificar a expressão de RNAm é a RT-PCR em tempo real (Kreuzer e Massey, 2002).
A reação de RT-PCR em tempo real, uma variante da RT-PCR convencional, permite uma análise precisa da quantificação da expressão gênica em determinado tecido ou amostra biológica. Esse método utiliza um sistema fluorescente em plataforma, capaz de detectar a luz oriunda da reação de amplificação de um determinado gene no momento real da amplificação (Bustin, 2002).
Um exemplo do uso da técnica é dado quando Silva et al. (2004) identificaram, por meio da técnica de RT-PCR, a presença de RNAm para ativina (sub-unidade βA), folistatina e receptores de ativina (ActR-IA, -IB, IIA e IIB) em todos as categorias foliculares presentes no ovário caprino, com exceção da ActR-IIB, que não foi encontrada em folículos pré-antrais. A mesma equipe, também utilizando o RT-PCR, verificou que o RNAm do kit ligand foi encontrado em todos os estádios de desenvolvimento folicular (primordial, primário, secundário, pequenos e grandes folículos antrais), bem como nos corpos lúteos e superfície epitelial e medular do ovário. Além disso, o RNAm para seu receptor (c-Kit)
foi encontrado em todos os compartimentos celulares de folículos antrais (Silva et al., 2006b). Também na espécie caprina, foi identificado o RNAm para EGF em todas as categorias foliculares e na superfície do epitélio ovariano. Em folículos antrais, o RNAm para EGF foi encontrado no oócito e células do cumulus oophorus, teca e granulosa murais. O RNAm para o receptor para EGF (EGF-R) foi identificado em todos os compartimentos foliculares em todas as categorias, ainda em corpos lúteos e superfície do epitélio ovariano, mostrando a importância desse fator de crescimento para o processo de foliculogênese (Silva et al., 2006a).
As técnicas de Blotting são utilizadas para identificar proteínas únicas ou sequências de ácidos nucleicos. Elas foram desenvolvidas para serem altamente específicas e sensíveis e se tornaram ferramentas importantes tanto em biologia molecular quanto em investigação clínica (Bittner et al., 1980). 
Os métodos de Blotting são bastante simples e, geralmente, consistem em quatro fases distintas: iniciam com a separação por eletroforese de proteínas ou de fragmentos de ácidos nucleicos da amostra; sendo posteriormente realizada a transferência e imobilização das moléculas-alvo em um suporte de papel; em seguida, estas moléculas-alvo se ligam a sondas analíticas, permitindo a visualização das proteínas ou de fragmentos de ácidos nucleicos (Hayes et al., 1989).
As três principais técnicas de Blotting que foram desenvolvidas são comumente chamadas de Southern, Northern e Western Blotting, e possibilitam a identificação de DNA, RNA e proteínas, respectivamente.
O Southern blotting (Southern, 1975) permite que os fragmentos de DNA sejam identificados com sondas de DNA, os quais hibridizam por ligação com hidrogênio para formar fragmentos complementares de DNA cromossômico. Antes da realização da análise de Southern blotting, os fragmentos de DNA devem ser produzidos a partir de cromossomos por digestão enzimática com endonucleases de restrição. Estas enzimas são obtidas a partir de microrganismos e digerem o DNA de fita dupla em locais específicos determinados pela sequência de ácidos nucleicos. Como as endonucleases de restrição dividem (clivam) o DNA nos locais específicos, cada enzima produz um número característico de fragmentos a partir de um único comprimento específico de DNA. Variantes alélicas de um gene específico podem ser detectadas se as diferenças na sequência do ácido nucleico incluírem os locais de clivagem, uma vez que a digestão pela enzima de restrição adequada trará diferentes fragmentos de genes alelos. Assim, mutações podem resultar tanto em perda dos locais de clivagem quanto na introdução de novos, ou seja, locais adicionais de clivagem. Essas diferenças nos fragmentos produzidos a partir de um gene são conhecidas como polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs; Botstein et al., 1980). 
Após digestão enzimática do DNA cromossômico, os fragmentos de DNA resultantes são submetidos à eletroforese em agarose, separando-se os fragmentos de acordo com o tamanho. O gel de eletroforese é, então, coberto com uma folha de nitrocelulose, sobre a qual o DNA é absorvido. Antes da hibridação, uma desnaturação leve em solução alcalina garante que o DNA marcado seja de fita simples. Em seguida, a folha de nitrocelulose é incubada com o gene sonda, que normalmente é um DNA clonado (Miles e Wolf, 1989). O gene sonda terá sido radiomarcado e hibridizado por ligação com hidrogênio ligando-se a fragmentos de DNA cromossômico de fita simples que contenham sequências de ácidos nucleicos complementares. A folha de nitrocelulose é seca e coberta por uma película fotográfica ou de raios X para permitir localização do gene em estudo (Hayes et al., 1989; Fig.34).
Figura 34: Técnicas de Southern e Northern blotting para isolamento e identificação de DNA e RNA, respectivamente.
A análise de Northern blotting emprega basicamente o mesmo processo descrito para Southern blotting, exceto pelo fato de que DNA complementar é utilizado para sonda de RNA. A técnica de Northern blotting (Thomas, 1983) permite que moléculas individuais de RNA mensageiro (RNAm) sejam identificadas e medidas após a hibridação de suas sequências de DNA correspondentes. O RNA mensageiro é inicialmente separado por eletroforese em função de sua dimensão e então transferido para papel antes dos genes sondas que são utilizados para localizar o RNA de interesse. Com este método, as transcrições de genes específicos podem ser estudadas e avaliadas (Hayes et al., 1989; Fig.34)
9. REFERÊNCIAS 
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