Toxicidade e mecanismos relacionados da dihidroartemisinina na maturação in vitro de oócitos suínos

Prévia do material em texto

Universidade Estadual do Ceará
Faculdade de Veterinária - FAVET
Seminário Bolsistas de Iniciação Científica 
Toxicity and related mechanisms of dihydroartemisinin on porcine oocyte maturation in vitro
“Toxicidade e mecanismos relacionados da dihidroartemisinina na maturação in vitro de oócitos suínos”
Yan Luo, et al. Toxicology and Applied Pharmacology. v. 341, p.8-15, 2018.
Orientadora: Ana Paula Ribeiro Rodrigues
Bolsista: Jorgeanny Barbosa Linhares
Fortaleza
2020
1
Boa tarde, me chamo Jorgeanny Linhares, sou aluna de iniciação cientifica sob a orientação da profa. Dra. Ana Paula ribeiro rodrigues e hoje irei apresentar o artigo intitulado “ Toxicidade ....”. Esse artigo foi escrito por Yan Luo e colaboradores e publicado na revista “toxicology and applied pharmacoly” no ano de 2018. 1
1
Amorim et al., 2013, Keating, 2012
Used for the treatment of malaria; 
INTRODUCTION
Artemisinin is a compound isolated from the herb Artemisia annua;
Dihydroartemisinin (DHA) is its major metabolite;;
Toxic effects in embryos and cancer cells.
2
A artemisina é uma susbstância isolada do erva chinesa artemisia annua e seu principal metabólito é a dihidroartemisina ou DHA comumente utilizada no tratamento da malária. No entanto, já foi demostrado seus efeitos tóxicos sobre embriões e células cancerígenas de diversas linhagens.
2
Efferth and Kaina, 2010, Khazaei and Aghaz, 2017
INTRODUCTION
Embryo: oxidative stress, malformation and death;
Anti-cancer activity inducing apoptosis
Effects on the oocytes of females is uncomprehensible
3
Estudos mostram que nos embriões de diversas espécies, causa estresse oxidativo, má formação e morte. Já em células cancerígenas, o DHA, atua sobre várias vias de sinalização desencadeando a apoptose, lesões no DNA e formação de espécies reativas de oxigênio. Porém, pouco se sabe sobre os efeitos tóxicos do DHA sobre a maturação de oócitos por ser um processo complexo que envolve sinalização intra e intercelular. 
3
PROBLEM
DHA has shown toxic effects in differents cell types but it is not clear if use of DHA has side effects on the oocytes.
4
Dessa forma apesar de apresentar efeitos tóxicos em diversos tipos de células seu efeito sobre os oócitos ainda não foram bem estabelecidos.
4
OBJECTIVE
Evaluate the potential effects and mechanisms of DHA on porcine oocyte maturation in vitro.
Nuclear maturation;
Embryo development;
Cytoskeletal dynamics;
Oxidative stress;
Calcium homeostasis;
Apoptosis.
5
Com isso, o trabalho teve como objetivo avaliar o efeito potencial e os mecanismos do DHA sobre a maturação in vitro de oocitos porcinos. Os parâmetros analisados foram: maturação nuclear, desenvolvimento embrionário, dinâmica do citoesqueleto, estresse oxidativo, homeostase de cálcio e apoptose.
5
MATERIAL E MÉTODOS
6
Para Tanto foi utilizada a seguinte metodologia..
6
Abatedouro local
Coleta
35 - 37°C
Transporte
 0.9% NaCl
Aspiração
Lavagem
TL-HEPES-PVA pré-aquecido 
Citoplasma uniforme 
Pelo menos 3 camadas de células de cumulus compactadas
Seleção
MATERIALS AND METHODS
Harvest of oocytes
Complexo Cumulus-oócito (CCO)
7
Ovário suínos foram coletados em abatedouro local e transportados ao laboratório dentro de recipientes térmicos imersos em solução de soro fisiológico a 0,9% suplementado entre 35 e 37 graus celsius. No laboratório os ovários foram puncionadas e o fluido obtido foi lavado em TL- HEPES-PVA pre aquecido. Por fim, os complexos cumulus-oócitos com citoplasma uniforme e pelo menos três camadas de células de cumulus foram selecionados.
7
In Vitro Maturation
38,5 °C; 5% CO2
28-44h
TCM-199
0.57 mM cysteine
0.91 mM sodium pyruvate
10 ng/ml EGF
0.01 U/ml FSH
0.01 U/ml LH
10% (v/v) pFF
MATERIALS AND METHODS
8
Para maturação, os COCs foram distribuídos em placas de 4 poços em meio TCM 199 suplementado e incubadas há 38,5 graus celsius e 5%de CO2 por 28-44h. 
8
MATERIAL E MÉTODOS
Experimental Design – Phase I
COCs
DHA
Control
(TCM199)
10µM
20µM
40µM
80µM
MIV (28-44h)
End Point: Extrusion of the first polar body
9
Deste modo, o experimento seguiu em duas etapas: na primeira, apos da seleção, os CCOs foram maturados com as concentrações de 10, 20, 40 e 80 micromolar após o qual foi certificado a extrusão do corpúsculo polar. O grupo de CCOs tratados com 40 micrômetros apresentou redução de aproximadamente metade comparado ao grupo controle motivo pelo qual foi utilizado nos experimentos seguintes.
9
MATERIAL E MÉTODOS
Experimental Design – Phase II
COCs
DHA (40µM)
Control
(TCM199)
MIV
End Points: Cytoskeleton analysis; Intracellular Reactive Oxygen Species/ROS levels; Intracelullar and mithocondrial calcium levels and Detectation of apoptotic cells; 
Parthenogenetic activation
End Point: Rates of clevage and blastocysts
10
Na segunda fase, os oocitos foram divididos em controle e DHA a 40 micromolar. Esses oocitos foram maturados sendo parte deles destinados a analises de: citoesqueleto,, o nível de espécies reativas de oxigênio, o nível de cálcio intracelular e mitocondrial, a identificação de células apoptóticas . A outra parte foi destinada a ativação paternogenetica para verificação de clivagem e blastocistos.
10
MATERIALS AND METHODS
Spindle morphology and actin assembly
Cell cycle;
Actin-tracker green operating fluid. 
Anti-α-tubulin antibody; 
Cell cycle stages
11
Para verificação do ciclo celular os oócitos foram incubados com anticorpos anti-alfa-tubulina e actin-tracker green. E analisados sob microscópio confocal e de fluorescência, respectivamente.
11
Control
MATERIALS AND METHODS
Levels of Reactive Oxygen Species
2′,7′- dichlorodihydrofluorescein-diacetate (DCFHDA);
Emission measurement by fluorescence intensity (Image J software).
DHA 40 μM
12
Para analisar os níveis intracelulares de espécies  reativas de oxigênio os  CCOs foram incubados com DCFHDA e realizada a medida da intensidade de fluorescência através do programa de image J software.
12
MATERIALS AND METHODS
Intracellular and mitocondrial levels of calcium
Fluo- 3 AM (green)
Rhod-2 AM (red)
Emission measurement by fluorescence intensity (NIS – Elements AR software).
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
13
Para verificar os níveis intracelulares e mitocondriais de cálcio foi utilizado os marcadores fluorescentes fluo-3 AM e Rhod-2AM. E analisados em microscópio confocal em seguida foi realizada a medida da intensidade de fluorescência através do programa NIS-elements AR. 
13
Control
DHA 40 μM
MATERIALS AND METHODS
Annexin – V staining
Identify early apoptotic cells;
14
Emission measurement by fluorescence. 
Para identificar as células em apoptose foi utilizado a proteína Anexina-5-FITC e posteriormente feita mensuração dos emissão de fluorescência.
14
MATERIALS AND METHODS
Estatistical Analysis
Médias ± EPM
P <0,05
Independent-sample t test
Student–Newman–Keuls’s test (multiple comparison)
15
Para análise estatística foram utilizados o teste – t para amostra independente e o teste de Student-Newman-Keuls para comparações ´multiplas. Os resultados foram expressos em médias mais ou menos o erro padrão da média e considerados significativos quando p menor que 0,05.
15
RESULTS
16
Apresentado as metodologias agora irei mostrar os principais resultados...
16
First Polar Body Extrusion 
RESULTS
Grafic 1: Rates of first polar body extrusion after DHA treatment. 
Bars with different letters differ significantly (p < 0.05).
Percentage of first polar body extrusion (%) 
DHA concentration (µM)
17
No gráfico da figura 1 podemos ver as taxas de extrusão do primeiro corpúsculo polar após o tratamento com DHA. É possível observar que em todos os grupos tratados a proporção de extrusão do primeiro corpusculo polar foi significativamente menor em relação ao grupo controle. O grupo de CCOs tratados com 40 micromolar apresentou redução de aproximadamente metade comparado ao grupo controle motivo pelo qual foi utilizado nas avaliações seguintes. Percentage of first polar body extrusion (%) DHA concentration(µM)
17
Spindle morphology and actin assembly
RESULTS
Percentage (%) 
Grafic 2: Rates of different stages when oocytes were cultured for 44 h.
**Significantly different (p < 0.01). 
18
No gráfico da figura 2 podemos verificar os efeitos do tratamento com DHA sobre o ciclo celular. A proporção de oocitos tratados como DHA parados na anáfase e telófase da meiose 1 e em metáfase 2 foram significativamente menores quando comparados ao controle.
18
RESULTS
Levels of Reactive Oxygen Species
Relative ROS fluorescence intensity
Grafic 3: Fluorescence intensity analysis of ROS generation after DHA treatment. 
*Significantly different (p < 0.05).
19
No gráfico da figura 4 é possível observar que intensidade de fluorescência das espécies reativas de oxigênio foi significativamente maior no grupo tratado em comparação ao controle. 
19
Intracellular and mitocondrial levels of calcium
RESULTS
Grafic 4: The intracellular calcium level of oocytes was significantly up-regulated after exposure to DHA.
Grafic 5: The mitochondrial calcium level of oocytes was significantly upregulated after exposure to DHA.
**Significantly different (p < 0.01).
Intracelular calcium level
Mitocondrial calcium level
20
Na figura 5 podemos verificar a mensuração subcelular da concentração de cálcio. É possível observar que o nível mitocondriais e  intracelular de cálcio nos oócitos e foi significativamente maior após a exposição com DHA. 
20
RESULTS
Annexin – V test
Grafic 6: Rates of early apoptosis after DHA treatment.
Early apoptosis oocyte percentage (%)
*Significantly different (p < 0.05).
21
Na figura 6 podemos verificar as taxas de apoptose precoce após o tratamento com DHA. É possível observar que houve aumento significativo da taxa de apoptose em células tratadas em comparação ao controle.
21
RESULTS
Parthenogenetic activation
	Treatment	Nº of oocytes	Nº of cleaved%	Nº of blastocysts%
	Control	135	111 (82.2 ± 1.7)a	46 (35.5 ± 1.9)a
	40 μM	113	18 (15.8 ± 2.6)b	0 (0 ± 0)b
a, b-Values with different superscripts in the same column are significantly different (P < 0.05).
Table 1: Developmental potential of DHA treated porcine oocytes following parthenogenetic activation.
22
Na tabela 1 é possível verificar que após a ativação partenogenética os oocitos tratados com DHA apresentaram taxa de clivagem significativamente menor quando comparados ao grupo controle, além disso, nenhuma formação blastocistica foi observada.
22
CONCLUSION
In summary, DHA has negative effects on the regulation of meiotic maturation in porcine oocytes. The effect of 40 μM DHA is related to the cytoskeleton disruption, elevated ROS and calcium, and early apoptosis. 
23
Dessa forma os autores concluíram, que ....
23
Thank you!
24
Com esse slide finalizo minha apresentação e me disponibilizo para possíveis críticas ou questionamentos, obrigada.
24
MATERIALS AND METHODS
Parthenogenetic activation
Mimics sperm fertilization through eletric estimulation;
38,5 °C; 5% CO2
48h and 7 days
Porcine zygote medium-3 (PZM-3) 
5 μg/ml cytochalasin B 
 10 μg/ml cycloheximide
Oocyte in MII;
Cleavage and blastocyst.
25
Para avaliação de clivagem e de blastocisto, após a maturação, foi feita a ativação paternogênica dos oócitos em M2 em que mimetiza a fecundação por espermatozoide na câmara de fusão a 60V por 80 microsegundos. Então transferidos para PZM-3 suplementado, seguido de lavagem e cultura dos oócitos ativados.
25
Control
40 μM
MATERIALS AND METHODS
Annexin – V test
Identify early apoptotic cells;
 Binds to phospholipids and has a high affinity for phosphatidylserine in the presence of calcium ions
26
Para identificar as células em apoptose foi utilizado a proteína Anexina-5-FITC e posteriormente feita mensuração dos emissão de fluorescência.
26
MARCAÇÃO DE CÉLULAS APOPTÓTICAS POR ANEXINA V. 
Dosagem de fosfatidilserina (PS). 
Detecta o início da apoptose, antes da perda da integridade da membrana.
É encontrada na superfície interna da bicamada lipídica mas no início da apoptose, essa substancia é translocada para a superfície exterior da bicamada. Anexina V é uma proteína que se liga a fosfolipídeos e possui alta afinidade por PS na presença íons de cálcio. 
Conjugado a Anexina V, o FITC (Isotiocianato de fluoresceína) torna possível identificar e quantificar as células apoptóticas em citometria de fluxo. 
27
Indicadores de cálcio 
Marcados são moléculas que exibem um aumento na fluorescência ao se ligar ao Ca2 +. Fluo-3 tem sido usado para obter imagens da dinâmica espacial da sinalização de Ca2 +, em experimentos de citometria de fluxo envolvendo fotoativação de queladores engaiolados, segundos mensageiros e neurotransmissores e para triagem farmacológica baseada em células. Fluo-4 é um análogo de fluo-3 com os dois substituintes cloro substituídos por flúores, o que resulta em excitação de fluorescência aumentada em 488 nm e, conseqüentemente, níveis de sinal de fluorescência mais altos. As células podem ser carregadas com as formas de éster AM desses indicadores de cálcio, adicionando o indicador dissolvido diretamente a placas contendo células em cultura. Esses indicadores são úteis para microscopia de fluorescência e confocal, citometria de fluxo e aplicações de triagem de microplaca.
28
29
Importância do cálcio
O cálcio é uma molécula sinalizadora intracelular que controla diversas funções celulares, mas a [Ca2 +] livre intracelular anormal pode se tornar tóxica e causar a morte celular. 
As mitocôndrias são importantes protetores que têm a capacidade de regular a concentração de [Ca2 +] e prevenir a sobrecarga de [Ca2 +]
Mitocôndrias desempenham um papel central no metabolismo de células eucarióticas, contribuindo para a produção de energia, metabolismo intermediário e para os mecanismos de morte celular (ativando genes responsáveis). Produtora, principal de EROS.
29
30
A entrada de cálcio media a liberação de peptidases da vesícula acrossomal que digerem a mucosa permitindo a reação acrossomica ( espermatozoide se liga a zona pelúcida) com a fusão e vesiculação da membrana plasmática com a membrana acrossomal.
Importância do cálcio na maturação do oócitos
a entrada de cálcio media a liberação de peptidases da vesícula acrossomal que digerem a mucosa permitindo a reação acrossomica ( espermatozoide se liga a zona pelúcida) com a fusão e vesiculação da membrana plasmática com a membrana acrossomal, 
30
31
32
33