exercíco doenças infecciosas_BIOMOL APLICADA

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Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG 
EXERCÍCIO DOENÇAS INFECCIOSAS - BIOMOL APLICADA 
ALUNA: Nathália Greco Coelho MARÍCULA: 2018087988 
1) Com relação à utilização das técnicas de biologia molecular para o diagnóstico de 
doenças infecciosas, indique se as afirmativas abaixo são verdadeiras ou falsas. 
Justifique suas repostas. 
a) RNA viral pode ser quantificado através de RT-PCR seguido por Real time PCR. 
Verdadeiro, uma vez que pode ser realizada a RT-PCR para identificar a presença 
de RNA viral e, em seguida, realizar a Real Time PCR de modo a quantificar essa carga 
viral presente. 
b) Na Nested-PCR é utilizado um par de primers internos, e posteriormente, um par 
de primers externos, em duas corridas sucessivas de PCR. 
Falso, pois na primeira corrida de PCR é usado um par de primers externos e 
posteriormente, na segunda, um par de primers internos, ou seja, o contrário do que foi 
dito. 
c) Na captura híbrida, sondas específicas se hibridizam com o DNA desnaturado do 
microrganismo e estes híbridos são capturados por anticorpos imobilizados. 
Verdadeiro pois, na técnica de captura híbrida há primeiramente a desnaturação 
do DNA, seguido da hibridização na qual sondas específicas se hibridizam ao material 
desnaturado rapidamente. Posteriormente, ocorre a captura e híbridos, etapa em que 
os híbridos específicos em suspensão são imobilizados por tubos recobertos de 
anticorpos. Depois, ocorre a reação híbrido-conjugado, em que enzimas destroem as 
sondas não reagentes, o que reduz a chance de ligações inespecíficas, de modo que os 
híbridos imobilizados reagem com o conjugado composto por anticorpo específico + 
fosfatase alcalina. Finalmente, há a detecção dos híbridos, por quimioluminescência. 
d) Através da técnica de captura híbrida é possível detectar os diferentes tipos de HPV. 
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Verdadeiro, uma vez que, é possível se detectar 2 grupos de HPV por meio de 
sondas específicas, são eles os tipos não oncogênicos, com sondas como 6 e 11, e os 
tipos oncogênicos, como 16 e 18. 
 
e) A técnica de b-DNA (branched DNA) possibilita a quantificação do DNA ou RNA viral 
sem amplificação prévia do genoma. 
Verdadeiro, uma vez que na técnica de b-DNA (branched DNA) não são 
necessários amplificadores de sinais, extensores de captura, de modo que o sinal 
amplificado é diretamente proporcional ao número de alvos presentes na amostra. 
 
 
2) Quais cuidados devem ser considerados em relação à biossegurança para coleta e 
processamento de amostras de doenças infecciosas transmitidas por inalação de 
aerossóis. Cite exemplos. 
Com relação à biossegurança para coleta e processamento de amostras de 
doenças infecciosas transmitidas por inalação de aerossóis é extremamente 
necessário que os profissionais estejam devidamente paramentados com os 
equipamentos de EPI, sendo eles toucas, óculos de proteção, jaleco, luvas e sobretudo 
máscaras e face shield. Além disso, são utilizadas Cabines de Segurança Biológica, as 
quais constituem o principal meio de contensão, usadas como barreiras primárias 
contra a fuga de aerossóis para o ambiente. Há três tipos de cabines de segurança 
biológica: Classe I, Classe II – A, B1, B2, B3 e Classe III. As amostras coletadas devem 
conter informações sobre o grau de perigo de contaminação, de modo que serão 
distribuídas a laboratórios de diferentes níveis de biossegurança, sendo as doenças 
infecciosas transmitidas por inalação de aerossóis direcionadas para os de níveis 3 e 
4. Nos laboratórios de nível de biossegurança 3, a equipe possui treinamento 
específico para lidar com agentes potencialmente letais, e é dada grande ênfase às 
barreiras primárias e secundárias de contenção, além de fornecerem um ambiente 
controlado com exigências de ventilação, como um sistema de filtração de ar 
particulado de alta eficiência (HEPA). Já os laboratórios de nível de biossegurança 4, 
são aqueles em que as condições são mais sofisticadas e adequadas para se trabalhar 
com agentes mais perigosos, exóticos e que envolvem maior risco de infecções 
transmitidas por aerossol e doenças com risco de morte por não existir vacina nem 
terapia disponíveis para tratamento. Esses laboratórios estão geralmente localizados 
em um prédio separado, com ventilação e sistemas de gerenciamento de lixo 
especializados e a equipe utiliza uma roupa de pressão positiva com um sistema de 
suporte de vida. São exemplos de agentes patológicos destinados para os laboratórios 
de Nível de biossegurança 3 (BSL-3): Chlamydia psittaci (cepas aviárias), Clostridium 
botulinum, Coxiella burnetii, etc. São exemplos de agentes patológicos destinados 
para os laboratórios de Nível de biossegurança 4 (BSL-4): Filovirus, incluindo vírus 
Marburg, Ebola e outros vírus relacionados, vírus SARS-CoV-2, etc. 
 
 
3) Discuta os seguintes aspectos do diagnóstico molecular de doenças de caráter 
infeccioso: 
a) Uso de genes naturalmente amplificados. Cite exemplos 
Os genes naturalmente amplificados são utilizados com o intuito de avaliar a 
sensibilidade do método, e apresentam mais cópias além das que já estão presentes 
no genoma. Os mais utilizados são genes para RNAr, que são naturalmente 
amplificados nos seres vivos, e que, portanto, exigem cautela no momento da escolha 
da região alvo, de modo que não seja uma região comum entre organismos diferentes. 
Tem-se também genes plasmidiais, bem como genes referentes a antígenos (que 
podem estar relacionados a patogenicidade) e genes housekeeping (essenciais para a 
funcionalidade mínima das células). 
b) Estrutura em mosaico dos genes ribossomais 
Os genes ribossomais possuem uma estrutura composta por regiões conservadas 
de espécies filogeneticamente distantes e regiões variáveis de indivíduos 
filogeneticamente relacionados, organizados de modo que células de diversos 
organismos contenham grupos de genes essenciais e grupos de genes específicos, 
expressos conforme a necessidade de cada organismo durante a evolução. 
c) Aspectos relacionados à amostragem adequada e representativa durante a 
coleta do sítio de infecção para diagnóstico. Use o diagnóstico do HPV e de SARS-
COV2, como exemplo 
 
Com relação a coleta de amostras para exames diagnósticos, é necessário 
conhecer os tecidos ou líquidos biológicos nos quais a chance de se encontrar alta 
quantidade de genoma do microorganismo é elevada. Além disso, para que possíveis 
contaminações e interferentes de diagnóstico sejam evitados, é preciso que técnicas 
seguras de esterilização sejam aplicadas no processo de coleta. A contaminação por 
HPV por exemplo, é mais incidente em células com grande taxa de replicação, sendo 
elas epiteliais escamosas que revestem a superfície da pele e das mucosas e, portanto, 
esse vírus é mais facilmente encontrado em tecidos constituídos por essas células, 
como boca, ânus, colo uterino, pênis e outros. Desse modo, a fim de se obter com 
mais facilidade, o genoma viral do HPV, é aconselhável a coleta de amostra desses 
tecidos específicos. Já para o SARS-CoV-2, aconselha-se a coleta de amostras de tecido 
epitelial do trato respiratório superior, uma vez que esse vírus possui um tropismo 
por células dos órgãos do trato respiratório e, portanto, essa corresponde à região 
com a maior quantidade de genoma viral presente. 
d) Uso de métodos qualitativos e quantitativos na infecção pelo HIV 
Em se tratando da infecção por HIV, testes de imunoensaios, como por exemplo 
ELISA indireto e imunocromatografia (de testes rápidos), são métodos qualitativos 
que podem ser utilizados para o diagnóstico, e detectam anticorpos ou antígenos do 
vírus. Contudo, por detectarem os anticorpos, o diagnóstico no início da infecção é 
prejudicado, uma vez que nesse período a produção de anticorpos ainda não é 
significativa. Diante disso, nessa fase pode ser usado, por exemplo, o método de PCR, 
que detecta a presença degenoma viral. Com relação aos métodos quantitativos, a 
qPCR, por exemplo, pode fornecer valores numéricos de quantidade de material 
genético de vírus presente no organismo, correspondente a carga viral que poderá ser 
usada no acompanhamento da progressão da doença, bem como da resposta do 
indivíduo à terapia de tratamento. 
e) Em que situações a diferenciação de linhagens virais pode ser importante? Use 
o exemplo da infecção e tratamento da hepatite C, a emergência das linhagens 
de SARS-COV2 durante a pandemia e o diagnóstico das infecções por Chlamydia 
trachomatis. 
A diferenciação de linhagens virais pode ser importante em situações nas quais 
alguns vírus, pertencentes a um mesmo grupo, podem gerar patogenias de níveis 
diferentes de gravidade, em locais distintos, ou ainda não ocasionar nenhuma 
consequência ao organismo. A diferenciação se torna necessária, portanto, na 
determinação do diagnóstico e do prognóstico dos pacientes, em alguns desses casos. 
Na hepatite C, por exemplo, tem-se diferentes respostas aos 6 genótipos distintos já 
identificados do agente patológico, o vírus HCV, que direcionam o tratamento e o 
prognóstico da doença a diferentes rumos. Pacientes infectados com o genótipo do tipo 
1 do vírus em questão, reagem ao tratamento de maneira menos eficaz e portadores do 
genótipo 3, por exemplo, possuem maior chance de desenvolvimento de patologias 
secundárias como cirrose, câncer de fígado e diabetes. Em se tratando de Covid-19, a 
emergência das novas linhagens de SARS-COV2, indicam exatamente o surgimento de 
novas cepas virais, que correspondem a novas variantes advindas de mutações do vírus, 
que o torna mais resistente, aumentando sua patogenicidade e poder de infecção. Com 
relação à infecção por Chlamydia, a diferenciação de linhagens é importante e 
necessária uma vez que, os diversos organismos pertencentes a este gênero são 
responsáveis por diagnósticos variados e de quadros clínicos diferentes. A infecção pela 
Chlamydia trachomatis, por exemplo, pode ocasionar quadros de uretrite, cervicite, 
doença inflamatória pélvica, infertilidade e câncer (quando associado ao HPV), ao passo 
que a Chlamydia pneumoniae causa pneumonia, bronquite e faringite, quadros 
completamente diferentes entre si. 
f) Quais métodos podem ser usados para essa diferenciação? 
Através da genotipagem é possível obter essa diferenciação. Ela utiliza métodos 
moleculares, baseados em PCR, como a Nested-PCR e PCR em tempo real, e técnicas 
imunológicas. Durante o processo de genotipagem por PCR, após ser feita a extração do 
RNA viral, é realizada a transcrição reversa e a ampliação das regiões de interesse, e 
posteriormente eletroforese e eletroquimioluminescência, sendo finalizado em alguns 
casos com quantificação.