Lista 5 Exercícios e atividades

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QBQ 1453- Bioquímica Experimental
Atividade 5
Determinação da atividade enzimática
Objetivo
Detectar a presença da enzima alfa-glicosidase no lisado de
Saccharomyces cerevisiae através da determinação da sua atividade
enzimática
Nathalia Barbara 9009447
Vivian de Lima Viana 3163147
A alfa-glicosidase é uma enzima que catalisa a reação de hidrólise de ligações
glicosídicas a(1à4). Dessa forma, esta enzima quebra sacarídeos contendo glicose
formando monômeros de glicose com configuração alfa. Com o objetivo de detectar a
atividade da enzima no lisado de Saccharomyces cerevisiae vamos utilizar um substrato
análogo também hidrolizado pela enzima, o p-nitrofenil glicosídeo:
A hidrólise de cada molécula de p-nitrofenil-glicosideo forma uma molécula de glicose e
outra de p-nitrofenol.
Procedimento A – Construção da curva-padrão para a dosagem do produto
da reação catalisada pela alfa-glicosidase
Em pH alcalino, o p-nitrofenol (pKa = 7,15) ioniza-se formando p-nitrofenolato, que
absorve luz a 420 nm e pode ser detectado por espectrofotometria:
Portanto, para medir a concentração do produto da reação nos ensaios enzimáticos vamos
construir uma curva padrão de p-nitrofenolato:
1. Adicionar em cada tubo as alíquotas indicadas da solução estoque de
p- nitrofenol 2 mM e de água estipulados na Tabela 1
2. Adicionar o tampão carbonato-bicarbonato, pH 11,0
3. Homogeneizar em vórtice
4. Ler as absorbâncias das amostras a 420 nm na leitora de placas. Fazer
três leituras (triplicata), calcular a média, e completar a Tabela 2
5. Pipetar com precisão alíquotas de 200 ml do branco e das amostras nos
pocinhos da placa em triplicata. Anotar a absorbância do branco e descontar da
absorbância observada nas amostras
MM: 139,11g/mol
1nmol = 10-9 mols
x= 5x10-3/10-9 =5x106
Tubos p-nitrofenol
2M (mL)
p-nitrofenol
2M(L)
Água (mL) Tampão
bicarbonato(p
H 11)
branco 0 0 200 2,0
1 5 0,005 195 2,0
2 10 0,01 190 2,0
3 20 0,02 180 2,0
4 30 0,03 170 2,0
5 50 0,05 150 2,0
6 75 0,075 125 2,0
7 100 0,1 100 2,0
8 125 0,125 75 2,0
9 150 0,15 50 2,0
10 175 0,175 25 2,0
11 200 0,2 0 2,0
Tabela 2
Tubos mols de
p-nitrofenolat
ox10-3(nmol)
A420 1 A420 2 A420 3 A420(média) A420média
-Branco
Branco 0 0.131 0.130 0.133 0,131333 0
1 5x 103 0.180 0.191 0.193 0,188 0,056667
2 10x 103 0.248 0.231 0.262 0,247 0,115667
3 20x 103 0.372 0.356 0.366 0,364667 0,233333
4 30x 103 0.471 0.418 0.472 0,453667 0,322333
5 50x 103 0.664 0.655 0.648 0,655667 0,524333
6 75x 103 0.957 0.828 1.090 0,958333 0,827
7 100x 103 1.355 1.291 1.293 1,313 1,181667
8 125x 103 1.469 1.733 1.568 1,59 1,458667
9 150x 103 1.752 2.111 1.839 1,900667 1,769333
10 175x 103 2.047 2.107 1.997 2,050333 1,919
11 200x 103 2.198 3.045 2.846 2,696333 2,565
Curva padrão, excluindo os valores de absorbância acima de 1
Procedimento B – Medida da atividade da alfa-glicosidase presente no lisado
de Saccharomyces cerevisae
Reagentes Materiais Aparelhagem
Água
destilada
Banho
de gelo
Banho a 30oC
Lisado de
leveduras
Cubetas
para leitura
Vórtice
p-Nitrofenil-a-glicosídeo
(NPaGlc) 4 mM em
tampão fosfato 100 mM
pH 7,0 Tampão
carbonato- bicarbonato
250 mM pH 11,0
Pipetadores Leitora de placas
Pipetas
Suporte para tubos de ensaio
Tubos de ensaio
1) Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisae
Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação de
lisado de Saccharomyces cerevisae
Observação: Manter os tubos de ensaio sempre no gelo. Descongelar e
homogeneizar bem o lisado antes de transferir o volume sugerido.
1. Transferir 0,2 ml do lisado de Saccharomyces cerevisae para um tubo identificado
como L10X
2. Adicionar 1,8 ml de água destilada gelada
3. Homogeneizar vigorosamente
4. Transferir 0,4 ml de L10X para um novo tubo identificado como L50X
5. Adicionar 1,6 ml de água destilada gelada
6. Homogeneizar vigorosamente
7. Transferir 0,2 ml de L50X para um novo tubo identificado como L500X
8. Adicionar 1,8 ml de água destilada gelada
9. Homogeneizar vigorosamente
10. Manter todos os tubos no gelo
2) Determinação da atividade da a-glicosidase
Obs.: Conservar os tubos de ensaio sempre no banho de gelo
Este procedimento deve ser realizado para cada uma das diferentes diluições do
lisado que foram preparadas. Todos os ensaios podem ser monitorados
simultaneamente, iniciando o procedimento sempre pela adição do substrato (p-
nitrofenil-a-glicosideo = NpaGlc). Somente quando todos os tubos já tiverem
recebido o substrato é que deverá ser iniciada a adição das diferentes diluições do
lisado.
1. Preparar os tubos de ensaio em banho de gelo
2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPaGlc estipulados nas Tabelas 3 e 4
3. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diluído
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 30 ˚C
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempo indicados na Tabela 3
6. Ao remover cada tubo, interromper a reação enzimática adicionando 2 ml de tampão
carbonato-bicarbonato pH 11,0
7. Agitar manualmente
8. Deixar os tubos à temperatura ambiente
9. Uma vez que todos os tubos tenham sido retirados, ler as absorbâncias a 420 nm.
Realizar a leitura da absorbância em leitora de placas. Pipetar com precisão 200 ml do
branco e das amostras nos pocinhos da placa. Anotar a absorbância do branco e
descontar da absorbância observada nas amostras
10.Completar a Tabela 5
Tabela 3
Tubos NP Glcα
4mM(mL)
Lisado Tempo de
incubação a 30o
(min)
1 0,2 0,2 5
2 0,2 0,2 10
3 0,2 0,2 15
4 0,2 0,2 20
branco da
enzima
-------------- 0,2 20
Tabela 4
Tubos NP Glcα
4mM(mL)
Água (mL) Tempo de
incubação a
30oC (min)
A420
Branco 0,2 0,2 20
Obs.: Basta preparar este tubo uma vez, mesmo quando se trabalha com diferentes
diluições do lisado
Tabela 5
Tubos L10x L50x L500x
A420 A420 A420
1
2
3
4
Branco de enzima
Branco de
substrato
Análise de dados
Dados obtidos:
A) Curva padrão de p-nitrofenolato
Dados obtidos:
Tubos mols de
p-nitrofenol
ato 10-3
A420 1 A420 1 A420 3 A420média A420média
-Branco
Branco 0.131 0.130 0.133 0,131333 0,056667
1 0.180 0.191 0.193 0,188 0,115667
2 0.248 0.231 0.262 0,247 0,233333
3 0.372 0.356 0.366 0,364667 0,322333
4 0.471 0.418 0.472 0,453667 0,524333
5 0.664 0.655 0.648 0,655667 0,827
6 0.957 0.828 1.090 0,958333 1,181667
7 1.355 1.291 1.293 1,313 1,458667
8 1.469 1.733 1.568 1,59 1,769333
9 1.752 2.111 1.839 1,900667 1,919
10 2.047 2.107 1.997 2,050333 2,565
11 2.198 3.045 2.846 2,696333 0,056667
Complete a tabela acima, e faça um ajuste para uma equação de reta que descreve o
comportamento de A420 em função do número de mols de p-nitrofenolato.
y = 1E-05x + 0,0044
R² = 0,9981
Equação da reta utilizada, excluindo os valores de absorbância maiores que 1.
B) Medida de atividade enzimática
Complete as Tabelas 4 e 5, e com auxílio da curva padrão obtida no ítem anterior, calcule
a atividade enzimática da alfa-glicosidase presente no lisado em unidades de
mmol/min (U), e a concentração de atividade (U/l).
Branco 0,55
Tubos Tempo
(min)
L 10X
Branco de
enzima
A420
(1)
A420
(2)
A420
média
p-nitrofenolato
(nmol)
1 5 0.633 0.632
0,6325 7,81
2 10 1.072 1.063
1,0675 51,31
3 15 1.386 1.399
1,3925 83,81
4 20 1.814 1.802
1,8080 125,36
y = 0,00001x + 0,0044
R² = 0,9981
Lista 5 – Exercícios e atividades
1) Assista ao vídeo sobre a experiência de medida da atividade enzimática da alfa-
glicosidase presente no lisado de Saccharomyces cerevisae (Prática 5). Examine o
protocolo da Prática 5 e os resultados obtidos no experimento do vídeo. Utilize
esses resultados para responder às questões A e B colocadas na seção de
“análise de dados” do protocolo da Prática 5.
Resposta acima .
2) Por que as amostras são mantidas no gelo enquanto são preparadas?
Seguindo o comportamento das reações químicas, a velocidade da atividade enzimática
aumenta quando se aumenta a temperatura. Portanto se mantém no gelo as amostras para
a atividade enzimática não iniciar.
3) A adição de tampão carbonato-bicarbonato é suficiente para interrompero
progresso da reação? Por quê?
Em pH alcalino, o p-nitrofenol (pKa = 7,15) ioniza-se formando p-nitrofenolato, que
absorve luz a 420 nm e pode ser detectado por espectrofotometria
A adição tampão carbonato-bicarbonato aumenta rapidamente o pH da , inibindo a
enzima, e ao mesmo tempo ioniza o para-nitrofenol ,formando o para-nitrofenolato,
que absorve no comprimento de onda de 420 nm , obtendo uma coloração
amarelada .
4) Como é preparada a amostra para ser utilizada como branco das
medidas de absorbância do produto da reação a 420 nm? Por quê?
O branco possui o lisado e não possui o substrato NPaGlc, no lugar se
acrescenta 0,2 mL de água como controle e depois é adicionado tampão
carbonato-bicarbonato ph 11 ,
5) A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes lnhagens.
Em todas as amostras usou 1g de células e obteve 10 mL de lisado. Esses
lisados foram utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil
a-glicosídeo (pNPaglc) como substrato. Foram obtidos os resultados que se
seguem:
Linhage
m
Diluiçã
o
Vol.
de
lisado
diluíd
o
(ml
)
Vol.
de
águ
a
(ml)
Vol. de
pNPaG
lc (ml)
A4
20
15
min
30
min
45
min
60
min
1 100
x
100 100 200 0.050 0.100 0.150 0.200
2
50
x
20 180 200
0.080 0.160 0.240
0.320
Com auxílio da curva padrão de para-nitrofenolato obtida em aula, calcule a
concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de
levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células.
Curva Padrão y = 0,00001x + 0,0044
Linhagem 15min 30 min 45 min 60 min
1 0,6 nmol 5,6nmol 10,6nmol 15,6nmol
2
0.080 0.160 0.240
0.320
tempo médio
A atividade da enzima é medida através da detecção do p-nitrofenolato que é liberado do
substrato quando a enzima o cliva da glicose. Então, quanto mais p-nitrofenolato
liberado/tempo, maior a atividade da enzima.
A cada minuto a atividade da linhagem 1 aumenta p-nitrofenolato 0,33nmol/min .
Para chegar a esse valor foi utilizado 100 ml do lisado
0,33 nmol --- 100mL
x---- 1000mL
=3,3 n mol /L
Esse valor teve diluição prévia de 100x
Então 3,3x100 = 33 n mol/L
A cada minuto a atividade da linhagem 2 aumenta p-nitrofenolato 0,53nmolmin.
Para chegar a esse valor foi utilizado 20 ml do lisado
0,53 nmol --- 20mL
x---- 1000mL
=26,6 n mol /L
Esse valor teve diluição prévia de 50x
Então 26,6x50 = 1330 n mol/L
Para calcular a atividade/g de célula, temos que nos atentar que esses valores obtidos
estão por ml de lisado, e o exercício nos deu as amostras com 1g para cada 10 ml do
lisado. Logo, é só multiplicar os valores encontrados por 10.
Linhagem 1 330 n mol/L por grama
Linhagem 2 13300 n mol/L por grama