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QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Cine´tica enzima´tica Guilherme Menegon Arantes Instituto de Quı´mica Universidade de Sa˜o Paulo garantes@iq.usp.br http://gaznevada.iq.usp.br Universidade de Sa˜o Paulo QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Resumo da aula • Enzimas sa˜o catalisadores biolo´gicos • Equac¸a˜o de Michaelis-Mentem: – Derivac¸a˜o – Variac¸o˜es – Interpretac¸o˜es e medidas experimentais • Eficieˆncia e modulac¸a˜o da atividade enzima´tica • Tipos de inibic¸a˜o e suas respectivas equac¸o˜es Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Enzimas sa˜o catalisadores biolo´gicos • Condic¸o˜es para um organismo vivo: auto-reproduzir e catalisar reac¸o˜es eficiente e seletivamente • Proteı´nas (ou ribozimas). Contem co-fatores, metais, etc. • Classificadas segundo a reac¸a˜o catalisada: oxidoredutases, hidrolases, ligases, isomerases, ... • Acelerac¸o˜es enzima´ticas por fatores de 105 a 1020 • Forma-se complexo enzima-substrato (E·S, Michaelis) Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Equac¸a˜o de Michaelis-Mentem E + S k1 ⇀↽ k −1 E · S kcat −→ E + P KS = [E][S] [E · S] = k−1 k1 KM = k−1 + kcat k1 • Vamos deduzir a equac¸a˜o abaixo • Na maioria das enzimas k−1 ≫ kcat ⇔ KM ≃ KS • Como a velocidade inicial de formac¸a˜o do produto e´ V0 = kcat [E·S], a velocidade ma´xima e´ Vmax = kcat [ET], e [E]T = [E] + [E·S], temos: V0 = kcat[E]T[S] KM + [S] = Vmax[S] KM + [S] Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Interpretando e visualisando os termos • [S], V0, Vmax e KM podem ser medidos facilmente • Invertemos os dois lados→ Eq. Lineweaver-Burk: 1 V0 = KM Vmax[S] + 1 Vmax Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Eficieˆncia e modulac¸a˜o da atividade enzima´tica • Proteı´nas fosfatases (PTP) e oritidina decarboxilase sa˜o ainda mais eficientes, com acelerac¸o˜es de ∼ 1020! • Enzimas sa˜o reguladas por modificac¸o˜es covalentes reversı´veis, principalmente fosforilac¸a˜o em Ser, Thr e Tyr • Pequenas mole´culas efetoras (comportamento aloste´rico) e inibidores tambe´m modulam atividade Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Inibidores competitivos • Vmax → Vmax e KM → αKM (K app M ) 1 V0 = αKM Vmax[S] + 1 Vmax Ki = KM [I ] KappM −KM = KM [I ] KM (α− 1) Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Inibidores na˜o-competitivos • Vmax → Vmax/α ′(V appmax) e KM → KM/α ′ 1 V0 = KM Vmax[S] + α′ Vmax Ki = V appmax[I ] Vmax = 1 α − 1 Vmax Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 6 de Novembro de 2013 Inibidores mistos • Vmax → Vmax/α ′ e KM → αKM/α′ 1 V0 = αKM Vmax[S] + α′ Vmax Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica [P] tempo [P] tempo V = ∆[P]/∆t Qual v usar? inclinação = ∆y/∆x v = k [E] [S] Assim, se [S] ~ constante (igual à inicial), a velocidade é diretamente proporcional a concentração de enzima [P] tempo Se menos de 5% for consumido, podemos assumir v ~ constante. (v inicial). Medida de velocidade inicial Construir uma curva de [P] x tempo e verificar se é linear. [P] tempo [P] tempo vários tempos x 1 único tempo [P] tempo - “esgotamento” do substrato - inativação da enzima v = k [E] [S] Porque conhecer Ks? -comparar enzimas de diferentes fontes (tecidos, organismos, fase do ciclo de vida, etc...). -comparar diferentes substratos de uma mesma enzima (relação com afinidade) Porque conhecer Vmax? Para uma mesma preparação enzimática é possível comparar a velocidade de catálise para diferentes tipos de substrato (Vmax k3). Porque conhecer Vmax/Ks? Eficiência de catálise de diferentes substratos Caracterização da alfa-glicosidase: Km e Vmax Objetivos Caracterizar a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae através das determinações da afinidade (Km) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol-α-glicosídeo) e da velocidade máxima (Vmax) de hidrólise do substrato. Procedimento A – Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO UTILIZE A DILUIÇÃO USADA NA PRÁTICA 3. SOMENTE CASO NÃO SEJA POSSÍVEL, EMPREGUE O PROCEDIMENTO ABAIXO. NOTE QUE O VOLUME TOTAL NECESSÁRIO SERÁ DE 5,0 mL. Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluição da preparação do lisado de Saccharomyces cerevisiae. 1. Transferir 0,1 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L10X. 2. Adicionar 0,9 mL de água destilada gelada. 3. Homogeneizar SUAVEMENTE. 4. Transferir 0,5 mL de L10X para um novo tubo identificado com L100X. 5. Adicionar 4,5 mL de água destilada gelada. Homogeneizar SUAVEMENTE. Procedimento B – Medidas de velocidade da reação de hidrólise do substrato OBSERVAÇÃO: MANTER TUBOS DE ENSAIO EM BANHO DE GELO 1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPαGlc estipulados na Tabela 1. ATENÇÃO: prestar atenção nas diferentes concentrações de substrato. 2. Preparar os tubos em banho de gelo 3. Adicionar em cada tubo os volume de tampão e lisado (devidamente diluído) estipulados na Tabela 1. Agitar manualmente com cuidado. 4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC 5. Incubar todos os tubos por 40 min (OU PELO DOBRO DO MAIOR TEMPO USADO NA PRÁTICA 3). 6. Remover todos os tubos do banho. 7. Adicionar 2 mL de tampão carbonato-bicarbonato. 8. Deixar os tubos em temperatura ambiente. 9. Homogeneizar em vórtice. 10. Usar a água para calibrar (zerar) o espectrofotômetro. 11. Ler as absorbâncias a 420 nm. 12. Completar a Tabela 2. 13. Construir os gráficos necessários para a determinação do Km e Vmax da α-glicosidase para o substrato utilizado. Tabela 1 tubos NPαGlc 1,0 mM (mL) NPαGlc 2,0 mM (mL) NPαGlc 8,0 mM (mL) tampão fosfato 100 mM pH 7 (mL) lisado diluído (mL) 1 0,02 - - 0,28 0,10 2 0,04 - - 0,26 0,10 3 0,08 - - 0,22 0,10 4 0,12 - - 0,18 0,10 5 0,16 - - 0,14 0,10 6 0,20 - - 0,10 0,10 7 - 0,16 - 0,14 0,10 8 - 0,20 - 0,10 0,10 9 - - 0,10 0,20 0,10 10 - - 0,13 0,17 0,10 11 - - 0,15 0,15 0,10 Tabela 2 tubos [S] (no tubo de ensaio) (mM) A420 nmols de produto Tempo da reação (min) Velocidade (nmol/min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
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