Técnicas Genética Forense Perito Criminal_ Técnicas Aplicadas a Genética Forense

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Técnicas Aplicadas a 
Genética Forense
Alípio dos Santos Rocha
Bioforense Projetos Educacionais 
Técnicas:
• Extração de DNA;
• Quantificação;
• Amplificação;
• Hibridização;
• Eletroforese.
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
O que é necessário?
1. DNA molde.
2. Oligonucleotídeos específicos ou
iniciadores (primers).
3. Enzima Taq polimerase e tampão.
4. Desoxinucleotídeos (dNTPs) e Mg2+.
• Técnica utilizada para multiplicar milhões de vezes regiões específicas do
DNA;
• Marco na biologia molecular e fundamental para a genética forense:
• Permite o uso de amostras com muito pouca quantidade de DNA;
• Possibilita a análise simultânea de múltiplos marcadores moleculares,
aumentando o poder de análise e reduzindo a quantidade de amostra
necessária.
Etapas básicas:
(A) Desnaturação (separação das
fitas).
(B) Anelamento (ligação
complementar dos iniciadores ou
primers).
(C) Polimerização (síntese da fita nova
de DNA).
A
B
C
Número de cópias: 2nº de ciclos+1
Vídeo PCR
Características dos primers:
• Complementares somente às regiões alvo;
• Entre 15 e 30 nts;
• Conteúdo de G+C entre 40 a 60%, com distribuição homogênea, para aumentar
a estabilidade da ligação à região alvo;
• Presença de um ou dois resíduos de GC na extremidade 3` para aumentar a
estabilidade da extremidade de polimerização;
• Não possuir sequências autocomplementares e invertidas – evitar a formação de
dímeros de primer;
• Temperaturas de anelamento próximas para cada primer e entre 52 e 65 oC.
• As sequências dos primers são dadas sempre no sentido 5` => 3`. Atenção ao
primer complementar à fita senso do DNA.
Hot Start impede a amplificação inespecífica
PCR Multiplex:
• Utilização de primers para dois ou mais alvos
numa mesma reação;
• Necessário que todos os Primers tenham
temperaturas de anelamento próximas;
• Geralmente conta com uma estratégia de
marcação para diferenciar os produtos de cada
primer;
Alvo 1 Alvo 2 Alvo 3 Alvo 4
Multiplex na Genética Forense:
• Mais de 23 marcadores amplificados na mesma reação;
• Sensibilidade de menos de 1 ng de DNA;
• Possibilidade de análise de misturas e amostras
degradadas;
• Diferentes corantes fluorescentes utilizados para
distinguir alelos com comprimentos sobrepostos.
• PCR em Tempo Real (qPCR):
• Técnica que permite a detecção de produtos durante a progressão
de reações de amplificação de DNA.
Na eletroforese em gel os produtos são
observados após o término da ciclagem,
quando ocorre a saturação da reação de
PCR.
Quantificação do DNA
Princípio da qPCR
• Threshold: sinal basal de fluorescência emitido pelas amostras.
• CT: ciclo da PCR correspondente ao limiar de detecção de fluorescência.
Opções de Químicas para Amplificação Real-Time
Corantes intercalantes de dsDNA
Brometo de Etídio (1ª Geração)
SYBR Green (2ª Geração)
EvaGreen (3ª Geração)
Primer
LUX
AmpliFluor Uniprimer
Hidrólise
TaqMan (5' nuclease assay)
TaqMan MGB
MGB Quantiprobe/Eclipse
Adjacent probes/ HybProbes
Molecular beacons
Scorpions
Hibridização
Probes
Mais usados
• Corantes Intercalantes de dsDNA:
• Moléculas que se ligam especificamente a DNA fita dupla;
• O primeiro utilizado foi o brometo de etídio. Devido a seu potencial
carcinogênico agora é muito pouco utilizado.
• SYBR® Green é excitado a 497 nm e emite a 520 nm.
→Detecção de todas moléculas dupla fita DNA
→Detecção de produtos de PCR específicos e não-específicos
dsDNA + corante livre 
(fluoróforo fraco)
Ligado a dupla fita
(fluorescencia 1.000x)
Sybr Green
• Incorporado logo após a formação da
dupla fita;
• A fluorescência é computada ao final da
etapa de extensão.
• Menos custoso e de simples manuseio;
• Corante brilhante — resultados melhores que
EtBr;
• Amplamente usado;
• Permite análise de dissociação (melt) +
eletroforese em gel usada para confirmar os
resultados.
Análise de Dissociação
• Permite verificar a especificidade da amplificação, através da análise da
variação de fluorescência emitida durante a dissociação do DNA. Essa análise
se dá acompanhando a fluorescência durante acréscimos de 0,1 a 1 oC.
Amplificação específica =>
apenas um fragmento
multiplicado
Amplificação inespecífica
=> dois fragmentos
multiplicados
SYBR™ Green I é tóxico para a PCR,
assim utilizado em baixas concentrações.
SYBR® Green I
Some dye can relocate
as melting begins
Nova tecnologia de corante para HRM
LC Green™ I
Dye saturation leaves no room for 
relocation events during melting
Corantes saturantes
• Ligam-se a todos os sítios
possíveis do DNA;
• Aumentam a sensibilidade da
técnica.
Tamanho do alvo: 100–150 bp
3` 5`
Sem fluorescência
R Q
R Q
95°C 95°C
60°C
95°C 95°C
60°C
• Sondas de hidrólise:
• Utiliza um oligonucleotídeo complementar ao
amplicon, ligado a um fluoróforo e um ou dois
inibidores (quencher).
95°C 95°C
60°C
Taq Pol
3` 5`
R Q
R Q
R
Q
Aumento da 
fluorescência
Taq Pol
3` 5`
95°C 95°C
60°C
Princípio: atividade exonuclease 5` => 3` 
(Sondas de Hidrólise/ Sondas TaqMan)
1. 2.
3. 4.
Aplicação Forense
Kits comerciais que utilizam sondas de hibridização com alvos diversos:
1- Sequências do DNA autossômico conservadas entre indivíduos. Uma
sequência curta (< 100pb) e uma longa ( em torno de 200 pb) dão
estimativa do nível de degradação da amostra pela relação [curta]/[longa].
2- Sequência presente no cromossomo Y conservada.
3- Sequência de um fragmento de DNA contido no reagente de preparo
(controle interno). Útil para observar a presença de inibidores de PCR nas
amostras.
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Métodos de Quantificação em qPCR
• Comparação de expressão gênica diferencial em diferentes amostras :
Quantificação
Quantificação Relativa Quantificação Absoluta
Cópias de mRNA alvos relativos a um
RNA interno, ex. GAPDH ou rRNA
Cópias de mRNA alvos relativos a um
padrão externo e por numero de cópias
ou unidade de massa
Quantificação Relativa
• Feita a partir da comparação do nível de sinal obtido do gene alvo em relação
ao de um gene de expressão constante, dito como endógeno, referência ou
padrão.
• A emissão do gene padrão tem a finalidade de normalizar variações
experimentais entre as amostras.
• A quantificação se dá através de várias formas. A mais usadas é a análise do
ΔΔCt.
10 15
mais cDNA
threshold
EC
(housekeeper)
CT=5
re
la
ti
ve
 
fl
u
o
re
sc
en
ce
Nº ciclo
GOI
(gene of interest)
25 30
menos cDNA
threshold
CT=5
EC
GOI
Gene de 
Referência
Gene Alvo
• Necessário preparar duas curvas padrão no início do experimento para mostras que as
eficiências das amplificações dos genes alvo e de referência não variam mais que 0,1.
• Uma amostra não tratada será usada como padrão para comparar as variações entre as
amostras tratadas.
1. Calcular o valor do Ct do gene alvo (GA) e do gene de referência (GR).
2. Calcular a diferença de Cts entre o gene alvo e o endógeno : Ct = Ct GA - Ct GR.
3. Calcular a diferença entre Ct da amostra e o Ct do padrão:
Ct=Ct amostra-Ct padrão
4. Normalizar a expressão do gene alvo = 2-Ct
Amostras Ct GA Ct GR DCT DDCT 2
-DDCT
Padrão
22.8 32 -9.2 0 1
Amostra 1
18 31 -13 -3.8 13.93
A confiabilidade da análise da quantificação relativa depende fortemente da
estabilidade do Gene Referência.
Quantificação Absoluta
• Determina número de cópias absoluto de uma amostra;
• Valor de CT de amostras desconhecidas comparadas a curva padrão de padrões
conhecidos ;
• Importante: Eficiência de Amplificação dos padrões e dos alvos são equivalentes.
Conc. inicial da amostra desconhecida
Log quantidade de padrão
Kubista et al, Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 95–125
Análise de corridas de real-time PCR 
Quantificação Absoluta com uma curva padrão
Ciclo
Fluorescência Exemplo com 4 padrões
de concentrações conhecidas
27
Ciclo
Fluorescência Cálculo de limiar de ciclagem
(cycle thresholds)
Ct1 Ct2 Ct3 Ct4
Análise de corridas de real-time PCR 
Quantificação Absoluta com uma curva padrão
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Ciclo
Concentração
original
(log-scale)Ct1 Ct2 Ct3 Ct4
Linha de 
regressão
y = a + bx
Análise de corridas de real-time PCR 
Quantificação Absoluta com uma curva padrão
• Linha de regressão de acordo com y = a + bx
• a: Intercepção com o eixo y;
• b: constante: coeficiente de regressão, slope;
• y : variável dependente;
• x : variável independente.
• Considerações para a montagem da curva padrão:
• DNA deve ser de uma única espécie e puro;
• Pipetagem precisa;
• Estabilidade de padrões de diluição.
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Análise de corridas de real-time PCR 
Quantificação Absoluta com uma curva padrão
• Considerações para a montagem da curva padrão:
• Gerada usando diluições seriadas de 5 ou mais concentrações;
• Cada reação é tipicamente realizada em triplicatas e 10 vezes diluídas
(esperado uma diferença de Ct de 3,32 entre cada diluição - log210; 100;
etc…);
• A quantidade de alvo desconhecido deve estar dentro do alcance da curva,
nunca extrapolar a curva.
Análise de corridas de real-time PCR 
Quantificação Absoluta com uma curva padrão
A precisão do ensaio de quantificação absoluta depende completamente da
precisão dos padrões
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Ciclo
Concentração
original
(log-scale)
Ct1 Ct2 Ct3 Ct4
Amostra desconhecida
Análise de corridas de real-time PCR 
Quantificação Absoluta com uma curva padrão
32
Ciclo
Concentração
original
(log-scale)
Ct1 Ct2 Ct3 Ct4
Amostra desconhecida
Análise de corridas de real-time PCR 
Quantificação Absoluta com uma curva padrão
Hibridização
• Princípio utilizados em várias técnicas;
• Consiste em utilizar um fragmento de
DNA/RNA complementar a o alvo de
interesse como uma sonda marcada;
• A marcação se dá de diferentes maneiras:
• Fluoróforo.
• Substrato para uma reação indicadora.
• Anticorpo.
• Muito importante nas primeiras técnicas
de VNTRs.
Micro Arranjo
• Técnica baseada em hibridização
que permite analisar diferenças
entre os elementos do DNA/RNA
entre dois indivíduos ou grupos
distintos;
• As regiões de interesse são fixadas
em micro poços de uma placa.
Ambos os grupos são incubados
com a placa para permitir as
hibridizações específicas;
• Os resultados são captados e
analisados por computador;
• Existem estratégias para identificar
alelos de STRs em
desenvolvimento.
• Inibido
• Não regulado
• Estimulado
Sequenciamento
• Técnicas que permitem determinar a ordem dos
nucleotídeos de fragmentos de DNA;
• Na genética forense é utilizada na análise do DNA
mitocondrial;
• Duas gerações:
• Sequenciamento de Sanger
• Sequenciamento de nova geração
Ion Torrent
Illumina
Sequenciamento de Sanger:
• Utiliza reações de PCR com um primer (senso ou anti-senso) e
didesoxinucleotídeos para provocar paradas na reação de polimerização;
• Os fragmentos são analisados
em ordem de tamanho,
possibilitando montar a
ordem dos nucleotídeos
incorporados;
• As primeiras versões usavam
gel de poliacrilamida para a
separação. Atualmente usa-se
eletroforese capilar e ddNTPs
marcados diferencialmente
para determinar a sequência.
Duas versões da Técnica de Sanger
Gel de Poliacrilamida Automatizado com Eletroforese Capilar
Eletroforese de DNA
• Técnica de análise de ácidos nucleicos baseada na migração diferencial através de
um material poroso sob uma diferença de potencial elétrica (voltagem)
constante.
• Duas versões:
• Em placa
• Capilar
Gel de agarose
Gel de poliacrilamida
Componentes:
• Catodo: eletrodo de carga negativa;
• Anodo: eletrodo de carga positiva;
• Tampão de corrida: manutenção do pH e da estrutura linear das moléculas de DNA. O TAE
(Tris/Acetato/EDTA) é mais indicado para separação de moléculas grandes de DNA. Já o
TBE (Tris/Borato/EDTA) é mais indicado para análises rápidas de fragmentos menores de
DNA;
• Tampão de amostra: acrescido às amostras antes da aplicação no gel para conferir peso
(sacarose ou glicerol) e evitar a dissolução no tampão de corrida. Também contém
indicadores (azul de bromofenol e/ou xileno cianol), substâncias coloridas que indicam
o progresso da corrida eletroforética;
• Gel: matriz porosa responsável pela migração diferencial dos fragmentos de DNA em
razão de seus tamanhos. A formação da malha se dá através do processo de
gelificação. Duas constituições:
• Agarose: polissacarídeo extraído de algas. Manuseio mais simples. Usada para
separação de fragmentos maiores de DNA (> 100pb);
• Poliacrilamida: gel formado pela polimerização de acrilamida e bis-acrilamida,
catalisada por persulfato de amônio e β-mercaptoetanol. Forma poros menores,
indicada para separação de fragmentos menores de DNA (< 100pb).
Sistema de 
Eletroforese Vertical
• Utilizado para eletroforese
em gel de poliacrilamida.
• Montagem mais complexa
em relação ao sistema
horizontal.
• Ao final da corrida eletroforética, os resultados podem ser visualizados com o uso de
corantes intercalantes de DNA (brometo de etídio, SYBR Green, Gel Red), sais de prata
ou com marcação por sondas de hibridização.
Prata
Brometo
Northern Blot
Padrões de Tamanho:
• São conjuntos de fragmentos de DNA de
tamanho conhecidos aplicados em paralelo às
amostras;
• Indicam o tamanho dos fragmentos das
amostras por comparação de posição;
• Também podem ser utilizados para uma
estimativa da quantidade/concentração dos
fragmentos de DNA na amostra.
ABI Prism 3500
Eletroforese Capilar
• Resultados precisos (análise computacional);
• Utiliza kits padronizados e otimizados para a genética forense:
• Garantia da qualidade da análise;
• Permite a análise de perfis genéticos obtidos em qualquer laboratório;
• Preparo das amostras:
• Adição do produto de PCR (1 µL) e padrão interno de tamanho a formamida ultrapura (função
de manter os DNAs simples fita na conformação estendida).
• Desnaturação a 95 oC seguido de choque térmico com gelo ou a 4 oC para impedir a formação
de duplas fitas e estruturas secundárias.
Eletroforese Capilar
• Kits de PCR multiplex para STRs com primers
marcados com fluoróforos de diferentes cores.
Análise Dupla – Separação por Tamanho e Cor da Marcação
Determinação do Tamanho dos Amplicons:
• Comparação do tempo de passagem pelo laser entre os fragmentos amplificados e os
fragmentos de um padrão interno adicionado na amostra;
• O padrão interno possui moléculas de DNA de tamanho conhecido marcadas com
fluoróforo diferente dos usados nos primers na PCR multiplex;
Determinação dos Alelos:
• Necessário um outro padrão de comparação, a escada alélica (ladder):
• Fornecida junto ao kit de PCR multiplex;
• Composta por todos os alelos de todos os marcadores STRs do kit, marcados com
os mesmos fluoróforos;
• Necessária em toda corrida eletroforética. Requer mesmo preparo das amostras.
• Para cada local STR é feita a comparação da posição dos fragmentos da amostra com os
alelos conhecidos da ladder.
Escada Alélica
Eletroferograma
Picos Stutter:
• Subprodutos da amplificação de STRs com uma ou mais unidades de
repetição a mais ou a menos que o alelo amplificado corretamente;
• Surgem quando a polimerase adiciona erros, causados pela estrutura
repetitiva dos STRs.
Alça formada no amplicon => 
stutter +1
Alça formada no DNA 
molde=> stutter -1
• Deve-se atentar para não confundir o stutter com um alelo real. Trabalhos de 
validação dos kits e equipamentos de eletroforese capilar são necessários.
Drop Out:
• Perda de um alelo no heterozigoto. Pode ser causado por:
1. Pouca quantidade de DNA na PCR gerando uma amplificação
preferencial;
2. Mutação no sítio de anelamento de primer, impedindo a amplificação do alelo.
Caso haja suspeita, usa-se outro kit de PCR com primers diferentes para o local em
questão;
3. Muitos STRs tem sítios de ligação de primers polimórficos. Para contornar o
problema são adicionados primers com sequências para cada polimórfico ou usa-
se primers para outras regiões, conservadas.
Mutação
Onde Estudar:
• Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology,
John M. Butler - 2012.
alipiobqi@yahoo.com.br