Seminário de FRIA II (Parte escrita)

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Tema: Sêmen Sexado | Grupo 4 
 
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Parte escrita 
Tema: Sêmen Sexado 
Alunos: Alejandro Vignini Martins, Isabela Pinheiro Borges, Júlia Mazzetto de Melo Silva Lindemberg Paes Reis 
 
 
1) Histórico da sexagem espermática 
A seleção do sexo é uma das tecnologias mais mencionadas na história, esse interesse existe há muitos anos. 
Demócrates: acreditava que o testículo direito produzia machos e o esquerdo fêmeas e, portanto, acreditava-se que a 
orquiectomia apenas do testículo esquerdo resultaria apenas em nascimentos de homens 
Aristóteles: recomendava uma determinada dieta que a mulher deveria ter e a posição sexual para ter filhos homens 
Hipócrates: acreditava que a qualidade do sêmen determinava o sexo da criança; conceito de que o sêmen “forte” 
originava homens e o “fraco” mulheres 
Primeira metade do século XX: marcada por grandes progressos na biologia, especialmente genética; foram 
identificadas microscopicamente os cromossomos sexuais X e Y em 1910, entretanto apenas em 1970 a existência desses 
cromossomos sexuais em humanos foi confirmada ao se empregar o corante quinacrina 
Acreditava-se que a determinação do sexo dependia somente do cromossomo X, sendo a classificação do macho X0 
e da fêmea XX. 
1914: Bridges descobriu que o sexo masculino era determinado pela associação do cromossomo X com outro 
morfologicamente distinto, denominando-o de Y 
Mamíferos: machos são o sexo heterogamético (possui dois cromossomos sexuais diferentes e é representado por duas 
letras distintas XY) e fêmeas são o sexo homogamético (possui dois cromossomos sexuais iguais, representados por XX) 
Aves e cobras: fêmeas são ZW e os machos ZZ 
Insetos não possuem sexo heterogamético: machos são X0 e fêmeas XX 
Alguns répteis, anfíbios e peixes não possuem cromossomos sexuais definidos, além de algumas espécies que necessitam 
da influência ambiental (como temperatura na incubação dos ovos) para que o sexo dos filhotes seja definido 
Antes da década de 80: métodos eram precários e sem precisão. 
1977: haviam tentativas de desenvolver amostras com sexo pré-determinado a fim de evitar que crianças nascessem 
com doenças associadas ao cromossomo X. No mesmo foi relatada a sexagem espermática utilizando um gradiente 
de Ficoll por sedimentação e foi encontrado índice de separação do cromossomo Y de até 70% 
1981: primeiro simpósio sobre aspectos básicos e relevantes da biologia espermática 
1982: desenvolvimento do citômetro de fluxo proporcionou a precisão das características cromossômicas incluindo seu 
tamanho, peso, densidade, velocidade de movimento, cargas elétricas e proteínas de superfície, efeitos diferenciais de 
pH e diferentes efeitos da pressão atmosférica. 
 
1983: a citometria de fluxo era uma abordagem precisa e capaz de determinar a diferença do conteúdo de DNA entre 
X e Y dos espermatozoides de bovinos, ovinos, suínos e coelhos 
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1987: processo de coloração foi alterado e introduzido um corante que atravessa a membrana plasmática integra, 
mantendo a viabilidade dos espermatozoides 
1989: primeiro nascimento de uma prole de sexo pré-determinado em coelhos 
2001: a tecnologia foi adaptada para a produção comercial de sêmen bovino 
 
2) Aplicações da sexagem espermática, aspectos positivos e negativos 
Atualmente o Brasil é referência em técnicas laboratoriais desenvolvidas em reprodução e melhoramento genético. 
A pré-seleção do sexo da progênie, mediante manipulação dos espermatozoides ou dos embriões, tem sido alvo de 
muitos estudos graças ao seu progresso e posterior aplicabilidade 
A sexagem espermática beneficia o manejo e a eficiência reprodutiva e maximiza o progresso genético entre gerações 
A técnica vem sendo utilizada na criação de bovinos, mas em cães os relatos são escassos (em casos de espécies 
multíparas, a sexagem poderia favorecer o mercado) 
Tem importância na reprodução humana assistida 
Importante em animais ameaçados de extinção sendo de grande valia na conservação de espécies silvestres 
IA em elefantes e rinocerontes impulsiona o desenvolvimento da sexagem espermática já que esses animais se 
reproduzem lentamente e o nascimento de mais fêmeas é favorável por diminuir a agressão entres machos além de 
manter uma população mais sustentável 
A proporção natural esperada de machos e fêmeas em uma progênie é de 1:1, a qual pode ser alterada por fatores 
fisiológicos e ambientais, mas ainda não há confirmação 
A técnica permite: 
 Produzir uma proporção ideal de machos e fêmeas 
 Obter descendentes de animais superiores elevando em 15% o ganho genético 
A sexagem espermática em bovinos tem impulsionado os programas de melhoramento genético e as biotécnica 
reprodutivas como a IA e a PIV 
Em cães: realizada com sucesso pela citometria de fluxo reportando o enriquecimento de 88% a 93% de X e 86% a 93% 
de Y, mas a concentração espermática recuperada foi baixa, inviabilizando a IA nessa espécie. Também foi realizada 
por centrifugação em gradiente de densidade de Percoll® e promoveu o enriquecimento do cromossomo X, mas com 
valores abaixo do esperado não foi possível sua aplicação comercial 
Para que a IA seja viável em cães são necessários estudos para desenvolver uma técnica que promova a seleção de 
células espermáticas contendo os cromossomos X ou Y de forma eficiente que mantenha a qualidade e fertilidade dos 
espermatozoides 
 
3) Diferenças entre os espermatozoides com o cromossomo X e o Y 
Deve ser baseada em pelo menos uma diferença entre essas células 
As que realmente são utilizadas referem-se ao conteúdo de DNA e a consequente diferença na densidade 
3.1) Sensibilidade ao pH 
Primeira metade do século XX: acreditava-se que os espermatozoides portadores do cromossomo Y sobreviviam com 
maior facilidade em fluido seminal com pH mais básico, enquanto que o meio ácido da vagina favorecia os portadores 
do cromossomo X 
Em coelhos foi demonstrado que a proporção entre machos e fêmeas pode ser influenciada de acordo com o pH da 
vagina no momento do acasalamento. Nascem mais fêmeas quando o pH se encontra entre 6,5 e 7,5 e mais machos 
quando o pH está entre 7,5 e 8,3 
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3.2) Carga elétrica da superfície da membrana 
A diferença na carga elétrica da superfície da membrana dos espermatozoides pode permitir a sexagem espermática 
Separação por eletroforese em coelhos → espermatozoides possuem carga elétrica negativa, possível separar as células 
portadoras do cromossomo X e as portadoras do Y de acordo com a migração para o anodo ou catodo, 
respectivamente 
 
3.3) Velocidade de migração 
Os espermatozoides podem ser separados de acordo com a sua capacidade migratória pela técnica de Swim-up (as 
células são incubadas no fundo de um tubo com meio de cultivo a 39°C por um período determinado, os 
espermatozoides com motilidade progressiva retilínea vão para a superfície do tudo e compõem o sobrenadante que 
é extraído. Em bovinos a proporção de nascimentos foi de 58,45% de machos e 41,55% de fêmeas 
 
3.4) Antígenos de superfície 
Baseia-se na determinação de antígenos sexo específicos encontrados na membrana espermática 
O antígeno H-Y é especifico do cromossomo Y 
Os epitopos H-Y são pequenos peptídeos de 8 a 11 aminoácidos e permitem a sexagem dos espermatozoides em larga 
escala 
Técnica: baseada na ligação de proteínas de superfície a anticorpos específicos anti-espermatozoide Y que culminam 
na aglutinação das células, promovendo a sexagem 
Recentemente uma proteína 3kDa foi identificada como sexo especifica e novos estudos estão sendo realizados para 
determinar outras macromoléculas associadas aos espermatozoides portadores do cromossomo X ou Y 
 
3.5) Diferença no conteúdo de DNA espermático 
Somente as técnicas que se baseiam na diferença do conteúdo de DNA entre os espermatozoides são comprovadas 
cientificamente in vitro e in vivo 
Espermatozoides: célulashaploides e contém cromossomos 
autossômicos e cromossomos sexuais X ou Y que determinam 
o sexo 
Em bovinos a sexagem espermática é baseada na 
quantidade de DNA contida no cromossomo X 
Essa diferença pode ser racial e varia entre as espécies 
Podem ser utilizadas duas técnicas, citometria de fluxo e a 
centrifugação em gradiente de densidade 
 
4) Técnicas de sexagem espermática 
Citometria de fluxo é a técnica de separação espermática que apresenta resultados mais confiáveis e precisos 
A centrifugação em gradiente de densidade não possui repetibilidade e reprodutibilidade para ser aplicada 
comercialmente, mas é uma técnica mais simples e não requer grandes investimentos em equipamentos 
 
 
 
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4.1) Citometria de fluxo 
Um dos principais avanços na biotecnologia da reprodução 
Desenvolvido na década de 80 e a sexagem utilizando a técnica foi descrita em 1989 
Único método de sexagem validado até o momento, somente em bovinos possui desenvolvimento suficiente para sua 
aplicação comercial 
Essencial para permitir a detecção da diferença de conteúdo de DNA entre os espermatozoides 
Inicialmente a sexagem pela citometria de fluxo promovia a morte das células, uma vez que para que o núcleo fosse 
corado com DAPI era necessária a remoção da cauda e da membrana celular 
Corante DAPI foi substituído pelo Hoechst 33342 
Hoechst 33342: corante que atravessa a membrana plasmática integra, mantendo a viabilidade dos espermatozoides. 
É um corante supravital que permite a separação de células não coradas, mortas, levando a um aumento da qualidade 
da amostra. Entretanto a exposição do corante associado à luz do laser ao qual a célula espermática é exposta pode 
aumentar a incidência de aberrações cromossômicas 
O espermatozoide X tem maior conteúdo de DNA que o Y e também recebe mais corante em seu DNA 
A quantidade exata de DNA é obtida ao se analisar a fluorescência emitida pelas células quando expostas a uma onda 
especifica de luz emitida pelo laser 
Os espermatozoides são separados em três grupos: 
 Portadores do cromossomo X 
 Portadores do cromossomo Y 
 Mortos ou não sexados 
Somente os espermatozoides desejados são separados 
A grande variação que existe no conteúdo de DNA 
entre espécies e raças aumenta o grau de dificuldade 
na separação em cada indivíduo 
O formato da cabeça do espermatozoide pode 
interferir na análise: cabeças ovais (de bovinos e ovinos) 
são mais facilmente orientadas nesse processo do que 
cabeças arredondadas (de humanos e equinos) 
Desvantagens da técnica → todos esses fatores podem 
lesar e/ou matar a célula 
 Prejuízos causados às células pelo corante e laser 
 Alta pressão 
 Velocidade 
 Diluições sequenciais 
 Capacitação prematura de espermatozoides destinados a congelação 
 Baixa concentração espermática após a separação (cães) 
 Redução da motilidade 
O descarte de células mortas e de baixa viabilidade aumenta a qualidade do sêmen sexado, mas m contrapartida 
reduz a concentração de espermatozoides contidos na dose comercializada (2x106 células/palheta) de sêmen sexado 
bovino 
A capacitação prematura é uma vantagem para espermatozoides que serão utilizados imediatamente para a PIV 
sendo desnecessária a indução da capacitação espermática 
O ejaculado do cão possui baixa concentração espermática e a inseminação artificial com número restrito de células 
não é viável, como nos bovinos 
Recomenda-se que a inseminação artificial intravaginal em cães seja realizada no mínimo com 50x106 espermatozoides 
e intrauterina entre 35 e 50x106 
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4.2) Centrifugação em gradiente de densidade 
Envolve um processo de centrifugação baseada na diferença de densidade entre os dois cromossomos 
Em bovinos a diferença é mínima e por isso a sexagem só é possível com a utilização de gradientes com alta resolução 
de densidade 
Podem ser de dois tipos: 
 Contínuos: a densidade do gradiente aumenta da parte superior até a 
inferior, não sendo observadas diferença entre as camadas 
 Descontinuo: as camadas são observadas e a mais densa fica na parte 
inferior do tubo, diminuindo gradativamente até a parte superior 
Pode ser realizada com diferentes concentrações em 2 a 12 camadas utilizando 
vários tipos de meios: 
 Albumina sérica: bovina (já foi utilizada em humanos para obter amostra 
enriquecida com espermatozoides portadores do cromossomo Y), humana – 
ASH (resultam em mais espermatozoides portadores do cromossomo X 
 
 Ficoll 
 Ficoll-metrizoato de sódio: mistura de polissacarídeos neutros hidrofílicos de alta densidade associado ao metrizoato 
de sódio 
 
 Percoll®: separa uma maior quantidade de espermatozoides com o cromossomo X. composto por sílica coloidal 
recoberta por PVP e amplamente utilizado para formação de gradiente, separação de células, vírus e outras 
partículas, pode contaminar e afetar a qualidade da coloração com quinacrina, o Ficoll pode ser utilizado como 
meio de lavagem para retirada dos resíduos do Percoll® 
 
 Associação de Percoll® com OptiPrep®: componente iodinatado não iônico estéril e não tóxico desenvolvido para 
estudos radiográficos. Possibilita a separação de organelas subcelulares pois é mais denso 
 Associação de Percoll® com IxaPrep 
 Associação de Percoll® com Nycoprep® 
 
5) Métodos de confirmação da sexagem espermática 
Avaliação da porcentagem de espermatozoides X e Y em uma amostra e confirmação do enriquecimento de uma 
dessas células por uma determinada técnica de sexagem espermática 
 
5.1) Citometria de fluxo 
Teste de pureza que avalia se o material envasado realmente contém o sexo desejado 
Segue o mesmo princípio utilizado para sexagem 
Os espermatozoides passam pelo citômetro de fluxo por uma fila 
única, em alta velocidade e pressão e recebem o laser. Os que 
contém o cromossomo X emitem um sinal de fluorescência maior 
do que os que possuem o Y 
 
 
 
 
 
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5.2) Hibridização in situ por fluorescência (FISH) 
Método que identifica os cromossomos em qualquer tipo celular de acordo com a sonda utilizada 
Capaz de separar os espermatozoides contendo 
os cromossomos X e Y de acordo com a 
intensidade de fluorescência que emitem ou a cor 
quando a sonda utilizada é dupla, identificando 
sequências gênicas pelo princípio da 
complementaridade de nucleotídeos do DNA e 
RNA a partir de sondas de DNA 
A marcação é visualizada como pontos 
fluorescentes de cores diferentes 
Requer sondas moleculares de sequências 
completas de genes conhecidos ou fragmentos 
de DNA que procuram o gene específico na 
amostra 
Três tipos de sondas: 
 Sonda painting: determina translocações e deleções e se caracteriza por corar todo o cromossomo 
 Sondas alfa satélite: determinam aneuploidias e são compostas por DNA de repetida no centrômero do cromossomo 
 Sondas de sequência única: determinam microdeleções e marcam uma região especifica do cromossomo 
Utilizada principalmente em humanos e ruminantes 
Apresenta vantagens em relação ao PCR, pois como utiliza sondas especificas de DNA dos cromossomos os resultados 
são mais confiáveis, os espermatozoides são analisados individualmente e não em grupos e vários espermatozoides 
podem ser marcados de forma rápida e precisa 
É uma técnica muito trabalhosa e seu custo é aumentado quando são utilizadas colorações duplas ou até triplas 
 
5.3) Quinacrina mostarda 
Método que cora o corpúsculo F (corpúsculo fluorescente) do cromossomo Y, o qual se encontra na região distal de 
seu braço curto 
Pode produzir resultados falsos positivos e falsos negativos em células em interfase, levando a resultados enganosos e 
imprecisos 
O Percoll® é considerado um contaminante, interferindo no processo de coloração 
A influência de alguns métodos de coloração para realizar a sexagem podem resultar em coloração inespecífica doscromossomos autossômicos, não corando apenas o cromossomo Y conforme desejado 
 
 
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5.4) Reação em cadeia de polimerase (PCR) 
Permite a replicação do DNA in vitro e à amplificação de 
sequencias especificas com alta sensibilidade e 
especificidade 
A PCR convencional pode quantificar a relação de 
cromossomo X e Y em uma amostra de sêmen. É uma 
técnica insegura e instável por apresentar grande variação 
em diferentes lotes de sêmen não sexado de um mesmo 
reprodutor 
A PCR em tempo real ou quantitativa utiliza sondas 
fluorescentes possibilitando estudos qualitativos e 
quantitativos com alto grau de acurácia, repetibilidade e 
reprodutibilidade 
Vantagens: 
 Permite a utilização de uma pequena alíquota que é 
vantajoso principalmente nos cães que contam com 
um pequeno volume de ejaculado 
 Pode ser feita em grande escala 
 Não necessita de equipamentos de citometria de fluxo 
É necessária a extração do DNA para que a PCR seja 
eficiente 
A extração de DNA pode ser realizada de diversos 
métodos, mas ainda existem muitos problemas como contaminação com DNA estranho, inibidores da PCR e fragilidade 
do DNA 
Um método de extração eficiente, livre de inibidores e íntegro é imprescindível para que seja possível a utilização na 
PCR e em outras técnicas moleculares 
 
 
Referências 
MOTHÉ, Gabriele Barros. Sexagem de espermatozoides caninos em gradiente descontínuo de densidade: Avaliação in 
vitro. 2015. 92 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Biotecnologia Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia 
da Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2015.