Revisão Tabaco_

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
Programa de Pós-Graduação em Agronomia
Área de Concentração em Genética e Melhoramento de Plantas
Disciplina: Introdução ao Melhoramento Genético de Plantas 
Projeto de Pesquisa 
MARCADOR MOLECULAR RAMP LIGADOS À GENES DE RESISTÊNCIA À DOENÇA DA CANELA PRETA NA CULTURA DO TABACO
JABOTICABAL - SP
Junho de 2015
ÍNDICE
ÍNDICE	2
1.	INTRODUÇÃO	3
2.	OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS	4
2.1.	Objetivos Gerais	4
2.2.	Objetivos Específicos	4
3.	JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA PROPOSTA	5
4.	REVISÃO DE LITERATURA	6
4.1.	Gênero Nicotiana	6
4.2.	Os oomicetos e o gênero Phytophthora	7
4.3.	Produção e Aspectos Econômicos do Tabaco	8
4.4.	Melhoramento Genético	9
4.5.	Aplicações Biotecnológicas	11
5.	MATERIAL E MÉTODOS	12
5.1.	Material Vegetal	12
5.2.	Extração de DNA	12
5.3.	Gene pool construction and RAMP analysis	13
5.4.	Análises Southern blot	13
5.5.	Análises de Ligação	13
6.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	14
1. INTRODUÇÃO 
O expressivo crescimento do setor agropecuário brasileiro contribui para a geração de saldos importantes na economia brasileira, apresentando um grande desempenho nas exportações de produtos agropecuários e conquistando novos mercados em diferentes partes do mundo. Atualmente, o país é um dos principais exportadores de soja, açúcar, carnes de frango, suína e bovina, café, suco de laranja e fumo (EMBRAPA, 2008; IBGE, 2008).
Dentre todos os produtos agrícolas produzidos no Brasil, o fumo vem se destacando como um dos principais da pauta de exportações brasileiras. O Brasil é o maior exportador mundial de fumo e o segundo maior em produção, sendo uma importante fonte de renda para milhares de famílias agrícolas devido ao retorno financeiro superior a outras culturas (AFUBRA, 2008).
Assim, o desenvolvimento de técnicas de manejo e melhoramento genético para a cultura do tabaco é de grande interessante ao país, sendo constantemente estudada visando a melhoria da qualidade e produtividade das lavouras, a obtenção de resistência às principais doenças que atacam a cultura, como as viroses (TMV, PVY e TSWV), a murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum), os nematóides de galhas (Meloidogyne incognita e M. javanica), a tolerância ao amarelão (complexo de fungos de solo), e a obtenção de cultivares com baixos teores de alcalóides, especialmente as nitrosaminas (TSNA’s), cujas propriedades são cancerígenas (GAVILANO et al., 2006).
De forma a gerar variabilidade para os programas de melhoramento genético do tabaco, métodos convencionais e biotecnológicos são aplicados, incluindo cultura de tecidos e células, obtenção de somaclones, hibridação somática através da fusão de protoplastos e produção de haplóides e duplo-haplóides. Dessa maneira, é seleção assistida por marcadores é uma técnica frequentemente utilizada, pois evita longas etapas de identificação de características no campo, principalmente no caso das doenças de herança simples (SOUZA CRUZ, 2007).
Dentre as principais doenças que assolam a cultura do fumo está a Canela Preta (Tobacco Black Shank), causada pelo oomiceto Phytophthora nicotianae var. nicotianae, sendo capaz de devastar lavouras inteiras, gerando perdas que variam de 8 a 11% da produção mundial. Assim, vertentes biotecnológicas vêm sendo amplamente estudadas no intuito de combater a infestação deste patógeno e, consequentemente, diminuir as perdas produtivas e elevar a qualidade do produto. Deste modo, o presente trabalho objetiva a utilização de técnicas moleculares visando encontrar genes de resistência à Canela Preta e verificar sua adaptabilidade na produção de cultivares resistentes à doença de forma a reduzir seu impacto na cultura em todo o mundo. 
2. OBJETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS
2.1. Objetivos Gerais
Utilização de técnicas moleculares na identificação de genes de resistência à Phytophthora nicotianae var. nicotianae.
2.2. Objetivos Específicos 
Utilização do marcador molecular SNP na identificação de genes de resistência à Phytophthora nicotianae var. nicotianae.
Após identificação dos genes de resistência, prosseguir com programas de melhoramento de modo a aumentar a frequência destes genes nas cultivares de maior interesse comercial.
3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA PROPOSTA
O tabaco é uma das culturas mais cultivadas do mundo, sendo de grande importância para os países produtores, pois geram grandes contribuições para a economia destes países. 
Porém, doenças como a ocasionada pelo oomiceto Phytophthora nicotianae var. nicotianae, conhecida popularmente como Canela Preta (Tobacco Black Shank) gera todos os anos prejuízos aos fumicultores e empresas voltadas a produção de tabaco, visto que devasta até 10% da produção anual de tabaco em todo o mundo. 
Neste sentido, pesquisas buscando elucidar as formas de infestação e difusão deste patógeno pela cultura estão sempre em andamento, na tentativa de encontrar formas de resistência desta doença na cultura. Entre estas pesquisas, aquelas voltadas para biologia molecular vêm obtendo resultados satisfatórios, pois demonstram a expressão genética de resistência produzidos pela planta, o que possibilita a transferência destes genes a variedades de tabaco mais produtivas. 
Assim, a relevância deste projeto se justifica na importância econômica da cultura e de que maneira os métodos biotecnológicos utilizados atualmente vem auxiliando na elucidação e, se possível, erradicação desta doença na cultura do tabaco. 
4. REVISÃO DE LITERATURA
4.1. Gênero Nicotiana 
A espécie Nicotiana tabacum L. pertence à família das solanáceas e subdivide-se em três subgenêros: Rustica, Tabaccum e Petunioides, todos relacionados de acordo com a morfologia, capacidade de cruzamentos, número de cromossomos e comportamento dos híbridos interespecíficos (GOODSPEED, 1954 apud REN; TIMKO, 2001). É uma espécie tetraploide, anfidiplóide, com 2n = 4x = 48 cromossomos, resultante da hibridização de Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. 
É uma cultura anual, robusta de 2,5 m de altura, pouco ramificada, com folhas grandes e verdes e flores brancas, sendo todas as partes são pegajosas e coberta de pelos. Os caules apresentam-se eretos, robustos, cilíndricos e ramosos. As folhas são alternas, sésseis, ovais ou lanceoladas, pontiagudas, inteiras, pegajosas, com nervuras muito salientes na página inferior e de cor verde mais carregado na página superior, de cheiro fraco e sabor levemente picante, amargo e nauseoso. As flores são grandes, rosadas, munidas de brácteas dispostas numa espécie de panícula na extremidade dos ramos, tendo cálice tubuloso, esverdeado. Finalmente, o fruto forma uma cápsula ovóide, encerrando numerosíssimas sementes muito pequenas, rugosas, irregularmente arredondadas (BOIEIRO, 2008).
 Dentre as 64 espécies descritas deste gênero, acredita-se que 44 são nativas das Américas Norte e Sul, enquanto as 20 restantes provem da Austrália, sendo todas as espécies cultivadas entre as latitudes de 60ºN e 38ºS (AKEHURST, 1981). Apesar do número relativamente elevado de espécies, somente a Nicotiana tabacum L. tem interesse, pois sintetiza a nicotina, um alcalóide produzido nas raízes e transferido para as folhas, onde se que se acumula em concentrações entre 2 a 4%. Além dela, tem como principais componentes químicos a cotinina, miosmina, nicotirina, anabasina e nicotelina (FONSECA, 2011).
O tabaco é cultivado em uma grande amplitude de climas, entretanto, necessita de 90 a 120 dias sem geadas desde a fase de transplantio ao final da colheita para que alcance o desenvolvimento ótimo. Além disso, a cultura necessita de temperaturas entre 20 a 30º C, solos bem arejados e drenados, de forma que não ocorra encharcamento. (DOORENBOS; KASSAM, 1994 apud SCHMIDT, 2008).
Além da relevância econômica, é considerado um importante modelo para estudo na área de biotecnologia e, ainda, como auxiliar em estudos que envolvem princípios de resistência a doenças, síntese de metabólitos secundáriose fisiologia de plantas (BINDLER et al., 2007).
4.2. Os oomicetos e o gênero Phytophthora 
O reino Fungi é um grande grupo de organismos eucariotas separados os reinos das plantas, animais e bactérias, sendo seus membros são chamados de fungos, incluindo microrganismos como cogumelos, bolores e leveduras. Uma grande diferença é o fato de as células dos fungos terem paredes celulares que contém quitina, ao contrário das células vegetais, que contém celulose. Os organismos deste reino são distintos dos oomicetos e mixomicetos (agora classificados em Mixogastria), que são esuturalmente similares. 
Os oomicetos caracterizam-se por serem microrganismos morfologicamente semelhantes aos fungos, porém taxonomicamente, a espécie está relacionada ao reino Stramenopila, filo Oomycota, classe Oomycetes, ordem Pythiales, família Pythiaceae. Diferenciam-se dos fungos verdadeiros por apresentarem celulares na parede celular, micélio diploide em parte do ciclo vital, esporos biflagelados, sequências de DNA deferenciadas, dentre outras características. 
Acredita-se que cerca de 70% das principais doenças vegetais são ocasionadas por fungos, microrganismos produtores de esporos que rapidamente se propagam pelo vento, água, animais ou insetos. Estima-se que uma planta infestada por fungos produza até 100 milhões de esporos, causando infecções secundárias, na medida que se degradem as células vegetais e, simultaneamente produzem toxinas que interferem no funcionamento pleno da planta. Além disso, patógenos desse tipo são dificilmente eliminados, pois costumam se manterem dormentes no solo, restos de plantas em decomposição ou mesmo em plantas saudáveis no aguardo de condições edafoclimáticas favoráveis ao retorno desses microrganismos.
Em termos de resistência das plantas à patógenos, os vegetais somente ativam sua resposta de defesa após a infecção pelos microrganismos. Em casos em que as respostas de defesa da planta bloqueiam a proliferação dos patógenos, pode-se dizer que a interação planta-patógeno é incompatível. Assim, os genes presentes nos patógenos responsáveis pelo reconhecimento e ativação das respostas de defesa do hospedeiro, em casos de incompatibilidade, são chamados de genes de avirulência (BISOSGNIN et al., 2005). Essas interações geralmente associam-se com uma resposta hipersensível no hospedeiro e um alto grau de especificidade entre os genótipos do patógeno e hospedeiro. 
Entre os oomicetos de importância agrícola estão as espécies fitopatogênicas do gênero Phytophthora, estão associados a uma ampla gama de hospedeiros, sendo P. nicotianae a de maior abrangência (ERWIN & RIBEIRO, 1996). As plantas de maior importância para o Brasil são acácia-negra (Acacia mearnsii), fumo (Nicotiana tabacum), guaraná (Paulinia cupana), abacaxi (Ananas comosus), cebola (Allium cepa), abacate (Persea americana), algodão (Gossypium spp.), ornamentais da família Araceae, antúrio (Anthurium andreanum) e outros (LUZ & MATSUOKA, 2001; BEZERRA et al., 2001; SANTOS et al., 2005 apud OLIVEIRA 2008).
Em termos de importância agrícola, a Canela Preta ou Tobacco Black Shank, como é mundialmente conhecida e causada pelo oomiceto Phytophthora nicotianae var. nicotianae, é uma das doenças mais devastadora para a cultura do tabaco, visto que é capaz de destruir lavouras inteiras e gerar perdas de até 10% em alguns países produtores. Além disso, ano após ano, encontra-se ocorrência deste patógeno em regiões distintas, o que demanda cada vez mais atenção na obtenção de cultivares resistentes. 
Este oomiceto pode ser encontrado com frequência em solos de clima tropical e subtropical, sendo facilmente disseminado para áreas não infestadas por equipamentos ou através da água. Devido ao fato de que os esporos são móveis, a distribuição da doença dentro da mesma lavoura pode não ser uniforme. 
A ocorrência da doença se dá em plantas de qualquer idade, sendo que em mudas jovens, o colo da planta pode ser afetado e o sistema radicular pode se tornar parcial ou totalmente escuro e em plantas adultas, observa-se uma lesão escura na base da planta que pode estender até o caule da planta. As folhas podem murchar de forma repentina e uniforme, se tornando amareladas e murchas ainda no caule da planta, fato este que leva a doença ser conhecida como Amarelão.
A principal forma de controle para é o uso de cultivares resistentes, obtidos através de técnicas de melhoramento genético e biotecnologia, buscando encontrar genes responsáveis pela resistência e os transferir para cultivares mais produtivos. Além disso, a rotação de culturas e o controle de nematoides também são importantes tendo em vista que os nematoides predispõem o tabaco ao ataque do patógeno (PROFIGEN, 2015). 
4.3. Produção e Aspectos Econômicos do Tabaco
O tabaco constitui um dos produtos vegetais mais importantes da economia, sendo cultivado em 129 países em uma área de 4,3 milhões de hectares, com a produção de 7,5 milhões de toneladas e produtividade média de 1.744kg.ha1. A China caracteriza-se como o maior país fumicultor do mundo representando 43% da produção total ao produzir 3,2 milhões de toneladas em 2014. O país também destaca-se como maior consumidor deste produto, movimentando cerca de U$ 171 bilhões no mesmo ano. Ainda destaca-se como grandes países produtores de tabaco, a Índia, Brasil e Estados Unidos, com 12%, 11% e 5% de produção mundial, respectivamente (FAO, 2014). 
No Brasil, a fumicultura iniciou-se antes mesmo do descobrimento do país, cuja exploração tinha como objetivo principal o uso em rituais religiosos ou para mascar e sua produção se limitava para atender apenas algumas tribos indígenas. O cultivo com interesse comercial teve início nos séculos XVI e XVII e consolidou-se a partir de 1918, por ocasião da primeira grande indústria instalada no Brasil.
Hoje a produção brasileira no está em torno de 850 mil toneladas e ocupa a segunda posição entre os maiores produtores mundiais. Em termos de exportação, Brasil também é o maior exportador de fumo em folha desde 1993, cujo destino está em torno de 100 países, com maiores volumes para a União Europeia com 42%, Extremo Oriente 26%, América do Norte 13%, África 7%, Leste Europeu 7% e América Latina 5%. 
Esta liderança nas exportações se devem em boa parte à excelente qualidade do fumo brasileiro, a regularidade de produção, compatibilidade com os preços dos demais países produtores, custos de produção mais baixos, em especial se comparado aos Estados Unidos, que encontram dificuldade na contratação de mão-de-obra. Esses fatos tornam o fumo brasileiro mais competitivo, fazendo com que o país permaneça na liderança das exportações durantes os últimos 21 anos com faturamento geral do setor de R$ 24,9 bilhões de reais na safra 2014/15, contra R$ 22,8 bilhões do exercício anterior. 
Atualmente, o cultivo brasileiro se encontra nas regiões Nordeste e Sul do país, concentrando-se nesta última, representante de 96% da produção total de fumo do Brasil. Entre os maiores estados produtores destacam-se o Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, representando 50%, 30% e 20% da produção total brasileira, respectivamente. 
O perfil das propriedades apresenta uma área média de 16 hectares, dos quais uma pequena área é destinada para o cultivo de fumo. A área restante é destinada a atividades de subsistência, com destaque para a produção de milho e feijão ao término da safra de fumo lavouras anuais e permanentes, bem como para criações de animais, pastagens, açudes e, ainda, florestas (AFUBRA, 2008)
A relação entre produtores de fumo e as indústrias processadoras é baseada no chamado sistema integrado de produção onde as indústrias fornecem as sementes e assistência técnica e garantem a compra do fumo em folha produzido pelos fumicultores “integrados” (VARGAS, 2013). Os produtores se comprometem com os padrões de volume, qualidade e custo exigidos pelas empresas ao mesmo tempo garantem a exclusividade no fornecimento (FIGUEIREDO, 2008).
4.4. Melhoramento Genético
Diante das campanhas antitabagistas das últimas décadas,a indústria fumicultora foi motivada a promover altos investimentos em pesquisas, de modo a disponibilizar aos produtores, materiais geneticamente superiores de modo que os mesmos obtivessem produtos de melhor qualidade (OLIVEIRA, 2006). Neste sentido, pode-se dizer que o principal objetivo dos programas de melhoramento de tabaco é o desenvolvimento de cultivares que atendam às necessidades dos pequenos agricultores e também das empresas manufaturadoras.
Considerando a espécie do tabaco classificada como autógama, as principais variedades utilizadas nos programas de melhoramento genético são linhas puras. No entanto, quando se trata da produção de variedades cujo objetivo é a obtenção de resistência à pragas e doenças, ocorre o desenvolvimento de híbridos. 
Assim, os interesses daqueles que trabalham com a cultura são variados, visto que os fumicultores optam por cultivares resistentes a doenças, folhas de alto rendimento, fáceis de colher e curar, enquanto as grandes empresas focam em atributos mais específicos como a alta produção da lâmina e diminuição do talo, composição química e física equilibradas de modo que produzam o aroma e sabor desejados (LEEG & SMEETON, 1999). 
Dessa forma, diversos métodos de melhoramento genético podem ser utilizados para a cultura, sendo a seleção massal a responsável pelo desenvolvimento das principais cultivares utilizadas pela indústria fumageiras durante muitos anos (MATZINGER & WERNSMAN, 1979). 
Nas etapas de seleção, as populações segregantes são conduzidas em gerações seguidas de autofecundação, visto que a reprodução do fumo é por autogamia. Dentre os diferentes métodos de condução dessas populações, o mais usado é o Método da População (“Bulk”). Nesse caso, depois de realizar o cruzamento entre duas linhagens, são feitas gerações seguidas de autofecundação com colheita das sementes em bulk até a geração F4, quando é feito um plantio mais espaçado e colhidas as melhores plantas, dando início aos Testes de Progênies. Em casos em que a resistência for determinada por caracteres monogênicos, como ocorre com nematóides, a seleção pode ser feira logo nas primeiras gerações.
Além da seleção, pode também ser utilizados o Método Genealógico (“Pedigree”), a Seleção Recorrente e os Retrocruzamentos, sendo o último amplamente aplicado na transferência de macho-esterilidade e de grande interesse na obtenção de patentes por grandes empresas. 
Avaliando-se os Testes de Progênies, as linhas com melhor desempenho e que possuem os caracteres de interesse podem ser selecionadas. Tais genótipos são submetidos à Avaliação Preliminar, seguido das Avaliações Intermediárias em diversos locais. Por fim, obtêm-se experimentos críticos para Avaliação Final, a qual envolve a competição de cultivares, sendo o resultado desta etapa, a que irá selecionar os genótipos superiores e passíveis de serem liberados como cultivares comercias (SOUZA CRUZ, 2007). 
A partir desta etapa, prossegue-se para a difusão, a qual compreende o marketing em torno da cultivar obtida, o que inclui as macro parcelas, lavouras teste e demonstrativas, estas já realizadas em parceria com produtores. 
4.5. Aplicações Biotecnológicas
O mais recente estádio de desenvolvimento da tecnologia de melhoramento de plantas é a biotecnologia, pois atua ao nível genético das plantas de modo a selecionar com mais especificidade as características de interesse e evitar as não desejáveis. 
Os ganhos que se podem atingir pela biotecnologia de plantas têm reflexo sobre os agricultores, a indústria alimentar, os consumidores e, sobretudo, o meio ambiente. Por exemplo a produção de plantas recorrendo a menores gastos de energia, pesticidas, fertilizantes e água, ou a produção de plantas com níveis mais reduzidos de compostos alergénicos ou tóxicos, ou com melhores qualidades para armazenamento ou processamento, ou melhores qualidades nutricionais, são alguns dos numerosos exemplos de aplicações da biotecnologia vegetal.
Neste sentido, o tabaco tem sido utilizado amplamente como modelo para estudos envolvendo transformação gênica, visto que possuem grande informação genética, facilidade de transformação e rápida obtenção de gerações transformadas devido ao curto ciclo da cultura. Desta forma, genes de diferentes espécies podem ser avaliados inicialmente em tabaco, pela facilidade e rapidez na produção e análise das plantas transgênicas, como tem ocorrido com genes de cereais, produtos hortícolas, plantas ornamentais, medicinais, árvores frutíferas, pastagens, dentre outros (SOUZA, 2012).
A partir dessa premissa, muitas plantas transgênicas de tabaco vêm sendo induzidas a superexpressar diversos genes relacionados a estresses abióticos (KISHOR et al., 1995; BRANDALISE et al., 2003; CHEN et al., 2011; HUANG et al., 2011; WANG et al., 2011). Outros trabalhos com tabaco envolveram a superexpressão de genes que ajudam a manter níveis altos de ácido abscísico e pouca perda de água por transpiração (QIN & ZEEVAART, 2002), redução na transpiração e maior tolerância à seca (KANG et al., 2002), maior crescimento sob condições de estresses hídricos e de salinidade (KISHOR et al., 1995), assim como recobrar rapidamente a fotossíntese depois de suportar estresse hídrico severo (SHEVELEVA et al., 1997).
Considerando o aspecto farmacêutico e medicinal, pesquisas realizadas com grãos de soja e folha de tabaco indicam a presença de proteínas que podem ser utilizadas para criar antígenos contra o câncer, antiviral do HIV, hormônio do crescimento e o fator de coagulação IX visando tratamento de pessoas com hemofilia. Essas sementes estão atualmente em poder de indústrias farmacêuticas, que estão estudando a viabilidade de sua extração do grão e das folhas (INOVAÇÂO TECNOLÓGICA, 2014).
Devido ao grande potencial das plantas de tabaco na produção de fármacos, anticorpos produzidos em ratos devido à inoculação destes com o vírus ebola, encontra nesses vegetais a possibilidade de multiplicação desses anticorpos em grande escala ao utilizar as plantas de tabaco como biofábricas (EMBRAPA, 2015). 
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Material Vegetal
Plantas parentais de tabaco, Hubei 517 é altamente suscetível a P. parasitica , enquanto Yunyan 317 é altamente resistente (REI et al. , 1997). Serão utilizadas um total de 1012 plantas F2 das cultivares Hubei 517 e Yunyan 317 no experimento. 
5.2. Inoculação e Classificação
Avaliação das plantas F2 e suas respectivas respostas à inoculação por P. nicotiane var. nocotiane serão realizadas utilizando padrões pré-estabelecidos na literatura descritos como a técnica da planta pequena (LITTON et al., 1970a). A preparação da cultura de patógeno será descrita de acordo com a literatura. (LITTON et al., 1970a). Vinte e seis dias após a semeadura, as raízes de plantas serão inoculadas submergindo os tubos em uma suspenção de zoósporos ativos de P. parasitica var. nicotianae em um terço de solução de Hoagland's (LITTON et al., 1970a). As marcações serão realizadas entre 10 e 14 dias após a inoculação da raça 1 de P. parasítica var. nicotianae, considerando as plantas que estiverem mortas ou praticamente mortas. O sistema radicular será lavado com água livre de vermiculita e cada raiz individual será examinada. Plantas que sobreviverem e estiverem livres de sintomas serão classificadas como resistentes e aquelas que possuírem os sintomas serão classificadas como suscetíveis. A avaliação de suscetibilidade das plantas incluirá aquelas em que independentemente de estarem vivas ou mortas, apresentarem os sintomas nas raízes. 
5.2. Extração de DNA
Dez plantas F2 suscetíveis e resistentes serão submetidas à extração de DNA. O DNA foi extraído a partir de rebentos pelo método CTAB (ZHANG et al., 2006). As amostras foram trituradas em nitrogênio líquido, utilizando-se um almofariz e pilão. O pó foi transferido para um tubo estéril de 25 ml com 10 ml de tampão CTAB. O tampão de extração consiste em de 2% (w/v) CTAB ( brometo de cetiltrimetil amônio), 1,5M de NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 9.5, e 0.2% (v/v) mercaptoetanol. Apósa incubação do homogeneizado a 65 ° C durante 1 h num volume igual de clorofórmio foi adicionada e centrifugou-se a 10.000 rpm durante 20 min.
 O DNA será precipitado com 1/10 de volume (ml) de acetato de sódio 3 M e um volume igual de isopropanol seguido por centrifugação a 10.000 rpm durante 10 min . O sedimento de DNA será lavado com etanol a 70 % , secos ao ar e ressuspenso em tampões TE ( 10 mM de Tris pH 8,0 e EDTA 0,1 mM ) . A quantidade de de DNA será estimada espectrofotometricamente por medição da absorvância a 260 nm . As amostras de DNA serão diluídas em água deionizada estéril e mantidas a - 20 ° C .
5.3. Gene pool construction and RAMP analysis
A técnica no BSA será utilizada para pesquisar marcadores co-segregados com genes de resistência ao black shank (MICHELMORE et al., 1991). Amostras iguais de 10 plantas F2 resistentes e 10 suscetíveis serão misturadas formando um pool resistente e um pool suscetível, respectivamente. As amplificações serão realizadas utilizando-se 25 uL de misturas reativas contendo 2,5 uL tampão de PCR, 0,2 mmol/L de dNTPs, 2mmol/L de MgCl2, 1 U de Taq DNA polimerase, ((Shanghai Sangon Biological Engineering Technology and Services Co.) e 20 ng de DNA molde. A mistura de reação será incubada a 94 °C durante 120 segundos , seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 45 s , 37ºC durante 45 s , e 72 ° C durante 60 s . a PCR foi terminada após incubação a 72 ° C durante 6 min . Aos amplificados serão adicionados 2 uL de tampão de carregamento, (95% v/v formamida e 0,08% w/v de bromofenol em 20mM de EDTA, ph 8,0) serão eletroforisados em gel de agarose 1% contendo 0,5 ug de brometo de etídio e visualizados e fotografados pelo transiluminador Ultravioleta. 
5.4. Análises Southern blot 
Os fragmentos polimórficos GT (CA) 4/S89550 serão marcados com 32 P (ZHANG et al., 2007) e serão utilizadas como sondas para análise via Southern Blot. O DNA será transferido e hibridizado segundo procedimentos descritos na literatura (SAMBROOK et al., 1989). 
O DNA será digerido pela enzima de restrição BamH I, eletroforisado em agarose 0,8% e transferido para membranas de nylon. As sondas radioativas para hibridização serão feitas a partir de fragmentos de 0,55kb GT (CA) 4/S89550 com 32 P utilizando etiquetagem aleatória (FEINBERG AND VOGELSTEIN, 1983). O pré-hibridizados com sondas GT (CA) 4/S89550 overnight a 65°C. Estes serão lavados 3 vezes com tampão fosfato de sódio (pH 7,2) e 1% SDS a 65 oC por 5, 30 e 15 minutos e visualizados por autorradiografia. 
5.5. Análises de Ligação 
 A taxa de recombinação (cM) = recombinante / no de plantas individuais na geração F2 x 2) x 100, com dois estandes para genomas diploides (ZHANG et al., 2008).
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
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