A injecção de esclerostina melhora a movimentação dentária ortodôntica em ratos

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Artigo GEMP – 12.03.2021 
Beatriz Cavalcante e Ludmila Moura 
 A injecção de esclerostina melhora a movimentação dentária ortodôntica 
em ratos 
 
1. Introdução 
O movimento dentário ortodôntico (OTM) é um processo de acoplamento entre a reabsorção 
óssea e a formação óssea sob carga mecânica. Para além dos papéis-chave dos osteoclastos e 
osteoblastos, a função dos osteócitos também tem sido considerada importante na 
remodelação óssea durante a OTM. Por exemplo, verificou-se que os osteócitos sentem os 
estímulos de carga e regulam a diferenciação dos osteoclastos e osteoblastos durante a 
remodelação óssea. A ablação de osteócitos no osso alveolar em ratos transgênicos 
demonstrou diminuir significativamente a distância de OTM e o número de osteoclastos no 
local de compressão. A desregulação dos osteócitos na formação óssea foi atribuída à secreção 
de esclerostina. A esclerostina, o produto proteico do gene SOST, é quase exclusivamente 
expresso por osteócitos em osso maduro. Foi descoberto que a esclerostina pode suprimir a 
atividade e viabilidade dos osteoblastos através de uma sinalização antagônica Wnt/β-catenin, 
integrando LRP4, 5 e 6. A expressão SOST é conhecida por ser responsiva à tensão mecânica, 
com uma redução das transcrições de SOST e do nível de esclerostina sob uma carga 
aumentada, e um aumento da expressão de SOST e da secreção de esclerostina sob descarga. 
Isto também explica o fenómeno que reduziu o stress mecânico em astronautas e pacientes 
acamados causa perda óssea e desuso da osteoporose, e os ratos SOST knock-out parecem ser 
resistentes à perda óssea induzida pela descarga mecânica. 
O papel da esclerostina na formação óssea mediada por osteoblasto tem sido extensivamente 
estudado. A maioria dos estudos anteriores envolvendo esclerostina utilizaram modelos de 
animais adormecidos ou injeções in vivo de anticorpos de esclerostina (Scl-Ab) para estimular a 
regeneração óssea e suprimir a perda óssea. Por exemplo, o tratamento com Scl-Ab pode 
prevenir a perda óssea, criar maior altura da crista alveolar e maior densidade óssea alveolar 
em ratos com periodontite experimental. No entanto, apenas alguns estudos se concentraram 
na relação entre esclerostina e osteoclastos até à data. Um estudo utilizando o animal 
hospedeiro o modelo descobriu que havia menos fosfatase ácida resistente aos tartaratos 
(TRAP)- células positivas e menos osteoclastos em ratos SOST knock-out. 
Constatou-se que a interferência recombinante da esclerostina humana melhora o receptor 
ativador da expressão do fator nuclear kappa B ligand (RANKL) e a relação 
RANKL/osteoprotegerina (OPG) nas células semelhantes aos osteócitos MLP-Y4, bem como a 
capacidade induzível osteoclástica dos osteócitos. 
As células do ligamento periodontal sujeitas a uma força compressiva leve mostraram uma 
expressão aumentada de SOST/sclerostin, que é consistente com a expressão de citocinas 
induzíveis por osteoclasticidade. Especulou-se que a expressão aumentada de SOST/ 
esclerostina pode estar associada a hipoxia durante a OTM. Até à data, ainda não está claro se 
a injeção direta de esclerostina afeta a remodelação óssea durante a OTM, especialmente o 
processo de osteoclastogênese. O objetivo do estudo era investigar os efeitos in vivo da 
injeção local de proteína de esclerostina na OTM em ratos. A hipótese era que a injeção local 
in vivo da proteína de esclerostina poderia promover a osteoclastogênese e a OTM. 
2. materiais e métodos 
2.1 Animais Experimentais 
Foram utilizados 52 ratos Wistar machos de 6 semanas de idade (peso variando de 180-200 g) 
para os experimentos. Dois ratos morreram durante o período do experimento e outros dois 
não conseguiram completar o experimento por causa de dispositivos de aplicação de força 
com falha. Portanto, 48 ratos foram usados como amostras válidas. Os ratos foram alojados 
em gaiolas de plástico sob uma luz de 12/12 horas fotoperíodo escuro- acesso com comida de 
rato padrão e água pura para uma semana para permitir a adaptação ao ambiente 
experimental antes das intervenções. O estudo era um projeto de autocontrole. Cada rato teve 
movimento dentário de modelos experimentais aplicados a ambos os lados da maxila - um 
lado foi submetido a esclerostina e o outro lado foram submetidos à injeção de solução salina 
normal. 
2.2 Modelo de movimentação dentária ortodôntica 
Este estudo utilizou o modelo experimental clássico OTM que foi descrito anteriormente. Uma 
força de 50 g para induzir o movimento dentário foi gerado usando molas helicoidais de 
níquel-titânio (3M Unitek, Monrovia, CA). Após a anestesia com injeção intraperitoneal de 
hidrato de cloral a 10% (3-4 mg / kg), as molas helicoidais foram ligadas bilateralmente entre o 
incisivo central e o primeiro molar com Ligaduras de aço inoxidável de 0,010 polegadas e 
fixadas por um ionômero de vidro fotopolimerizado cimento também da 3M. Os incisivos dos 
ratos irrompem junto com atrito dentário. À medida que colocamos resina nos incisivos 
superiores, os dentes não deveriam ter atrito e erupção durante nosso experimento. 
2.3 Aplicação de intervenção (esclerostina) e controle (solução salina) 
Os ratos foram divididos em três grupos, recebendo três diferentes concentrações de injeção 
de esclerostina, ou seja, 0,8 μg / kg, 4 μg / kg ou 20 μg /kg (n = 16 em cada grupo). Cada rato 
recebeu 0,1 ml de injeção direta local de esclerostina (R&D systems, MN, EUA) no osso 
alveolar no lado mesial (lado de compressão) do primeiro molar superior à esquerda ou lado 
direito aleatoriamente (que se tornou o lado experimental). A esclerostina foi transportada por 
um hidrogel de polietilenoglicol-policaprolactona-polietilenoglicol (PECE) (um hidrogel 
termossensível sintetizado que sofre uma transição sol-gel-sol conforme a temperatura 
aumenta). O lado de controle da maxila recebeu o mesmo volume de solução salina também 
transportada pelo hidrogel PECE. Os microporos, preparado com um alargador e usado para 
injeção de esclerostina, estavam no osso alveolar a aproximadamente 4mm mesial do maxilar 
do primeiro molar em ambos os lados direito e esquerdo da maxila. Depois de duas semanas 
de aplicação de força, todos os ratos foram sacrificados por overdose de injeção 
intraperitoneal de anestesia. Os maxilares eram dissecados para análise de micro-tomografia 
computadorizada (μCT), TRAP coloração e análise imunohistoquímica (IHC). 
2.4 Distância de OTM 
A magnitude de OTM foi medida pela distância entre a distal do primeiro molar superior à 
mesial do segundo molar superior, molar no nível cervical usando calibradores digitais no 
micro-CT para imagens. A distância de OTM foi medida em triplicata por um operador que era 
cego para o agrupamento para calcular os valores médios. 
2.5 Análise de micro tomografia computadorizada (μCT) 
Os molares superiores e o osso alveolar adjacente foram fixados em formalina e escaneados 
por micro tomografia computadorizada. A região de interesse era um cubóide extraído da área 
de furca do primeiro molar de 400μm × 400μm × 500μm (comprimento × largura × espessura, 
no plano sagital), que tem sido considerado como tendo referências morfológicas 
reproduzíveis na literatura. Três regiões diferentes foram selecionadas e medidas para o 
cálculo dos valores médios. Fração de volume ósseo (BV / TV), número trabecular (Tb.N), 
espessura trabecular (Tb.Th) e separação trabecular (Tb.Sp) foram analisadas com o software 
inato. 
2.6 Coloração de fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP) e análise imunohistoquímica 
(IHC) 
Após a análise de μCT, todas as amostras foram descalcificadas e desidratadas usando uma 
série graduada de etanol e incluídas em parafina. As seções foram cortadas com uma 
espessura de 5μm e usadas para a coloração TRAP e análise IHC. Para o lado da compressão, o 
ligamento periodontal e osso alveolar mesial ao terço superior da raiz vestibular mesial doprimeiro molar superior foi escolhido para ser a região de interesse. Para o lado da tensão, o 
ligamento periodontal e o osso alveolar distal ao terço superior da raiz vestibular distal do 
primeiro molar superior foi escolhida para ser a região de interesse. Três seções foram usadas 
aleatoriamente para análise de coloração IHC e contagem de células positivas para TRAP por 
animal. A coloração TRAP foi realizada para examinar a formação de osteoclastos usando um 
kit comercial (Sigma, St Louis, MO, EUA) seguindo instruções do fabricante. Células TRAP-
positivas multinucleadas (em pelo menos 2 núcleos) adjacentes ao osso alveolar no lado da 
compressão do primeiro molar foram contados como osteoclastos. 
 
2.7 Análise Estatística 
O SPSS 22.0 foi usado para as análises estatísticas. Os dados foram apresentados como média 
± desvio padrão (DP). O teste t do aluno independente e análise ANOVA unilateral seguida 
pelos métodos SNK de análise de variância foram usados para comparação estatística. P <0,05 
foi considerado estatisticamente significativo. 
 
3. resultados 
3.1 Injecção de OTM reforçado com esclerostina 
0,65 ± 0,06 mm e 0,72 ± 0,04 mm nos grupos de injeção de esclerostina 4μg/kg e 4μg/kg 
respectivamente, ambos significativamente maiores do que os grupos de controle. A distância 
de OTM nos grupos 8μg/kg e 8μg/kg foi significativamente maior do que a do grupo 0.8μg/kg 
(0.58 ± 0.07 mm). 
3.2 A esclerostina diminuiu o osso alveolar BV/TV 
A análise da área de furcação do primeiro molar maxilar mostrou que a esclerostina diminuiu a 
BV/TV em comparação com o controlo. O BV/TV foi 0,59 ± 0,12 no grupo 20μg/kg de 
esclerostina, significativamente inferior àquele (0,75 ± 0,08) no grupo de controle. Não foi 
encontrada diferença significativa entre todos os grupos para os ossos alveolares Tb.N, Tb.Th e 
Tb.Sp 
3.3 A esclerostina aumentou a formação de osteoclastos e a expressão de RANKL no lado da 
compressão 
O número de osteoclastos TRAP-positivos foi significativamente mais elevado no período 
mesial do primeiro molar maxilar do grupo sclerostin 20μg/kg em comparação com o controle. 
A expressão RANKL foi significativamente mais elevada em todos os grupos de esclerostina, em 
comparação com o controle. Inversamente, a expressão OPG foi significativamente menor nos 
grupos 4μg/kg e 4μg/kg em comparação com o controle. Não foi encontrada qualquer 
diferença significativa entre todos os grupos para a expressão de esclerostina no lado da 
compressão. 
3.4 A injecção local de esclerostina no lado da compressão não suprimiu RUNX2, expressão OCN e 
formação COL-I no lado da tensão 
No período distal do primeiro molar superior, a expressão da esclerostina não tinha diferença 
significativa entre a esclerostina e os grupos de controle. Como sinal de osteogênese, a 
expressão de RUNX2 foi significativamente mais elevada nos grupos 4μg/kg e 4μg/kg em 
comparação com os grupos de controle. Além disso, a expressão de COL-1 foi 
significativamente mais elevada no grupo 20μg/kg em comparação com o grupo de controle. 
4. discussão 
A esclerostina, codificada por SOST, é uma proteína secretada do nó de cistina expressa em 
osso e periodonto, especificamente por osteócitos. É um regulador negativo da diferenciação e 
função dos osteoblastos, e um inibidor bem demonstrado da formação óssea. Por outro lado, a 
esclerostina também demonstrou ter um efeito catabólico através da promoção da atividade 
dos osteoclastos. Além disso, a esclerostina induz a expressão da catepsina K, TRAP, e anidrase 
carbónica2 nos osteócitos, sugerindo que pode ter um papel na osteólise da matriz 
extracelular que envolve os osteócitos para libertar mineral do osso. Recentemente, verificou-
se que os osteoclastos derivados da medula óssea envelhecida do rato expressam e secretam 
esclerostina, levando a uma diminuição da mineralização osteoblasto estimulada. Este 
mecanismo pode contribuir para a diminuição do osso massa que é exposta com a idade. A 
expressão de esclerostina durante a OTM também tem sido relatada. 
Em um estudo com roedores, o nível de esclerostina aumentou no lado da compressão após 
uma semana de aplicação de força ortodôntica, que estava de acordo com expressão de 
fatores osteoclastogênicos que levam à movimentação dentária. Num outro estudo, a 
expressão de esclerostina no osso alveolar aumentou no lado da compressão e atingiu o seu 
pico no dia 5; enquanto a expressão de esclerostina no lado da tensão diminuiu 
significativamente no dia 1. Assim, no presente estudo, injetamos esclerostina no osso mesial 
(compressão) do lado do primeiro maxilar molar. 
Em um modelo de movimento dentário, com a hipótese de que a esclerostina pode melhorar a 
OTM através da promoção da osteoclastogênese. Foram utilizados ratos machos de modo a 
excluir potenciais influências dos estrogênios. O grupo experimental de ratos receberam a 
intervenção completa de 8 a 10 semanas de idade, que era aproximadamente equivalente à do 
adolescente e do adulto precoce na humanidade. Devido à falta de estudos relacionados com 
a injeção local de proteína esclerostina, três concentrações de esclerostina foram 
selecionados. O hidrogel PECE utilizado neste estudo foi avaliado e relatado pela investigação 
anterior. O hidrogel sofre uma transição sol-gel-sol à medida que a temperatura aumenta, e é 
aquoso à temperatura ambiente e torna-se gel a 37° centígrados, o que pode durar pelo 
menos 14 dias. 
Este estudo concluiu que, com a aplicação de força ortodôntica, a injeção de proteína de 
esclerostina no lado da compressão acelerou a OTM. Além disso, a injeção local de proteína de 
esclerostina parecia não afetar a osteogênese no lado da tensão. A análise de tomografia 
microcomputadadorizada mostrou BV/TV mais baixa nos grupos de esclerostina, que estavam 
de acordo com o aumento dos osteoclastos TRAP-positivos, bem como uma expressão RANKL 
mais alta enquanto uma expressão OPG mais baixa. As alterações acima foram reveladas de 
forma dependente da dosagem de esclerostina, com o grupo 20μg/kg a mostrar os maiores 
efeitos osteoclastogênicos. Isto é consistente com uma descoberta anterior de que a 
esclerostina poderia aumentar a proporção da expressão RANKL/OPG nos osteócitos, numa 
dosagem dependente. Vários estudos identificaram a função de promoção da 
osteoclastogênese da esclerostina; no entanto, os mecanismos desta permanecem elusivos. É 
bem sabido que a esclerostina poderia diminuir a expressão da OPG através da via de 
sinalização Wnt, interagindo com o LRP4, 5 e 6. Como receptor para RANKL, a repressão da 
OPG pode levar ao aumento da osteoclastogênese. Por outro lado, a esclerostina poderia 
aumentar diretamente a expressão de RANKL em grande medida tanto em osteoblastos 
primários humanos como em células MLO-Y4, resultando numa reabsorção óssea elevada. 
No entanto, os mecanismos subjacentes a regulação da expressão RANKL pela esclerostina nos 
osteócitos continua a ser esclarecido. Além disso, alguns estudos têm afirmado que a 
esclerostina poderia promover a apoptose dos osteoblastos e osteócitos, o que pode recrutar 
precursores osteoclastos e melhorar a sua diferenciação. Curiosamente, embora a injeção local 
de esclerostina tenha aumentado a osteoclastogênese durante a OTM no lado da compressão 
no presente estudo, a atividade osteoblástica não foi reduzida no lado da tensão. Parece que a 
injeção local de esclerostina no lado de compressão do osso alveolar pode não afetar o lado de 
tensão. Além disso, as molas helicoidais de níquel-titânio foram esticadas 2 mm (50 g de força) 
no início do estudo. O maior movimento dentário dos ratos foi de 0,76 mm no presente 
estudo. Assim, com base no módulo de elasticidade das molas helicoidais de níquel-titânio, o 
alongamento das molas ainda podia fornecer uma força não inferior a 35 g no ponto final do 
estudo, o que ainda era uma força ótima para OTM de ratos. Uma limitação do presenteestudo foi que apenas um ponto temporal, duas semanas, tinham sido selecionadas. 
OTM é um processo biológico complexo, e que diferentes mudanças podem ser encontradas 
em diferentes fases. Por conseguinte, sugere-se a realização de estudos futuros para aumentar 
os pontos de tempo para observar o prolongado efeito da injeção local de esclerostina na 
OTM. 
5. conclusão 
A injeção local de proteína esclerostina no osso alveolar no lado da compressão melhora o 
movimento dentário e a osteoclastogênese em ratos.