Endotoxinas - folhetos anotados (1)

Prévia do material em texto

Slide 1 
Pirogênio
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Profa. Dra. Márcia E. S. Ferreira
Bloco S – Sala 13 – Térreo – Ramal: 150265
mesfe@fcfrp.usp.br
 
 
Devido à grande importância dos pirogênios em produtos estéreis, vamos falar um pouco 
sobre o que é e como impedir a presença dessas substâncias em produtos estéreis. 
 
 
 
Slide 2 
PIROGÊNIO 
exógeno
Lipopolissacarídeo 
(endotoxina) bactérias, 
fungos, vírus, componentes 
de bactérias Gram (-) e (+), 
alguns fármacos, esteróides, 
frações do plasma
endógeno
resposta a pirogênio 
exógeno
produzido pelo 
hospedeiro
Mediador primário da febre
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Pirogênio é uma substância que, quando administrada em um ser vivo, induz ao aumento 
da temperatura corporal. Os pirogênios são divididos em pirogênios endógenos e exógenos. 
O pirogênio endógeno é aquele produzido pelo hospedeiro em resposta ao estímulo por 
pirogênios exógenos. Ele é considerado o mediador primário da febre e é produzido por 
diferentes células do hospedeiro. 
Os pirogênios exógenos são aqueles que se originam fora do corpo e induzem elevações 
térmicas quando injetados em animais ou no homem. Como fonte de pirogênio exógeno 
menciona-se grande variedade de origens desde bacteriana, fungos, vírus bem como alguns 
fármacos, esteroides e frações do plasma. Embora o lipopolissacarídeo (endotoxina) seja o 
mais significativo, existem outros produtos, de constituição química diversa, que também 
produzem elevação da temperatura corporal quando injetados, sob condições apropriadas. 
 
 
 
Slide 3 
ENDOTOXINA / LIPOPOLISSACARÍDEO 
Alto peso molecular
Membrana externa da parede celular de bactérias Gram (-)
Purificadas – lipopolissacarídeos (LPS)
Termoestáveis
Inativação - ciclos extensos de calor seco, condições alcalinas ou ácidas
Atividade biológica de amplo espectro - porção lipídica
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Endotoxina é uma toxina que é parte integrante da parede celular de algumas bactérias e 
só é libertada após a destruição da parede celular dessa bactéria. Nas Gram-negativas (G-) é o 
LPS e nas Gram-positivas (G+), menos frequente, é o peptideoglicano. 
A molécula de LPS é composta por uma cadeia lateral de polissacarídeo (Antígeno O), e 
ligada à região do core, um oligossacarídeo (2-ceto-3-ácido deoxioctônico); este por sua vez 
está ligado a uma molécula lipídica (Lipídeo A). O antígeno “O“ varia entre as espécies de 
bactérias G-, tanto em composição como em comprimento, enquanto as regiões do core e do 
lipídeo A são mais conservadas entre as diferentes espécies de bactérias G-. A atividade 
biológica, de amplo espectro, está associada à porção lipídica da molécula (Lipídeo A), principal 
componente ativo e tóxico da molécula. 
As endotoxinas são complexos de alto peso molecular associados à membrana externa da 
parede celular de bactérias G- e se constituem na mais significante fonte de pirogênio para a 
indústria farmacêutica. Quando purificadas são chamadas de lipopolissacarídeos, para 
enfatizar sua natureza química. 
Embora termoestáveis, as endotoxinas são inativadas por ciclos extensos de calor seco, 
além de serem inativadas por condições alcalinas ou ácidas. 
 
 
 
Slide 4 
Níveis de endotoxinas - Limites aceitáveis (FDA)
• Água estéril para irrigação - 0,25 UE/mL
• Água para injeção - 0,25 UE/mL
• Administração intratecal - 0,2 UE/mL
• Solução salina - 0,5 UE/mL
• Solução glicose injetável 5% - 0,5 UE/mL
• Água para hemodiálise - 1 UE/mL
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Nesse slide podemos encontrar alguns limites aceitáveis para endotoxinas, de acordo com 
o FDA. Cinco unidades de endotoxina (UE) equivale a 1 ng. 
• Água estéril para irrigação - 0,25 UE/mL 
• Água para injeção - 0,25 UE/mL 
• Administração intratecal - 0,2 UE/mL 
• Solução salina - 0,5 UE/mL 
• Solução glicose injetável 5% - 0,5 UE/mL 
• Água para hemodiálise - 1 UE/mL 
 
 
 
 
Slide 5 
PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO
INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS
. Hidrólise ácido-base
. Oxidação
. Alquilação
. Calor seco
. Radiação ionizante REMOÇÃO DAS ENDOTOXINAS
. Lavagem
. Destilação
. Ultrafiltração
. Osmose reversa
. Carvão ativo
. Atração eletrostática
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Os processos de despirogenização podem se dar por inativação das endotoxinas ou pela 
remoção das mesmas. 
A inativação pode ser obtida pela detoxificação da molécula de LPS usando tratamentos 
químicos que quebrem pontes lábeis ou bloqueiem sítios necessários para a atividade 
pirogênica, ou seja, resultam na desativação do Lipídeo A. Como alternativa, a molécula pode 
ser destruída usando-se altas temperaturas. A inativação pode ocorrer por: 
. Hidrólise ácido-base 
. Oxidação 
. Alquilação 
. Calor seco 
. Radiação ionizante 
A utilização de cobalto 60 aumenta a possibilidade de alterações químicas desconhecidas 
em fármacos e soluções parenterais e, por isto, não tem sido considerado. Nesse caso, os 
riscos de toxicidade decorrente do processo superam as propriedades benéficas. 
Por outro lado, a remoção das endotoxinas está baseada nas características físicas da 
endotoxina, como tamanho, peso molecular, carga eletrostática ou afinidade da endotoxina a 
diferentes superfícies. A remoção pode ocorrer por: 
. Lavagem 
. Destilação 
. Ultrafiltração 
. Osmose reversa 
. Carvão ativo 
. Atração eletrostática 
 
 
 
 
Slide 6 
DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS
HIDRÓLISE ÁCIDA
Separa o lipídeo A do restante da molécula do LPS
Altera a conformação (lipídeo A) em sítios funcionais essenciais
HCl 0,05 N por 30 min a 100 ºC
Ácido acético 1,0% por 2-3 horas a 100 ºC
OXIDAÇÃO
H2O2 – oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPS
Inativação dependente do tempo, pH e concentração
Outros: O2 molecular, ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido 
periódico, permanganato de potássio diluído, ácido nítrico
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Como dito anteriormente, a inativação das endotoxinas pode ocorrer pela hidrólise ácida. 
Este método reduz ou elimina a atividade biológica de lipopolissacarídeos pela desativação do 
lipídeo A. A hidrólise separa o lipídeo A do restante da molécula do LPS e este, isolado e 
insolúvel no sistema aquoso, tem sua atividade reduzida ou eliminada. Por outro lado, a 
hidrólise ácida pode agir sobre a fração lipídeo A, alterando sua conformação em sítios 
funcionais essenciais ou clivando ácidos graxos, afetando a solubilidade e pirogenicidade do 
lipídeo. A hidrólise ácida empregando ácido clorídrico 0,05N, por 30 minutos, a 100°C ou ácido 
acético 1%, por 2 a 3 horas, a 100°C tem sido empregada para a despirogenização de 
materiais. 
Para a inativação através da oxidação pode-se utilizar peróxido de hidrogênio. Embora o 
mecanismo de ação do H2O2 sobre o LPS seja desconhecido, é possível que decorra da 
oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPS. A inativação depende do tempo, pH 
e concentração de H2O2. O H2O2 apresenta como vantagens a segurança no manuseio, pode 
ser facilmente eliminado da solução e age em condições não extremas (5%). Porém, pode 
atuar como agente oxidante e ser responsável pela degradação de componentes existentes 
nos produtos. Pode ser usado para a despirogenização de componentes plásticos empregados 
na fabricação de correlatos ou eliminação de pirogênio na água estéril para injeção. Outros 
oxidantes podem ser utilizados (Ex. O2 molecular, ácido hipoclorosoou hipoclorito, ácido 
periódico, permanganato de potássio diluído, ácido nítrico), porém com maiores limitações de 
compatibilidade. 
 
 
 
 
Slide 7 
DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS
ALQUILAÇÃO
Anidrido acético e succínico - redução de 100 a 1000 vezes
Óxido de etileno - redução significativa de endotoxinas
CALOR SECO
Materiais termo resistentes: frascos de vidro e instrumentos metálicos
250 ºC por 30 min – mecanismo incineração
O aumento do tempo de exposição a temperaturas menos elevadas 
(175 ºC) não reduz LPS
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
A alquilação é outro método que pode ser utilizado para reduzir a atividade pirogênica. 
Estudos realizados com anidrido acético e anidrido succínico resultaram na redução de 100 a 
1000 vezes da atividade. O óxido de etileno é um forte agente alquilante, havendo indícios de 
redução significativa de endotoxinas, além de poder ser utilizado para a esterilização de 
materiais hospitalares. 
A despirogenização por calor seco tem sido o método de escolha para materiais 
termorresistentes como frascos de vidro e instrumentos metálicos. A exposição a não menos 
que 250°C, por não menos que 30min, é capaz de inativar a endotoxina pelo mecanismo de 
incineração. O aumento do tempo de exposição a temperaturas menos elevadas não reduz 
endotoxina; portanto, condições usuais de autoclavação não são efetivas na destruição de 
endotoxinas. Entretanto, a autoclavação pode potencializar a ação despirogenizante, seja da 
ação oxidante do peróxido de hidrogênio, como da remoção pela adsorção em carvão ativo. 
 
 
 
Slide 8 
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS
LAVAGEM
Lavagem com solvente apirogênico – água estéril para injeção
DESTILAÇÃO
Mudança de estado físico
Moléculas de LPS são grandes e de elevado peso molecular
Água recém destilada é estéril e apirogênica
ULTRAFILTRAÇÃO
Exclusão por peso molecular
Forma monomérica – 10.000 a 20.000 daltons
Vesículas – 300.000 a 1.000.000 daltons
Aplicação: antibióticos
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Além dos métodos utilizados para a inativação das endotoxinas, existem os métodos 
capazes de remover as endotoxinas. 
A lavagem é o método mais simples. Nesse método, faz-se a lavagem do material a ser 
despirogenizado com solvente apirogênico. Usualmente utiliza-se água estéril para injeção. 
Níveis baixos de endotoxina podem ser efetivamente removidos da vidraria, tampas e 
dispositivos, com procedimentos adequados de lavagem. A remoção de endotoxina pela 
lavagem pode ser monitorada pelo teste LAL (lisado de amebócitos de Limulus). 
A destilação é o método mais antigo que remove efetivamente o pirogênio da água, com 
mecanismo relativamente simples. A destilação envolve a mudança de estado físico de líquido 
para vapor e de vapor para líquido. Como as moléculas de LPS são grandes e de elevado peso 
molecular, elas permanecem na fase líquida. Sendo assim, a água recém destilada é estéril e 
apirogênica. Foi a aplicação deste conhecimento que permitiu iniciar a produção comercial de 
parenterais de grande volume nos EUA, nos anos precedendo à Segunda Guerra mundial. 
A ultrafiltração tem seu mecanismo fundamentado nos limites de exclusão de peso 
molecular. Sendo assim, as endotoxinas que excedem a um valor limite de peso molecular, são 
retidas na superfície da membrana. A forma monomérica da endotoxina possui cerca de 
10.000 a 20.000 daltons, podendo ser efetivamente removida por um ultrafiltro molecular de 
10.000 daltons. Porém as formas monoméricas são raramente encontradas em soluções 
aquosas, pois, normalmente, as moléculas de LPS se agregam formando vesículas com peso de 
300.000 a 1.000.000 daltons. Para efeito prático, a remoção de endotoxina em soluções 
aquosas pode ser dar pela utilização de ultra-filtros com capacidade de reter moléculas de 
100.000 daltons ou maiores. A ultrafiltração tem sido aplicada, com sucesso, a uma ampla 
faixa de fármacos e soluções de baixo a médio peso molecular (ex. antibióticos). 
 
 
 
 
Slide 9 
DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS
OSMOSE REVERSA
Membrana de acetato de celulose ou poliamida
Remoção de endotoxinas por exclusão (porosidade 10 Aº)
CARVÃO ATIVO
- adsorção ao carvão ativo
- liberação de traços de carvão
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
pH < 2,0 – endotoxina carga negativa
Membranas com poliamidas ou aminas covalentemente 
ligadas – carga positiva (pH < 9)
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
A osmose reversa pode ser utilizada para a remoção de endotoxinas quando se utiliza 
membranas, constituídas de acetato de celulose ou poliamida, com poros pequenos o 
suficiente para a exclusão de íons (poros de cerca de 10 A° de diâmetro, ou seja, com cerca de 
1 m). É um dos dois únicos métodos, reconhecidos pela USP, para a produção de água estéril 
para injeção, ao lado da destilação. 
O carvão ativo também pode ser utilizado para a remoção de endotoxinas, cujo mecanismo 
de ação é a adsorção. O carvão é adicionado à solução, agitado e removido por filtração ou 
sedimentação. Entretanto, pode ocorrer adsorção de ingredientes ativos e liberação de traços 
de carvão, necessitando na sua remoção, posteriormente. 
A remoção da endotoxina também pode ocorrer pelo mecanismo de atração eletrostática. 
Em pH<2 a endotoxina se encontra com carga negativa, podendo ser removida pela utilização 
de membranas carregadas positivamente. Membranas com poliamidas ou aminas 
covalentemente ligadas possuem carga positiva em solução aquosa, em pH<9. Produtos 
microporosos, comercialmente disponíveis, são empregados com sucesso na despirogenização 
de ampla faixa de soluções farmacêuticas. 
 
 
 
Slide 10 
OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS
 Processo produtivo em condições adequadas de higiene
(operadores e ambiente)
 Matéria-prima com baixa carga microbiana
 Processos validados
 Pessoal qualificado e treinado
 Boas práticas de fabricação
 Monitorização do processo (métodos analíticos validados –
in vivo e in vitro)
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Após conhecer os métodos despirogenizantes, ficam evidentes as limitações quanto à 
aplicação no produto acabado, devido a incompatibilidades de distintas naturezas, riscos 
envolvidos ou mesmo aspectos econômicos. Com exceção da obtenção da água apirogênica, 
assim como a aplicação de calor seco em condições drásticas a materiais termoestáveis 
(material de acondicionamento), os demais são extremamente específicos. 
Portanto, deve permanecer muito fortemente sedimentada a importância em trabalhar 
todo o processo produtivo de produtos estéreis em condições adequadas de higiene 
(operadores e ambiente), utilizar matéria-prima com baixa carga microbiana, utilizar somente 
processos validados e pessoal qualificado e treinado, ou seja, obedecer às boas práticas de 
fabricação, de modo que o produto seja obtido apirogênico no primeiro processamento, 
dispensando preocupações quanto a reprocessos ou tratamentos adicionais. 
A monitorização do processo, quanto à presença de endotoxinas, pode ser realizada por 
métodos in vivo (empregando coelhos) ou in vitro (empregando a técnica LAL) validados; bem 
como os testes das matéria-primas ou do produto terminado. 
 
 
 
Slide 11 
TESTE DE ENDOTOXINA - MÉTODO IN VITRO
1885 – sangue Limulus polyphemus formava um coágulo
em gel sólido
Amebócitos- única célula circulante encontrada no sangue
Posteriormente – bactérias marinhas Gram (-) provocavam
extensiva coagulação intravascular e morte destes animais
Derivado termoestável das bactérias
1964 – Levin e Bang: (1) amebócitos eram necessários para
a reação, (2) quantidades de endotoxina eram inativadas na
reação
Disciplina de Controle de Qualidade de ProdutosFarmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Limulus polyphemus (Linnaeus, 1758), comumente conhecido como "caranguejos" em 
forma de ferradura, foram originalmente classificados como caranguejo erroneamente. Eles 
são, na verdade, um parente distante dos crustáceos, e são mais estreitamente relacionados 
aos aracnídeos, como aranhas, escorpiões e carrapatos. 
Em 1885 foi verificado que o sangue de Limulus polyphemus formava um coágulo em gel 
sólido quando removido do animal. Vários aspectos da coagulação foram estudados, com 
particular referência aos amebócitos, as únicas células circulantes encontradas no sangue 
desse animal. Posteriormente foi verificado que bactérias marinhas G- provocavam extensiva 
coagulação intravascular e morte destes animais e que um derivado termoestável das 
bactérias era responsável por essa coagulação. 
Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos que permitiram às seguintes conclusões: (1) 
os amebócitos eram necessários para a reação e sua lise acelerava a reação, (2) quantidades 
de endotoxina eram inativadas na reação. 
 
 
 
 
Slide 12 
MECANISMO DA REAÇÃO
Young e cols., 1972:
(1) reação é dependente da ativação de uma enzima de alto
peso molecular pela endotoxina (dependente de Ca++ e
outros íons bivalentes)
(2) geleifica proteínas coaguláveis de baixo peso molecular
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Em 1972, Young e colaboradores concluíram que a reação é dependente da ativação de 
uma enzima de alto peso molecular pela endotoxina, além de cálcio e outros íons bivalentes; e 
que ocorria a geleificação de proteínas de baixo peso molecular. 
O mais simples e amplamente utilizado dos procedimentos para detecção de endotoxinas 
baseia-se na geleificação. O teste é realizado misturando-se volumes iguais de reagente LAL e 
da solução a ser testada (0,1 mL de cada) em tubos de vidro despirogenizados. A mistura é 
suavemente homogeneizada e a seguir incubada em banho de água, a 37°C, por uma hora. 
Durante esse período, os tubos não devem ser manuseados a fim de não interferir na 
geleificação. O ponto final da reação é facilmente constatado pela remoção cuidadosa e 
individual dos tubos e sua inversão a 180 graus. Se houver a presença de gel que se mantém 
sólido durante a inversão, o teste é considerado positivo para endotoxinas. A sensibilidade do 
método varia entre 0,25 e 0,015 UE/mL. 
 
 
 
Slide 13 
Preparo do lisado do amebócito de Limulus (LAL)
 Sangria do animal
 Lavagem do amebócito
 Liberação do conteúdo intracelular do amebócito
 Liofilizado (estável a 4oC por 3 anos)
LAL introduzido na USP XX e 4a. Edição Farmacopéia Brasileira 1996
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
O teste in vitro, com a utilização do reagente LAL no método para avaliar a presença de 
endotoxina, foi introduzido na 20ª edição da USP e na 4ª edição da farmacopeia Brasileira 
(1996). 
O reagente LAL (lisado do amebócito de Limulus) é obtido através da sangria do animal que, 
após o procedimento, podem ser devolvidos à água. É introduzida uma agulha estéril e 
apirogênica através do músculo entre as regiões céfalo-torácica e abdominal do animal. A 
hemolinfa flui para um recipiente com anticoagulante e estabilizador osmótico (cloreto de 
sódio), que estabiliza a membrana frágil do amebócito. A seguir, é submetido à centrifugação, 
por 10min, e o sobrenadante é desprezado. É feita a lavagem dos amebócitos com cloreto de 
sódio (3%) para remoção do anticoagulante e componentes do soro. A seguir, ocorre a 
liberação do conteúdo intracelular do amebócito pela adição de água destilada apirogênica, 
que promove o choque osmótico e lise da célula. O material é, então, liofilizado e armazenado, 
a 4°C, por até 3 anos. 
 
 
 
 
Slide 14 
MÉTODOS ANALÍTICOS
 Ponto final de geleificação (LAL + solução teste incuba
a 37 ºC por 1 hora observa formação do gel (inverte o
tubo a 180º)
Ensaio limite
Sensibilidade: 0,25 a 0,015 EU/mL
 Ensaio turbidimétrico (0,005 EU/mL)
 Método colorimétrico de Lowry
 Método nefelométrico
 Método cromogênico
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Além do método convencional para a detecção de endotoxinas, que é feito observando-se 
a formação do gel com vista desarmada, existem variações que permitem aumentar a 
sensibilidade do método. 
O ensaio turbidimétrico é um método baseado no fato de que qualquer aumento na 
concentração de endotoxinas causa um aumento proporcional na turbidez, devido à 
coagulação das proteínas coaguláveis. A leitura é realizada em um espectrofotômetro e 
permite melhor medida quantitativa da endotoxina, em grande faixa de concentrações. 
O método colorimétrico de Lowry é um teste quantitativo, que é baseado na observação de 
que concentrações crescentes de endotoxina irão precipitar proporcionalmente as proteínas 
do reagente LAL, coagulando proteínas que serão quantificadas pelo método de Lowry para 
proteínas. 
O método nefelométrico emprega um nefelômetro a laser, planejado para quantificar 
concentrações de proteínas coaguladas. Este método emprega luz relativa dispersa. Assim 
como o método colorimétrico de proteína de Lowry, não tem sido aceito como promissor. 
O método cromogênico é um método quantitativo que apresenta vantagem quanto à 
especificidade da enzima de coagulação ativada (ação amidase específica para resíduos glicina-
arginina carboxiterminais). Nesse caso, a substância cromogênica + amostra irá resultar na 
liberação de p-nitroanilina, proporcional às concentrações de endotoxina (cromóforo lido em 
405nm). Embora seja um método extremamente acurado em ampla faixa de concentrações de 
endotoxina, a velocidade de reação proíbe que se conduzam testes com grande número de 
amostras, sem introduzir significante variação entre as primeiras e últimas amostras. 
 
 
 
Slide 15 
VALIDAÇÃO DO MÉTODO
- Sensibilidade do LAL
- Efeito de substâncias presentes na amostra
APLICAÇÃO (LAL)
Utilizado em produtos parenterais, água para injeção e em
fluidos biológicos
Método extremamente sensível, específico, preciso e exato,
simples e rápido.
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
O método LAL é utilizado para detectar a presença de endotoxinas em produtos 
parenterais, água para injeção e em fluidos biológicos. É um método extremamente sensível, 
específico, preciso e exato, simples e rápido. 
Validações do teste LAL, objetivando liberação de produto terminado quanto ao limite de 
endotoxinas, envolvendo medicamentos, correlatos e biológicos, abrangem a comprovação da 
sensibilidade do LAL e a determinação de efeitos inibidores ou exacerbantes provocados pelas 
substâncias integrantes da amostra. O ensaio LAL é baseado na reação de coagulação induzida 
pela endotoxina. Sendo assim, não surpreende encontrar produtos que provoquem a inibição 
ou que potencializem a reação. Assim, a inibição ou potencialização devem ser determinadas 
para cada formulação, antes que seja empregada a metodologia para liberação final do 
produto. A determinação consiste em contaminar, propositalmente, a concentração mais 
usada do medicamento com o padrão de endotoxina e realizar o ensaio. 
Deve ser lembrado que o teste em coelhos avalia a presença de endotoxina e outras 
substâncias que são capazes de promover reação febril (pirogênios) enquanto o ensaio LAL 
mede exclusivamente a concentração de endotoxinas. 
 
 
 
 
Slide 16 
TESTE DE PIROGÊNIO - MÉTODO IN VIVO
- Ensaio limite
- Aprovar ou rejeitar uma amostra
☻ Cada grupo de animais (3 coelhos) recebe injeção
intravenosa da amostra e é observado durante um período de
3 horas
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020
- Grande volume e líquidos extratores: 10 mL/Kg
- Velocidadeda injeção: 4 a 6 mL/min (não ultrapassar 4 min)
- Temperatura da amostra: 37 a 38 ºC
Produtos incompatíveis com essa técnica: Fármacos que 
atuam sobre o sistema termorregulatório 
 
 
O teste de pirogênio em coelhos, apesar de delegado apenas a situações às quais não é 
aplicável a metodologia alternativa, deve ser mantido. Vantagem: envolve toda a reação 
fisiológica do animal, constituindo-se não somente em teste de pureza para substâncias 
pirogênicas, mas também em teste de segurança para os produtos injetáveis, líquidos para 
infusão e perfusão, materiais cirúrgicos e descartáveis em geral. 
Estudos científicos demonstraram que a dose pirogênica mínima de endotoxina purificada 
foi comparável em coelhos adultos e humanos, sugerindo que o sistema termorregulatório 
desse animal possui as mesmas características do ser humano. Embora se admita equivalência 
para dose-limite na reação pirogênica de coelhos e do homem, quando sob doses 
consistentemente mais altas a relação dose-resposta observada no ser humano é mais intensa, 
podendo ser até 10 vezes maior. 
Pode-se dizer que o método in vivo persiste como um teste limite, sem constituir 
determinação quantitativa, com a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra mediante 
informações obtidas de um grupo de coelhos e que devem atender a um padrão de estado 
febril. 
No teste, cada grupo de animais (geralmente inicia-se com 3 coelhos/grupo) recebe injeção 
intravenosa (na veia marginal da orelha) da amostra a ser testada e o grupo é observado, 
quanto à variação da temperatura corporal, durante um período de 3 horas. 
Neste teste é possível testar grandes volumes de amostra (10 mL/kg do animal), o que 
aumenta a representatividade da amostra. Podem ser testados parenterais de grande volumes 
e líquidos extratores utilizados para a lavagem de correlatos. A velocidade de injeção deve ser 
de 4 a 6 mL por minuto e não deve ultrapassar a 4 minutos. A temperatura da amostra deverá 
estar em torno de 37 a 38°C. 
 
 
 
 
Slide 17 
USP LV
Se algum dos três animais apresentar elevação térmica > ou igual 
0,5 oC - reteste
RETESTE
+ 5 animais – não mais que 3 animais devem acusar elevação térmica 
crítica > ou igual a 0,5 oC
Valor da somatória (8 animais) não deve exceder a 3,3 oC
INTERPRETAÇÃO
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020 
 
Se algum animal apresentar elevação da temperatura corporal maior ou igual a 0,5°C, deve-
se proceder ao reteste. No reteste deverão ser utilizados outros 5 animais. De todos os oito 
animais utilizados, no máximo 3 poderão ter elevação da temperatura corporal acima de 0,5°C 
e a somatória da elevação da temperatura corporal de todos os oito animais não poderá 
exceder a 3,3°C para que a amostra seja considerada apirogênica. 
 
 
 
Slide 18 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Pinto, T.J.A.; Kaneko, T.M.; Pinto, A.F. Controle biológico de qualidade de
produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 3ª Ed. Ateneu Editora,
São Paulo, 2010.
- Farmacopéia Brasileira, 6ª Ed., ANVISA, 2019.
- United States Pharmacopoeia. 40th Ed. Rockville: United States
Pharmacopoeia Convention, 2017.
- www.anvisa.gov.br
- LEVIN, J.; BANG, F.B. A description of cellular coagulation in the
Limulus. Bull Johns Hopkins Hosp., v.115, p.337-45, 1964.
- YOUNG, N.S.; LEVIN, J.; PRENDERGAST, R.A. An invertebrate
coagulation system activated by endotoxin: evidence for enzymatic
mediation. J Clin Invest., v.51, p.1790-7, 1972.
Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos
Ribeirão Preto - 2020