Controle de Qualidade Microbiologico

Prévia do material em texto

CQMMC 
Ambiente 
-Maior fonte de contaminação do ar em ambiente provém da pele → o ser humano em movimento gera 500.000 part/min
-Área limpa
· Suprimento e a distribuição do ar, sua filtragem, materiais de construção e procedimentos de operação visam reduzir a introdução, geração e a retenção de contaminantes em seu interior;
· Atender níveis apropriados de classificação de acordo com as normas técnicas vigentes
-Áreas limpas x partículas em suspensão 
	
-Frequência de monitoramento de rotina de microorganismos (em operação)
-Limites para contaminação microbiológica (RDC 17/2010)
-RDC 17/2010
· Art 318 → Devem ser estabelecidos limites de alerta e de ação para a detecção de contaminação microbiológica, e para o monitoramento de tendência de qualidade do ar nas instalações.
· Os limites de alerta devem ser estabelecidos pelo próprio fabricante de forma que, quando excedidos, desencadeiem atividades que promovam o retorno do sistema à normalidade
· Quando há um bom funcionamento da área limpa, a variação dos valores de microrganismos e partículas será baixa, e valores fora do especificado pelas normas de BPF são muitas vezes indicativos de um novo problema na sala ou mesmos de problemas no método de amostragem. 
· Valores de limites de alerta são inferiores ao máximo regulamentar, mas devem ser suficientemente acima da variação normal dos resultados de contaminantes historicamente encontrada. 
· A resposta a um valor acima do limite de alerta é muitas vezes uma anotação do evento que servirá como base para uma análise de possíveis tendências. 
· Os limites de ação são valores estabelecidos abaixo dos limites regulamentares máximos, e normalmente são acima dos valores definidos como limites de alerta
Figura 1 a Segundo ISO 14644-1, b UFC/m2 – USP XXVII, c UFC/placa
 **No caso de classe grau A, que deve ser <1 UFC/m2 não há limite de alerta, pois assim que é detectado, já deve se partir para ação, uma vez que o ambiente não está como deveria estar.
**Classe grau B possui limite 10 UFC/m2
· Quando bactérias ou fungos são detectados em áreas críticas em valores acima do nível dos limites de alerta ou ação, a sua identidade deve ser verificada até o nível da espécie. 
· Quando isso é impossível, a justificativa deve ser documentada.
· Detecções recorrentes de um mesmo microrganismo indica que uma fonte constante de contaminação está presente. 
· Agentes esporicidas devem ser utilizados para eliminar as espécies formadoras de esporos. 
· Espécies de microrganismos inesperadas ou exóticas (não nativas do país local) podem ser provenientes de matérias-primas contaminadas, indicando uma mudança de fornecedor ou suprimentos, ou operadores recentemente expostos a uma doença não endêmica para a planta fabril.
· Para crescer em um ambiente praticamente estéril, o mo precisa ser “diferente”, uma vez que esse ambiente apresenta características que dificultam seu crescimento
-Amostragem
· No plano de amostragem devem ser incluídos os locais onde o produto é exposto e os momentos em que manipulação por operadores (30cm dos operadores por ser um ponto de referência) e superfícies que entrarão em contato com o produto
· A permissão de acesso a zonas de alto risco para realização do monitoramento ambiental e de procedimentos relacionados deve ser regida por uma relação risco-benefício
· Quando as atividades realizadas tornarem impossível a atividade de amostragem ou se os riscos para o produto forem considerados inaceitáveis, a decisão pela não realização da amostragem deve ser baseada em evidências, que devem ser devidamente documentadas e aprovadas pelos responsáveis.
· Em ambientes limpos, partículas não viáveis de diâmetros definidos (0,5 e 5 µm) devem ser medidas por instrumentos adequados e devidamente calibrados em intervalos definidos de acordo com o seu tipo e uso. 
Biossegurança
-Ciência destinada a: prevenir, controlar, reduzir e eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer a saúde humana, animal, vegetal e ambiente
-Classificação de riscos dos agentes biológicos 
· Critérios
· Virulência
· Modo de transmissão
· Estabilidade de agente
· Concentração e volume
· Origem do material potencialmente infeccioso
· Disponibilidade de medidas profiláticas eficazes
· Disponibilidade de tratamento eficaz
· Dose infectante
· Tipo de ensaio
· Fatores referentes ao trabalhador
**Fatores regionais levam a diferentes classificações em outros países em virtude de fatores regionais específicos que irão influenciar na sobrevivência do agente biológico e na sua endemicidade
· Classe de risco 1 → baixo risco individual e para a comunidade → Bacillus subtilis
· Classe de risco 2 → moderado risco individual e limitado risco para a comunidade → inclui agentes biológicos que provocam infecção no homem ou nos animais, com potencial de propagação na comunidade limitado (existem medidas profiláticas e terapêuticas disponíveis) → E. coli, C. tetani, Klebisiella 
· Classe de risco 3 → alto risco individual e moderado para a comunidade → inclui os agentes biológicos que possuem capacidade de transmissão por via respiratória e que causam patologias humanas ou animais, potencialmente letais, para as quais existem medidas de tratamento e ou prevenção. Representam risco se disseminadas na comunidade ou no meio ambiente → Bacillus Anthracis, Mycobacterium tuberculosis
· Classe de risco 4 → alto risco individual e para a comunidade → agentes biológicos com grande poder de transmissibilidade por via respiratória ou de transmissão desconhecida. Até o momento não há nenhuma medida profilática ou terapêutica. Causam doenças humanas e animais de alta gravidade, com alta capacidade de disseminação na comunidade e meio ambiente. Inclui principalmente os vírus.→ Ebola
· Classe de risco especial → alto risco de causar doença animal grave e de disseminação para o meio ambiente → agentes biológicos que doença animal não existente no país e que, embora não sejam obrigatoriamente patógenos de importância para o homem, podem gerar graves perdas econômicas e/ou na produção de alimentos. Agentes incluídos na classe especial devem ser manipulados em área NB-4, enquanto ainda não circularem no país, devendo sua importação ser restrita, sujeita a prévia autorização das autoridades competentes. Caso sejam diagnosticado no território nacional, deverão ser tratados no NB determinado pelos critérios que norteiam a sua avaliação de risco.
-Níveis de biossegurança
· NB-1 
· Agente biológico da classe de risco 1
· Laboratório não precisa estar separado das demais dependências do edifício 
· Trabalho é conduzido em bancada 
· Não são exigidos equipamentos de contenção específicos 
· Profissionais do laboratório: treinamento em Biossegurança e na atividade específica do laboratório - Recomenda-se a supervisão por um profissional de nível superior
· CSB não são exigidas
· EPIs, tais como luvas e vestuário de proteção são requeridos
· Vestuário de proteção deverá ter mangas compridas ajustadas nos punhos e não deve ser usado fora da área laboratorial
· Uso de calçados fechados 
· Dispositivo de emergência para lavagem dos olhos, além de chuveiros de emergência localizados no laboratório ou em local de fácil acesso
· Porta de acesso do laboratório com símbolo internacional de risco biológico, advertência de área restrita
· NB-2 
· Todos exigidos para NB-1
· Treinamentos anuais e trabalhos supervisionados por superior
· Acesso ao laboratório restrito
· EPIs devem ser depositados em recipiente exclusivo
· Acidentes ou incidentes que resultem em exposição a agentes biológicos patogênicos devem ser imediatamente notificados ao profissional responsável
· Todos materiais devem ser desocontaminados, preferencialmente esterilizados, antes de reutilizados ou descartados
· NB-3
· Todos exigidos para NB-2 
· Aplicado em locais onde foram desenvolvidos trabalhos com agentes biológicos da classe de risco 3
· Treinamento específico e supervisionado
· Todos procedimentos devem ser realizados dentro de CBSs (classe I ou II) ou de outro dispositivode contenção física. 
· Laboratório deve ser registrado junto a autoridades sanitárias nacionais
· Acesso restrito ao laboratório
· NB-4
· Agentes biológicos da classe de risco 4 ou com potencial patogênico desconhecido → não há vacina ou terapia disponível 
· Treinamento específico
· Isolamento dos trabalhadores de laboratórios em relação aos agentes biológicos patogênicos aerossolizados é realizado primariamente em uma CSB da classe III ou da classe II B2 associado à utilização de roupas de proteção com pressão positiva, ventiladas por sistema de suporte à vida
· O laboratório de NB-4 deve ser uma edificação construída separadamente de outras edificações ou localizada em uma zona completamente isolada, devendo possuir características específicas quanto ao projeto e aos sistemas de engenharia, para prevenção da disseminação de agentes no meio ambiente
· Existem dois modelos de laboratório de contenção máxima para manipulações de agentes biológicos da classe de risco 4:
(1) laboratórios para manipulações conduzidas em CSB de classe III; e
(2) laboratórios para manipulações conduzidas em CSB de classe II B2; realizadas em associação à roupa de proteção pessoal, peça única, ventilada, de pressão positiva, que possua um sistema de suporte à vida protegido por filtros Hepa.
· O sistema de suporte de vida deve incluir compressores de respiração de ar, alarmes e tanques de ar de reforço de emergência.
Identificação de microorganismos em medicamentos
1) Identificação fenotípica
-Análise qualitativa 
· Características → macroscópicas e microscópicas
· Identificação
-Análise quantitativa 
· Filtração por membrana
· Incorporação
-Procedimentos convencionais
· Definem gêneros e espécies de bactérias e fungos
· Tornam-se métodos de referência e confirmação
-Caracterização física macroscópicas
· Temperatura ótima de crescimento
· Morfologia colonial em meio de cultura sólido
-Características microscópicas
· Coloração de gram
· Metabolismo bacteriano (provas bioquímicas) → pode identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras pela verificação das transformações químicas que ocorrem em determinado substrato, pela ação de uma enzima de um dado microorganismo. Podem ser utilizadas para caracterização dos mo.
· 1. Produção de catalase empregada para diferenciar Staphylococcus (catalase positivos), Streptococcus (catalase negativos), Lactobacillus e Erysipelothrix (catalase negativos), Listeria e a maioria dos Corynebacterium (catalase positivos).
· 2. Prova da citocromo-oxidase: As enterobactérias são oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos.
· 3. Utilização do citrato como única fonte de carbono - Alguns microrganismos como a E. coli não possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da célula, não conseguindo portanto crescer no meio contendo como única fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. 
· 4. Prova da produção de urease - A urease é uma enzima que degrada a uréia em duas moléculas de amônia e uma de anidrido carbônico. Os organismos do gênero Proteus são urease positivos diferentemente da maioria das enterobactérias.
· 5. Prova da produção de indol - O indol é resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase.
· 6. Prova da fermentação de carboidratos 
· 7. Prova do Vermelho de metila (VM) – prova efetuada para determinar a capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produção e estabilização de altas concentrações de produtos finais ácidos. Serve para diferenciar organismos entéricos, em particular E. coli de E. aerogenes.
**Diferentes espécies podem apresentar morfologia e metabolismo semelhantes; a identificação requer a observação de um conjunto complexo de características
-Sistemas rápidos 
· Necessitam de 2/4h de incubação
· Métodos independentes do tempo de geração
· Utilização de substratos com enzimas pré-formadas
-Sistemas automatizados de identificação
-Aglutinação
-Imunoensaios → podem ser considerados como métodos que incorporam antígenos ou anticorpos como reagentes para determinar a presença de seus antígenos ou anticorpos em uma variedade de meios
· EIA:Incorporam sistema enzima-substrato. Ex: ELISA antígeno ou anticorpo é absorvido em um suporte sólido
· RIA (imunoensaio radioativo) 
-Maldi-Tof MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)
· Ionização branda permite a obtenção de espectros de proteínas grandes em mo intactos
· O espectro de massas obtido 
· É único do mo 
· Corresponde a proteínas solúveis de alta abundância incluindo proteínas ribossomais e de choque térmico
· Comparação com uma biblioteca de espectros conhecidos
2) Identificação genotípica
-Hibridização
-PCR
· Análise de contaminação por Salmonella em ovos do tipo colonial através da reação em cadeia da polimerase
-RT-PCR
· RT-PCR SYBR-GREEN → corante fluorescente não específico. Intercala-se em qualquer fita dupla 
· Baixo nível de quantificação gênica
· Intercala fita dupla de DNA formada durante PCR
· Não precisa de sonda (reduz custo e tempo) → necessário saber se os primers PCR são bem desenvolvidos e a reação bem caracterizada
· Pode gerar falsos positivos (se liga a todas as fitas duplas)
· RT-PCR – Taqman 
· Alto nível de quantificação, alta reprodutibilidade, alta especifidade
· Hibridização específica entre alvo e sonda
· Não precisa de processamento pós-PCR (↓gastos com materiais e custos)
· Desvantagem: precisa de diferentes sondas para sequências diferentes
-Detecção de surtos e contaminação
· Técnicas utilizando PCR
· RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA) → utiliza primers arbitrários, com curtas sequências (9-10 bases), anelamento em regiões aleatórias do DNA cromossômico. Possui baixa reprodutibilidade e padronização.
· Rep-PCR (Repetitive extragenic palindrom) → utiliza elementos repetitivos extragênico (palíndromos) conservados no genoma numa espécie bacteriana. Funções propostas: papel de terminação de transcrição. Estabilidade do mRNA e organização de domínios cromossomais. Amplifica as sequências de DNA entre os elementos repetitivos. 
· PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoresis)
· MLST (Multilocus sequence typing)
· Analisa a sequência de variação de genes housekeeping
· S. aureus:  carbamato kinase (arcC), chiquimato desidrogenase (aroE), glicerol kinase (glpF), guanilato kinase (gmk), fosfato acetil transferase (pta), triosefosfate isomerase (tpi), acetil coenzima A acetil transferase (yqiL)
· Vibrio vulnificus: glucose-6-fosfate isomerase (glp), DNA gyrase (gyrB), malato-lactato desidrogenase (mdh), metionil-tRNA sintetase (metG), fosforibosilamino- imidazol sintetase (purM), treonina desidrogenase (dtdS), diaminopimelato descarboxilase (lysA), transidrogenase subunidade alfa (pntA), disidroorotase (pyrC) e triptofanase (tnaA). 
· Então o número e tipo de genes housekeeping analisados para o MLST diferem de espécie para espécie
Conservantes
-Definição: qualquer substância capaz de impedir alterações promovidas por agentes microbianos ou contaminação por estes 
-Usos
· Preparações não estéreis: formas líquidas e semi-sólidas
· Estéreis: injetáveis multidose e colírios
· Cosméticos: base aquosa
-Características ideais de um sistema conservante
· Largo espectro de atividade em ampla faixa de pH durante a meia vida do produto;
· Ser efetivo sobre cepas específicas e microbiota natural;
· Distribuir-se de forma apropriada em sistemas emulsionados;
· Ser compatível com componentes da fórmula, sem interferir nas características organolépticas ou na embalagem;
· Ser atóxico e não irritante;
· Custo aceitável;
· Manter atividade antimicrobiana na presença de outros insumos da fórmula;
· Não decompor durante a esterilização;
· Apresentar ação biocida.
-Fórmula deve ser um “ambiente hostil” para os mo
-Classe dos conservantes → monografias específicas
· Quartenário de amônio
· Álcoois,
· Ácidos orgânicos
· Halogenados
· Fenois 
· Éster de ácido benzoico (parabeno¾ de uso)
-Toxicidade e usos
· Parabenos
· Dermatite de contato por parabenos, formaldeído, quartenários, bronopol
-Falhas de conservação
· Descoloração
· Formação de odores
· Atividades reológicas
· Instabilidade de emulsões (quebra)
· Adaptação microbiológica
-Controle microbiológico
· Proteger o consumidor
· Proteger o produto
· Reputação da empresa
-Fontes de contaminação
· Mo presentes no ar
· Matérias-primas
· Água
· Pessoal
· Equipamentos
-Medidas de controle
· Adoção de BPF → paramentação (uso de EPIs), treinamento de pessoal, uso de POPs 
· RDC 210/03
-Fatores de influência
· Interação entre sistemas conservantes e componentes da fórmula
-Desenvolvimento de uma fórmula
· Conservante deve apresentar amplo espectro de atividade em baixas concentração e temperatura de estocagem;
· Características de partição em sistemas bifásicos em função do pH;
· Estabilidade, toxicidade e potencial sensibilizante do composto;
· Componentes da fórmula com nível significante de contaminantes e aqueles que podem atuar como substrato;
· Embalagens que evitem o acesso de contaminantes e a inativação do agente devido a sorção ou complexação;
· Forma de aplicação; 
· Meia-vida
· “A fórmula deve ser desenvolvida visando evitar a contaminação estando sempre atentos aos fatores que propiciam o desenvolvimento de microrganismos contaminantes (ex: atividade de água, potencial óxido-redução etc)
-Avaliação da eficácia de conservantes
· Fundamento: incorporação das substâncias em caldo ou meio sólido de cultura e medir a capacidade inibitória do crescimento de cepas padrões
-Métodos de medida de crescimento microbiano
· Turbidimétrico
· Emprega-se espectrofotômetro
· Pode ser usado para bactérias (1h) e fundos (2-6h)
· Desvantagens: ppt, aglomeração celular ou lise rápida
· Radiométrico
· Meio de cultura contendo materiais radioativos 14C, durante o metabolismo do microrganismo ao ocorrer a degradação da fonte de C libera 14CO2 no ambiente;
· Importante: alimentos, fluídos biológicos e água
· Microeletroforese de partículas
· Ação dos conservantes modifica a carga da superfície microbiana
· Microcalorimetria
· Produção de calor durante o metabolismo microbiano
· Filtração associada à epifluorescência
· Filtração em membrana e coloração alaranjado de acridina (RNA:vermelho e DNA amarelo-verde);
· Baixa sensibilidade
· Bioluminescência
· Determinação quantitativa de ATP
· Elétrico
· Recente, MO conhecidos para os quais os parâmetros de crescimento já são conhecidos;
· Fundamenta-se na medida de parâmetros elétricos: condutância, impedância, capacitância e resistência;
· Vantagens: rapidez, menor custo, menor erro (automatização), preparação mínima da amostra, aplicável a qq. tipo de amostra, equipamentos simples de operar e maior número de ensaios simultâneos;
· Desvantagens: curvas de calibração, limite de sensibilidade, cultura mista, não apropriado para fungos.
-Testes de desafio
· Essencial para assegurar a segurança de produtos multidose
· Tipo de conservante usado no produto;
· Concentração: efeito ineficiente, toxicidade, alto custo;
· Teste não é obrigatório na rotina industrial;
· Recomendado apenas para o desenvolvimento de produtos.
· Organismos teste → cepas padrões → abrangência morfológica e metabólica, comparação
· Organismos isolados: podem ser resistentes ao sistema conservante;
· Cultura mista;
· Cultura pura: detectar a velocidade de morte e mapear o perfil de resistência de cada produto;
· Reinoculações de cepas: capacidade dos sist. conservante frente a desafios consecutivos.
-Sistemas de recuperação
· Diluentes e meio de cultura devem ter a capacidade de inativar o conservante;
· Devem possibilitar a recuperação de células danificadas;
· Devem conter agentes dispersantes de amostras emulsionadas;
· Meio de cultura deve propiciar crescimento rápido dos MO.
-Inativadores de conservantes adicionados em diluentes ou meio de cultura
Controle de qualidade microbiológico de produtos não estéreis
-São produtos nos quais se admite, conceitualmente, a presença de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização → produtos cosméticos, produtos de administração oral ou tópica → esses produtos, em condições ordinárias de uso terão contato com áreas portadoras de microbiota natural constituídas por saprófitas em número por vezes elevado.
· VO → a boca em si já não é estéril (assim como a pele)
· Em casos de feridas abertas, queimaduras → cuidado pois pode ser um caminho para se chegar à sepse 
**Saprófitas → seres que se alimentam absorvendo substâncias orgânicas normalmente provenientes de matéria orgânica em decomposição.
-Para que os mo presentes nos medicamentos/cosméticos possam causar doenças, é necessário que eles superem obstáculos
· Capacidade de defender-se contra mecanismos de defesa do hospedeiro
· Pele: lisozima
· Sobreviver à passagem pelo ambiente ácido do estômago
· Colonizar superfície de mucosas (boca, trato respiratório, olhos, trato gastrointestinal, trato uropatogênico)
· Exclusão competitiva
· Elaborar produtos tóxicos
· Produção de produtos tóxicos
**Em ambiente de estresse o mo pode se adaptar utilizando fatores sigma alternativos, que vão regular a expressão gênica do mo.
· E. coli: Fator Sigma-38 (RpoS) - subunidade de RNA polimerase bacteriana - regula mais de 30 proteínas (RpoS: efeitos na fase estacionária permite sobrevivência em pH 2,5; responsável pela indução de genes que controlam a síntese do glicogênio, a termo-tolerância, a resistência ao peróxido de hidrogênio, a sobrevivência a falta de nutrientes, estresse osmótico etc).
· S. aureus: a regulação da transcrição ocorre durante a colonização, quando muitos genes de virulência devem estar downregulated. → agr (accessory gene regulator): é um locus quorum sensing que controla expressão de vários fatores de virulência e colonização em S. aureus. Ex: downregulation de agr está associado com colonização, e a ativação do agr com invasão do hospedeiro.
-A atenção no controle de produtos não esteréis assegura que a carga microbiana (quali ou quanti) no produto não comprometa sua qualidade final ou segurança do paciente. 
· Risco ao consumidor: 
· Saprófitas – agentes infectantes oportunistas (deterioração de produtos) – TOLERA-SE CARGA MICROBIANA!!!
· Patogênicos (Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus) – risco de quadro clínico infeccioso – PROIBITIVO A PRESENÇA!!!
-De acordo com a via de adm → os produtos farmacêuticos podem causar infecção dependendo da carga microbiana
· VO → dependendo da espécie, é necessário número elevado. Ex E. coli 106-107; Salmonella sp. 102-103 (em crianças 2x102
· Tópica → 106, 102 quando pele traumatizada. Ex: Pseudomonas aeruginosa em soluções, desinfetantes, cremes e pomadas
-Resistência do hospedeiro
· Pacientes com leucemia, diabetes, AIDS, submetidos a cirurgia, traumatismos (queimaduras, uso de cateter, etc)
-Objetivo principal do controle de qualidade microbiológico
· Assegurar a ausência de mo patogênicos
· Determinar o número de viáveis de acordo com a utilização do produto
· A carga microbiana afeta diretamente a estabilidade do produto, podendo afetar a perda da eficácia terapêutica
· Degradação do PA
· Parâmetros físicos (pH)
· Produção de gases 
· Quebra de emulsões
· Alteração da viscosidade 
-Fatores que afetam a carga microbiana
· Fórmula
· Compostos ricos em nutrientes
· Uso de conservantes
· Matérias primas contaminadas
· Embalagens
· Armazenamento e uso do produto etc
· pH → faixa de pH
· Atividade de água 
· Influencia diretamente a nutrição dos mo
· Qualidade da água
· Processo
· Temperaturas elevadas
· Secagem
· Água de condensação
-Limites microbianos → Monografias farmacopeicas específicas determinam os limites 
· Limites de mesófilos varia geralmente entre 102 e 103g (mL)
· Ausência de MO patogênicos 
· Staphylococcus aureus;
· Escherichia coli;
· Salmonella spp;
· Pseudomonas aeruginosa ou Pseudomonas spp. 
· Aspergillus spp (fitoterápicos).
-Parâmetros de controle microbiológico para produtos de higiene pessoal,cosméticos e perfumes (Res 481/99) 
-Métodos de análise 
· Amostragem
· Representativa
· Abrangência do volume contido
· Número de unidades
· Operações unitárias com risco de contaminação
· Conceitos estatísticos: “Millitary Standard” √N ou N+1 
· Coleta e transporte 
· Operador treinado
· Recipientes e material auxiliar adequado
· Transporte em temperaturas adequadas
· Quantidade a ser analisada
· Dependerá das análises a serem realizadas
· Geralmente as farmacopeias recomendam 10g (mL) pesquisa de patógenos e 10g (mL) p/ contagem
Controle de Qualidade de produtos estéreis 
-Área limpa 
· Local onde suprimento e distribuição do ar, filtragem e materiais de construção e procedimentos de operação visam reduzir a introdução, geração e retenção de contaminantes em seu interior.
· Deve atender aos níveis apropriados de classificação de acordo com as normas técnicas vigentes
-RDC 17/2010 → boas práticas de fabricação de medicamentos
-Produção de produtos farmacêuticos esteréis e ensaios de esterilidade devem ser realizados numa área limpa GRAU C, que deve ter um equipamento de fluxo unidirecional GRAU A
-Biossegurança – Cabines de segurança
· Classe I → ventilada com fluxo de ar no ambiente de trabalho e saída com filtro HEPA, luz UV 
· Protege: operador de produtos químicos, pó e alérgeno; meio-ambiente 
· Não protege o produto
· Classe II → tipos A e B
· Protegem: operador (fluxo de ar vertical ou horizontal); ambiente (ar filtrado com filtros HEPA) e produto (exaustão com filtros HEPA)
· Classe II → tipo B
· Mínimas quantidades de produtos químicos tóxicos e traços de radionucleotídeos
· Agentes de risco biológico dos grupos 1,2 e 3
· Drogas antineoplásicas, material genético
· Classe III → isoladores
· Totalmente fechadas com exaustão completa e duplamente filtrada
· Trabalho feito com luvas ligadas por mangas
· Pressão positiva para trabalhos com estéreis e negativa quando com patógenos nível 4 
· Presença de túneis
**As cabines devem ser revisadas de 6/6 meses para proteger produto e operador**
Esterilidade
- Ausência total de formas viáveis
- Matematicamente é difícil de assegurar 
- Condições de esterilidade de um produto deve ser considerada com base no fato que o mesmo tenha sido processado em condições ótimas e que o resultado de uma amostra representativa, submetida ao teste, indique a ausência de mo viáveis
-Aspectos estatísticos
· Ideal seria aplicar o teste a todo lote
· Resultados são determinados tanto pelo número de amostras como pela incidência de contaminação no lote
· Número de unidades a ser testada depende do tamanho do lote e do tipo de produto (a probabilidade de aprovar um lote contaminado é reduzida com o aumento do tamanho da amostra).
· Em se tratando de matéria-prima, cada embalagem deve ser submetida à amostragem. Por outro lado, a abertura de todos os frascos de MP estéril nem sempre é possível, para tal sugere-se como critério de amostragem a aplicação da fórmula √N+1, sendo N o número de recipientes pertencentes ao lote. Para o mesmo caso a OMS recomenda a fórmula 0,4√N.
· Para insumos farmacêuticos, medicamentos e correlatos o número de amostras de um produto deve ser no mínimo 20 ou 10 % do número de unidades que constituem o lote, se este for inferior a 199 unidades. 
-Aspectos microbiológicos
· Meio de cultura: caldo caseína-soja e caldo tioglicolato (tóxico para células fragilizadas)
· Tempo e temperatura de incubação
· Natureza do produto → pomadas oftálmicas (células microbianas podem estar na matriz do produto, extração com solvente como miristato de isopropila, ou propiciar o contato do contaminante com fatores nutricionais do meio de cultura.
· Presença de conservantes → remoção (células microbianas expostas ao efeitos de antimicrobianos são agredidas de forma sub-letal – o teste de esterilidade falha em não incorporar algum mecanismo de recuperação para estas células, porém permite tempo para sua restauração, diferentemente dos métodos rápidos
-Meios de cultura
· Tioglicolato fluído: bactérias anaeróbias e aeróbias
· Caseina-soja: fungos e bactérias aeróbias
· Meios acima adicionados de neutralizantes
· Penicilinase – 1%
· Polissorbato 80 – 1% 
· Azolectina 0,5% e polissorbato 80 – 0,4%
-Controle dos meios 
· Esterilidade: incubação por 7 dias a 30°C – 35°C 
-Procedimentos
· Método direto ou de inoculação
· Transferência asséptica do produto a ser examinado para o meio de cultura e incubação nas diferentes condições por 14 dias
· Filtração por membrana 
· Membrana é transferida para os meios de cultura
· Deverá ser diluída em fluído estéril adequado
** Pode se realizar testes moleculares para estéreis 
-PFGE → semelhanças entre cepas, se elas já foram identificadas anteriormente 
-RT-PCR → detecção de cepas (1h)
** Teste em placa → demorado (5-8 dias) no mínimo → nem todos crescem em meio de cultura → em estéreis não pode haver crescimento
Ensaios para detecção de pirogênio
-Definição
· Substâncias provenientes de mo vivos ou mortos, intactos ou desintegrados, patogênicos ou não
· Substâncias provenientes do metabolismo bacteriano como proteínas desnaturadas, endo ou exoproteínas
· Quando adm via endovenosa causam reação febril 
-Reações pirogênicas
· Semelhantes a uma forte resposta alérgica
· Dores lombares e nas articulações, calafrios, náuseas, dor de cabeça, distúrbios gastrintestinais, liberação de histamina, etc
· Endotoxinas são tóxicas à maioria dos mamíferos
** Bactérias gram + → exotoxinas ptns desnaturáveis pelo calor 
**Bactérias gram - → produzem exotoxinas, mas as mais importantes são as endotoxinas (LPS presente na membrana externa)
LPS é o PADRÃO em testes! (Especialmente E. coli)
ENDOTOXINAS (LPS)
Região III: cadeias longas de carboidratos (sequências de açúcares simples – manose, galactose,etc) antígeno O
Região II: centro polissacarídico comum a maioria das bactérias
Região I: Lipídeo A região de âncora que liga o LPS a membrana externa. Formado por glicopeptídeo incomum composto de dissacarídeo ligados a cadeias curtas de ácidos graxos e grupos fosfatos
-Propriedades das substâncias pirogênicas
· Parte externa: hidrofílica
· Parte interna: hidrofóbica (lipídeo A)
· Hidrossolúveis, não voláteis, termoestáveis (destruídas pelo calor a 200°C/1h ou 250°C/30 min)
· Hidrolisáveis em meio ácido ou alcalino como fosfato trissódico
· Destruídos por agentes oxidantes como permanganato de K, mistura sulfocrômica, H2O2
· Fixados por adsorção em carvão ativo, asbestos, argila
-Origem das substâncias pirogênicas
· Matéria prima usada na produção
· Veículo (água...)
· Utensílio e acessórios
· Recipiente para acondicionamento do produto
· Preparo: com lentidão, ambiente inadequado, higiene pessoal inadequada
-Devem ser analisados
· Todos os injetáveis (grande e pequeno volume)
· Acessórios para transfusão, infusão
· Todos os dispositivos implantáveis ou descartáveis empregados em terapia parenteral
· Produtos na forma de aerossol para uso respiratório
**Potencial de periculosidade é maior quando se trata de injetável de uso exclusivo por VI → risco será ainda maior quando se trata de produto com inoculação intratecal (endotoxina 1000 vezes mais potente que na VI)
-Obtenção de produtos apirogênicos
· Garantir condições de higiene em todo processo produtivo 
-Processo de despirogenização 
· Endotoxina é notoriamente resistente à destruição pelo calor, dissecação, pH, extremos e vários tratamentos químicos 
· Inativação 
· Detoxificação da molécula de LPS usando tratamentos químicos que quebrem pontes lábeis ou bloqueiem sítios necessários à atividade pirogênica
· Hidrólise ácida: HCl 0,05N 30min a 100ºC ou ácido acético glacial 1,0% 2-3h a 100ºC despirogenização de materiais
· Oxidação: - Peróxido de hidrogênio – dependente do tempo, pH e concentração; inativa em condições não extremas – conc 5% outros: Hipoclorito, Permanganato de potássio diluído, Ácido nítrico 
· Alquilação: anidrido acético e succínico, ou óxido de etileno. 
· Outros processos que levam à inativação de endotoxinas: tratamento por calorseco, radiação ionizante e tratamento com o antibiótico polimixina B.
· Para materiais resistentes à temperatura, como frascos de vidro e instrumentos metálicos, o método de escolha para inativação de endotoxina é o tratamento por calor seco obtido em estufas ou túneis de convecção, condução ou irradiação (Infravermelho). 
· Remoção
· A remoção de endotoxinas pode ocorrer por diferentes métodos, baseados em características físicas da endotoxina: tamanho, peso molecular, carga eletrostática ou afinidade da endotoxina a diferentes superfícies
· lavagem com água estéril para injeção USP, 
· destilação, 
· ultrafiltração (o tamanho da subunidade básicado LPS é cerca de 10.000 a 20.000 daltons), 
· osmose reversa, 
· adsorção em carvão ativo ou em asbestos, 
· atração eletrostática,
· membrana hidrofóbica
-Ensaios de pirogênio in vivo 
· Não pode ser feito em ratos → LPS é tóxico para os roedores 
· O teste é realizado e no coelho → sistema termorregulador responde muito mais
· Cachorro → possui um sistema termorregulador que traria mais resultados falso negativos, enquanto com o coelho, tem-se mais resultados falso positivos
· Raça não importa muito, preferem os albinos por serem mais fáceis de manipular
· Sexo: Não interessa (não há interferência da fase hormonal) → fêmeas são mais dóceis 
· Jovem: são muito menos sensíveis 
· Simulação do teste para condicionar o animal à lida 
· Mesmas condições, com exceção à injeção
· Medida de temperatura retal
· Lubrificação com geléia de petróleo 
· Termômetro clínico ou elétrico
· Manutenção
· Não usar animal mais que uma vez em 48h ou em duas semanas se temperatura tiver aumento de 0,6°C
· Dieta restrita de 85g/dia
· Alimentação após o teste ser completado, deixando-o bem alimentado, para o teste do dia seguinte
· Engaiolados individualmente a 20-23°C
· Ambiente livre de estresse (coelhos são muito sensíveis, estresse provocará aumento de temperatura)
· Teste
· Pesagem dos animais para determinação de dosagem certa (10mL/kg)
· Temperatura normal: 38,9-39,8°C 
· Aquecimento das soluções a 37°C
· Seringas, agulhas e vidrarias → 250°C/30 min
· Assepsia da via marginal com álcool 70% 
· Leitura da temperatura 1,2 e 3h
· Interpretação: 
· países europeus: cada amostra deve ser avaliada em um grupo de três animais e quando a soma das elevações térmicas individuais máximas for inferior a 1,15 °C a amostra será aprovada e caso seja superior a 2,65 °C será rejeitada. Quando o valor da somatória estiver entre estes valores, a amostra será injetada em outros três animais.
· USP: se nenhum coelho apresentar um aumento individual de temperatura de 0,5 °C ou mais, acima da respectiva temperatura de controle, o produto atende aos requisitos para ausência de pirogênio. Se o aumento individual for 0,5 °C, o ensaio deve ser repetido em outros cinco coelhos. Se no máximo três dos oito coelhos mostrarem aumentos individuais de temperatura de 0,5 °C ou mais, e se a soma dos oito aumentos máximos individuais não exceder 3,3 °C, o produto atende aos requisitos para ausência de pirogênio.
· Algumas drogas não podem ser testadas:
· AAS
· Clorpromazina
· Hipnóticos
· Anestésicos
· Substâncias tóxicas
-Ensaios de pirogênio in vitro
· LAL ( limulus amebocyte lysate)
· Células sanguíneas de Limulus → em contato com LPS o sangue do Limulus coagula → apenas atuará em respostas gram - → como costumam ser as que causam mais problemas, LAL é um bom teste
· Mais barato do que criar coelhos 
· Formação de coágulo é rápido
· Resultados falso negativos para o LAL 
· Agentes desnaturantes
· Soro ou plasma
· pH <3 ou >9
· Íons cálcio > 0,67 M
· Lipídios , emulsões para infusão
· Glutationa, acetil cisteína
· Cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina, penicilinas semi-sintéticas
· Bactérias gram + 
· ELISA 
· Método turbidimétrico quantitativo
· Baseado no fato de que qualquer aumento na concentração de endotoxinas causa um aumento proporcional na turbidez devido à precipitação de proteína coagulável (coagulogênio) no lisado.
· Procede-se à leitura da densidade óptica de várias diluições da substância a ser analisada contra curva-padrão e são obtidas medidas quantitativas de endotoxinas, em grande faixa de concentrações	
· Detecção variando de 6 a 200 pg/mol 
· Método colorimétrico de proteína
· Quantidades de amostra e lisado são misturadas incubadas por 1h a 37°C e centrifugadas. No sobrenadante, a proteína do coagulogênio é determinada pelo método de Lowry (espectofotômetro 660 nm)
· Método cromogênico quantitativo 
· Ao serem consumidos por enzimas geram produtos	coloridos solúveis ou insolúveis
· Quantificação do produto – espectofotômetro, cor visual ou comparação com padrão
· Depende do tipo da enzima utilizada
· Substrato composto por um pequeno peptídeo ligado pela arginina C-terminal a uma molécula do cromóforo p-nitroanilina (p-NA) → uma vez ativada a reação enzimática em cascata, a enzima de coagulação provoca a liberação da molécula pNA de cor amarela (proporcional à concentração de endotoxina, 405 nm)
· Método nefelométrico
· Usado em soluções parenterais de grande volume
· Baseado na dispersão relativa da luz → nefelômetro a laser 
· Não tem se mostrado promissor 
· Teste de ativação de monócitos 
· Introduzido na farmacopeia europeia em 2010
· Detecção de pirogênios com base na ativação de monócitos (MAT) os quais produziriam citocinas na presença de pirogênio (IL-1β) 
· Reação de defesa imunológica inata detectada por meio de ELISA, envolvendo anticorpos específicos e mudança de cor enzimática
· Utiliza sangue humano integral (congelado ou fresco), reproduz a resposta imunológica inata a uma reação de febra causada por pirogênios
· Principais usos: biomateriais, parenterais, análise de pirogênios no ar, medicamentos imunomoduladores, tóxicos, quimioterápicos
· Vantagens: 
· não utiliza animais
· Excelente correlação, alta sensibilidade, reflete a potência do contaminante para os humanos
· Possibilidade de usar sangue criopreservado
· Utiliza ELISA para detecção das citocinas
· Desvantagens:
· Uma vez que usa sangue humano deve se ter o controle dos doadores (se estiverem com alguma doença, podem já estar com níveis ↑de interleucina)
· Doadores diferentes 
· Não há forma de preservar os monócitos → não é possível fabricar kits para venda (quando for possível, é possível que ultrapasse os outros dois mais utilizados) 
25