Espetroscopia de Emissão por Fluorescência Molecular

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ESPETROSCOPIA DE EMISSÃO POR FLUORESCÊNCIA
MOLECULAR
Ciências Biomédicas Laboratoriais 2020/2021 Cristiane Matacano, Eunice Castelo, Leonor Morcela, Mafalda Rodrigues
MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISE EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Introdução
Propaga-se a diferentes comprimentos de onda e frequências 
o que leva a agrupá-las em diferentes tipos de radiação
Radiações Ionizantes
• Infravermelhos
• Luz visível
• UV
• Raios gama
Radiações não ionizantes
• Ondas rádio
A radiação consiste na propagação de energia no espaço, e como está associada a fenómenos elétricos e magnéticos, designa-se 
por radiação eletromagnética. É detetada por “pacotes” de energia designados por fotões
Espetro da Luz Visível 
A luz branca do Sol pode ser decomposta em várias cores por um prisma de vidro
Ela é policromática (várias cores) ou monocromática ( 1 única cor)
Espetro contínuo
Espetro descontínuo de emissão
Espetro descontínuo de absorção
O resultado de decomposição
da luz designa-se como espetro
da luz visível. Este divide-se
em:
Espetro Descontínuo e a sua Relação com as Estruturas Moleculares e
Atómicas
Fluorescência 
Luminescência 
Consiste na emissão de energia eletromagnética por um material
Quimiluminescência
A fonte de energia provém de uma reação química
Fotoluminescência
A excitação é feita pela absorção de fotões.
Fosforescência. 
Quando um átomo exposto a uma radiação, estes absorvem-nas e tornam-se excitados, o que pode provocar 
transições eletrónicas, de um nível inferior para superior (espetro de absorção) e contrário (espetro de emissão).
Spin eletrónico 
A nuvem eletrónica é uma zona exterior ao núcleo associada a uma probabilidade elevada de encontrar um 
eletrão. Esta divide-se em várias orbitais com características específicas e podem ser:
Com base no princípio de exclusão de Pauli, a propriedade spin consiste nessa probabilidade de localizar o 
estado quântico de um eletrão. Este estabelece que na mesma orbital não podem coexistir dois eletrões no 
mesmo estado quântico e que estes devem estar em sentidos opostos
Spin eletrónico 
Principal diferença entre a fluorescência e fosforescência 
Consiste na excitação do estado fundamental singlete de um eletrão para um nível superior de energia.
Na fluorescência
No estado excitado singlete, o spin do
eletrão na orbital excitada mantém a
sua orientação o que torna o processo
de retorno do eletrão para o estado
fundamental mais rápido.
Na fosforescência
Por ocorrer inversão do sentido 
da rotação do spin, o processo é 
mais lento.
A EMISSÃO DE ENERGIA ELETROMAGNÉTICA 
POR FLUORESCÊNCIA MOLECULAR
A fluorescência molecular é o fenômeno pelo qual uma 
substância absorve luz quando exposta a radiações intensas 
do tipo UV, raios X, e emiti-as em forma de luz visível, ou 
seja, com um comprimento de onda maior que o da radiação 
incidente.
A emissão de energia eletromagnética por fluorescência molecular
Os processos não radiativos 
Conversão interna Desativação colisional Cruzamento intersistemas
Resulta num 
mecanismo não 
radiativo no qual 
ocorre a relaxação do 
estado excitado
Na desativação colisional 
ocorre colisões entre as 
moléculas excitadas que 
provocam a transferência de 
energia não radiativa 
Resulta da mudança do 
estado de spin da molécula, 
no qual ocorre a conversão 
↑↓ em ↑↑
Vias não radiativas, nas quais a energia de excitação é transferida na 
forma de vibrações, rotações e translocações moleculares.
Variáveis que afetam a fluorescência
Ambiente químico Estrutura molecular
Determinam a intensidade de emissão e quando luminescência ocorrerá
Os grupos aromáticos, os compostos alifáticos ou alicíclicos são substâncias que exibem fluorescência, e estas tem 
que apresentar certas características como: 
§ Alta sensibilidade
§ Interferências de matriz
§ Poucas substâncias
§ Detetores para cromatografia a liquido e eletroforese capilar
Rendimento quântico 
O rendimento quântico consiste na razão dos fotões emitidos
sobre os fotões absorvidos pelas estruturas moleculares.
Φ =
𝑓𝑜𝑡õ𝑒𝑠 𝑒𝑚𝑖𝑡𝑖𝑑𝑜𝑠
𝑓𝑜𝑡õ𝑒𝑠 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑣𝑖𝑑𝑜𝑠
Fatores que afetam o rendimento quântico
• Radiação UV-VIS
• Espectro de absorção da espécie observadora
• pH
• Temperatura
• Solvente
• Concentração da espécie observadora
• Concentração de O2 dissolvido
Materiais usados
Espectrofotômetro de fluorescência Cary Eclipse
Este aparelho pode medir fluorescência, fosforescência, 
quimiluminescência e bioluminescência.
É ideal para medições fluorescentes em ciências biológicas, 
biotecnologia e oferece espectroscopia de fluorescência 
adequada para amostras fotossensíveis.
A recolha de dados rápida permite medições cinéticas em 80 
pontos de dados por segundo, enquanto que a fibra ótica 
permite medições de amostras remotas.
Materiais usados
BioSpectrometer
O BioSpectrometer de fluorescência oferece as
funções de um espectrofotômetro UV / Vis, além
da opção de determinar concentrações muito
baixas de biomoléculas usando corantes
fluorescentes.
Conclusão
Referências bibliográficas 
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https://www.thermofisher.com/pt/en/home/life-science/lab-equipment/microplateinstruments/microplate-
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