Estudo dirigido Western Blot, Biologia Molecular, Bioinformática e NCBI

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1. Sobre a técnica, de western blotting (WB), quais as suas aplicabilidades? 
O western Blotting tem diversas aplicabilidades, é possível utilizar o WB para analisar o 
tamanho e quantidade de uma certa proteína, diagnóstico de doenças em humanos e animais, 
teste confirmatório para o HIV, detectando anticorpos anti-HIV no soro do paciente, detecção 
de proteínas defeituosas. É possível utilizar o WB também para observar a presença de 
modificações pós-traducionais em proteínas. 
 
2. Quais as etapas gerais que são necessárias para a realização do WB? 
São cinco as etapas gerais necessárias para a realização do WB: extração das proteínas, 
eletroforese em gel de poliacrilamida, utilização de membranas de transferência para isolar as 
proteínas, incubação da membrana com um anticorpo específico para detectar a proteína de 
interesse, utilização da membrana para análise dos dados. 
3. O que faz com que as proteínas fiquem com carga para se deslocar através do gel em direção 
ao polo positivo? 
O dodecil sulfato de sódio (SDS) é um detergente que engloba a proteína deixando ela 
com carga negativa para assim ela se deslocar em direção ao polo positivo. 
4. Como se escolhe o anticorpo primário? E o secundário? 
O anticorpo primário deve reconhecer especificamente a proteína de interesse (ou 
parte dela). Se ligando a ela diretamente. Já o anticorpo secundário deve reconhecer porções 
especificas do anticorpo primário e esse anticorpo secundário normalmente é ligado a uma 
enzima reveladora como a fosfatase alcalina. 
5. Cite os reagentes e a descrição da técnica passo a passo ( pode escolher uma aplicação , por 
exemplo: detecção de HIV). 
As proteínas e glicoproteínas virais, que atuam como antígenos, são separadas por 
eletroforese – em gel de poliacrilamida, segundo seus pesos moleculares – e transferidas para 
a membrana de nitrocelulose. A reação entre o antígeno adsorvido à membrana de nitrocelulose 
e os anticorpos da amostra é revelada por um processo enzimático. Adiciona-se o anticorpo 
primário, composto por uma anti-imunoglobulina humana conjugada com biotina. Adiciona-se 
o anticorpo secundário, que é composto de avidina1 ou estreptavidina ligada a uma enzima. Em 
seguida, adiciona-se o substrato (4-cloro-1-naftol). A degradação do substrato origina um 
produto insolúvel e corado que permite, a olho nu, a visualização da reação sobre a fita. 
6. Para responder as próximas questões,acesse o site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 
 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
 
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). 
Clique em BLAST ( verifique qual a função dessa ferramenta no Google) 
Recorte e cole a sequência abaixo no campo de pesquisa 
 
 1 aattggaagc aaatgacatc acagcaggtc agagaaaaag ggttgagcgg caggcaccca 
 61 gagtagtagg tctttggcat taggagcttg agcccagacg gccctagcag ggaccccagc 
 121 gcccgagaga ccatgcagag gtcgcctctg gaaaaggcca gcgttgtctc caaacttttt 
 181 ttcaggtgag aaggtggcca accgagcttc ggaaagacac gtgcccacga aagaggaggg 
 241 cgtgtgtatg ggttgggttt ggggtaaagg aataagcagt ttttaaaaag atgcgctatc 
 301 attcattgtt ttgaaagaaa atgtgggtat tgtagaataa aacagaaagc attaagaaga 
 361 gatggaagaa tgaactgaag ctgattgaat agagagccac atctacttgc aactgaaaag 
 421 ttagaatctc aagactcaag tacgctacta tgcacttgtt ttatttcatt tttctaagaa 
 481 actaaaaata cttgttaata agtacctaag tatggtttat tggttttccc ccttcatgcc 
 541 ttggacactt gattgtcttc ttggcacata caggtgccat gcctgcatat agtaagtgct 
 601 cagaaaacat ttcttgactg aattcagcca acaaaaattt tggggtaggt agaaaatata 
 661 tgcttaaagt atttattgtt atgagactgg atatatctag tatttgtcac aggtaaatga 
 721 ttcttcaaaa attgaaagca aatttgttga aatatttatt ttgaaaaaag ttacttcaca 
 781 agctataaat tttaaaagcc ataggaatag ataccgaagt tatatccaac tgacatttaa 
 841 taaattgtat tcatagccta atgtgatgag ccacagaagc ttgcaaactt taatgagatt 
 901 ttttaaaata gcatctaagt tcggaatctt aggcaaagtg ttgttagatg tagcacttca 
 961 tatttgaagt gttctttgga tattgcatct actttgttcc tgttattata ctggtgtgaa 
 1021 tgaatgaata ggtactgctc tctcttggga cattacttga cacataatta cccaatgaat 
 1081 aagcatactg aggtatcaaa aaagtcaaat atgttataaa tagctcatat atgtgtgtag 
 1141 gggggaagga atttagcttt cacatctctc ttatgtttag ttctctgcat gtgcagttaa 
 1201 tcctggaact ccggtgctaa ggagagactg ttggcccttg aaggagagct cctccctgtg 
 1261 gatgagagag aaggacttta ctctttggaa ttatcttttt gtgttgatgt tatccacctt 
 1321 ttgttactcc acctataaaa tcggcttatc tattgatctg ttttcctagt ccttataaag 
 1381 tcaaaatgtt aattggcata aattatagac tttttttagc agagaacttt gaggaaccta 
 1441 aatgccaacc agtctaaaaa tgcagttttc agaagaatga atatttcatg gatagttcta 
 1501 aatactaatg aactttaaaa tagcttacta ttgatctgtc aaagtgggtt tttatataat 
 1561 tttcttttta caaatcacct gacacattta atataggtta aaaaatgcta tcaggctggt 
 1621 ttgcaaagaa aatgtattac aaaggctgct aagtgtgtta agagcatact catttctgtt 
 1681 ctccaaaata tttcataagg tgctttaaga ataggtatgt ttttaaaagt taagttccta 
 1741 ctatttatag gaactgacaa tcacctaaaa taccaatgat tacaaacttc cttctggcct 
 1801 tctggactgc aattctaaaa gtgtaaaaaa catattttct gcattaagtt aggcagtatt 
 1861 gcttagtttt caaagtggta ggctttggag tcagattatt ttgattcaga tcctacatct 
 1921 actgtttagt agctctgttg cctgaggcag gtcccttaac atctctgtgt gtgacttgac 
 1981 ctttaaaatt tggagactgt cataggggtt aatcccttga gaaaatgaat gtgaaaagtt 
 2041 agcctaatgt taactgctat tattatggat taccatattt tcacattcat cacagtacat 
 2101 gcaccttgtt aatataagat gctcaattca tctttgagta taattttgtg actctcaatc 
 2161 tggatatgca atgagtgggc ctgtatgaga atttaattta tgaaaaattg tgtttcacat 
 2221 ggccttacca gatatacagg aaacacgtca catgtttcta ttgtatgttg ttaaatgcct 
 2281 tagaatttaa ctttctgaat aggatccctt cagtttgaga gtcataaaag agtaaaatta 
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
 2341 ttatggtatg agttatagat tgtattgaat atctctttat atgtctaggt tttgtcattg 
 2401 gaaaaccaaa aagtttggaa aaaaaatcta agttatttct tactttctta attttgtgtg 
 2461 gatttcacat caagtataaa atttgaagaa catctgaact atcataatcc atatatatat 
 2521 ataaaataaa cataatctaa gagagaattt caccatgaaa aattcaggta gttcatgact 
 2581 atcagagcaa acaagtacat taaattgaaa cttttatgaa aataacattt atgaaatagg 
 2641 aagctatttt taaactagaa gtgatatatt agcatataat ttataattca tatacaagtg 
 2701 ggattgattt ataaatggtc accaacagag attgtgctat ttaatttggg aaaatttttt 
 2761 aaatttacat tttctcacaa cttttaaggt agttattcag tttgttcctc tctgtctctt 
 2821 ctctcatgcc ctgaattttt catatttcgt ttagttgtaa gagtgtatat caaaccgtgt 
 2881 gtcacatgac ataacttgaa ttttcgtcgt gatatctgtg ctatgtctag gtctatactg 
 2941 aggaactgtg ggaaccccac agaatccaag tatacagtgc cactgatttc ttacaaggga 
 3001 tgtggggtct cctgtaaact ctgcagttag tctcaagtaa gaccaaagag taaaatattg 
 3061 ttaggatcta aggtggaaat tcagcaaaga atcacatagt ctaagtctcg agtttaacag 
 3121 taagataatt tgagatactt ttgtaattat taaacacaaa gtaatgagag attttaaaac 
 3181 aaacaaatac acctgaattt atatatcaga ataggtatgg tggttcaaaa tagctatcta 
 3241 ataaaaacca cactcctatt ctaaacattt gcctttgatc aaaataattt tgggtctctt 
 3301 attatgaaat tgcctttcta aataatacat aaatttcttc tcataagtat atattagcca 
 3361 cattatttta ttgttattgt tttatattca tagcttgctt tagattaaaa attatattac 
 3421 ccagactggt ctcttggact tgcttccaag tgacttttga ctgtatcaca aaatcaaatt 
 3481 cactctgaaa atataaagat ttttcatcat aatttccttt gttaacagcc aagtgctacc 
 3541 taattttagg tgttttcatt aaaaaaaaat gcattgcaaa ctttaaagac aattcttttg 
 3601 tttgtttgtt tttaaaagac agagtctcac tctgttgccc aggctagagt gcagtgacac 
 3661 aatcataact cactgcaacc tccacctcct gggctcaagt gagccttcca tcttgcctca 
 3721 cgagtagctg ggtcttcagg tgtacaggtg tgtaccacca tgcctggcta actttttttt 
 3781 tttttaagtt atatagagac agtatctcac tatgttgccc aggctgctct tggagctcct 
 3841 ggcctcaagt tatcctccca ctcagtctcc caaagtgctg ggattacagg cgtaagccac 
 3901 ctcaccctgt cagcctaaag acagtgctta atgaagagaa atataagtgc tttgagcaat 
 3961 ggaagtataa ttaaaattat actatgaaag atttataaag atgaccattt tgaatgggac 
 4021 cacacttatt tggttatata aattatgata cactattaaa aattcatcat gatgattttg4081 tatttacatt ttatttacat gtttgcaatt tgtgaggaaa gctaaaatta tggctaagcc 
 4141 ataaatattt ttgcagtttg ttgagggtgt ttgtaaaagt gttgccaagg aagaccagtt 
 4201 ggctacccaa acaagggttt agtctaggtc tgatcaatac atacacatta tctcaggttt 
 4261 gtctatcaga aaaaccttag gttatccaaa tcaaaataaa atagatgcat aaaacaaagg 
 4321 ccaatatgtg ttgaacaatt atattgtgat atacaactgc caagcattcc cgattaccat 
 4381 gactccattt agtcagtcca tgggcaaatg ccatcaatga ggacagccca gggtttccat 
 4441 attctctctt ggctttacat cctataggaa ttggaggggc ccacctctgg gataggagcc 
 4501 cttctgtctt gaacaatgtt gtctgaacac taacaaatgt tgactttcta caccagtccc 
 4561 tcaatagtct tttctattta tccttttgct gaccatgttt tgttattaca cagttgagat 
 4621 ttttcagctg ggaatctgtg ttaattttgt attaattttg attagcttaa ctctcagagt 
 4681 tctaaaagta cctcctgtac ctgatatatg acaaaaatta taattacatt tatttatata 
 4741 taaaatatct ttgtatatgt aaaatatctt tgtatatata attatataat tgtttctttt 
 
 
 
Clique em “BLAST” 
 
 
Aguarde, sem clicar em nada, para que o programa busque a similaridade da sequência que você inseriu no 
campo de busca com o grande banco de dados deste portal. 
Provavelmente você obterá um resultado similar a este: 
 
 
Registre aqui o que significam TODOS os ITENS que estão apontados com as flechas na figura anterior: 
Flexa 1: Mostra o identificador exclusivo atribuído a esta pesquisa para compartilhamento e relatório de 
problemas 
Flexa 2: nomeia o banco de dados alvo pesquisado 
Flexa 3: é o número de bases da pesquisa atual 
Flexa 4: resultados encontrados no BLAST 
 
Clique no link apontado pela FLEXA 4, e responda: o que significam os dados que você acessou? 
Após apertar na flecha 4 abre uma tela com os dados do alinhamento de bases entre a sequência 
de consulta com a sequência do banco de dados. 
Na tela que apareceu, clique em “GenBank” 
Qual gene que você encontrou com 100% de similaridade com a sequência que você inseriu? 
O gene encontrado foi: Regulador de condutância transmembranosa da fibrose cística (CFTR) 
7. Este gene encontrado está relacionado com alguma doença humana? Para responder esta 
pergunta, pesquise o nome do gene que você encontrou no PUBMED, no site: 
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ 
Esse gene está relacionado com a doença Fibrose cística 
 Clicando nos principais resultados, será possível acessar artigos relacionados, embora alguns destes sejam 
pagos, vários são de acesso livre. Com estes materiais, (use o Google tradutor, se necessário) e responda às 
seguintes perguntas: 
a) Quais as alterações no gene que provocam a doença? 
Uma das alterações no gene que provocam a doença é a mutação ∆F508 que ocorre devido à deleção 
de três bases no éxon 10, resultando na perda do aminoácido fenilalanina na posição 508, acarretando 
deficiência no dobramento da CFTR e, posteriormente, degradação no retículo endoplasmático rugoso. 
b) Qual é o modo de herança desta doença? 
Ela é uma doença autossômica recessiva 
c) Quais são os principais sintomas desta doença? 
Os sintomas podem incluir tosse, infecções pulmonares reincidentes, incapacidade de ganhar peso e 
fezes gordurosas. 
 
8. Com os resultados obtidos no GenBank, responda: 
a) De que organismo foi isolada? 
Humanos, Homo sapiens 
b) Que grupo de cientistas fez o depósito desta sequência no GenBank? Em que 
ano? 
Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, Mirzaa G and 
Amemiya A. Em 1993 
c) Em que local está posicionada a primeira metionina da sequência de 
aminoácidos da proteína? 
Exatamente na primeira posição 
d) Qual o tamanho do RNA mensageiro? 
4800 pares de base 
e) verifique p/ que serve o link Pick Primers, o link Highlight Sequence Features e o 
link Find in this Sequence apresentado do lado esquerdo da tela, quando estiver 
verificando o formato FASTA da sequência. Descreva as informações obtidas. 
Pick Primers é para desenhar primers para essa sequência 
Highlight Sequence Features é para abrir a Barra de recursos de realce e realça 
as anotações de recurso da tabela FEATURES do registro. A barra de recursos 
de realce pode ser usada para navegar e realçar outros recursos e fornece links 
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9606&INPUT_SEQUENCE=NM_000033.3&LINK_LOC=nuccore
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000033.3?&feature=CDS
javascript:Portal.$send('SeqSearchClicked')
para exibir a região realçada separadamente. Os links na tabela FEATURES 
também destacam a região correspondente da sequência. 
Find in this Sequence é para encontrar subseqüências ou padrões na seqüência 
e destaca as regiões correspondentes. A ferramenta funciona com nucleotídeos 
de uma única letra ou códigos de proteínas, incluindo ambigüidades, e pode 
corresponder aos padrões Prosite em sequências de proteínas. 
f) Desenhe o primer, como se fosse amplificar esta sequência na própria 
ferramenta do BLAST 
Forward primer GAGAAAAAGGGTTGAGCGGC 
Reverse primer TCTTTCCGAAGCTCGGTTGG 
g) Este gene é responsável por alguma doença conhecida? Qual? 
Esse gene está relacionado com a doença Fibrose cística 
h) Qual é o modo de herança desta doença? 
Ela é uma doença autossômica recessiva 
 
 
 
 
9. ESCOLHA OUTRA DOENÇA GENÉTICA, (PODE SER ESOLHIDA ATRAVÉS DE UMA 
PESQUISA UTILIZANDO O TERMO “DOENÇAS GENÉTICAS” NO GOOGLE), E 
BUSQUE AS MESMAS INFORMAÇÕES PARA RESPONDER AS QUESTÕES 7 E 8 PARA 
ESTA NOVA DOENÇA!! 
 
A anemia falciforme é uma herança tipo autossômica recessiva, a alteração genica 
que provoca essa doença é o polimorfismo da mutação (GAT→GTG) no gene que 
codifica a cadeia β da hemoglobina. Os sintomas clássicos são fadiga, fraqueza e 
palidez. O gene hemoglobin beta chain foi isolado de humanos Homo sapiens e 
possui um mRNA de 541 pares de base, o grupo que identificou foi Kutlar,F., 
Harbin,J., Brisco,J. and Kutlar,A. em 1999. Os primers feitos são: Forward primer 
TCAGAAAGTGGTGGCTGGTG e Reverse primer GACAGCAAGAAAGCGAGCTTAG