Espectrometria de massas

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Espectrometria de massas
Técnica
	 Uma ferramenta analítica que determina a razão massa/carga de moléculas ionizadas no seu estado gasoso e a possibilidade de informações estruturais destas moléculas;
	Podemos caracterizar uma biomolécula, identificar microrganismos, caracterizar uma proteína;
	Consiste na introdução da amostra  fonte (é o preparo da amostra, onde ela vai ser ionizada e ficar em estado gasoso)  analisador (parte do equipamento que separa as moléculas)  detector (as moléculas mais leves chegam mais rápidos no detector e as maiores chegam mais devagar, quando as moléculas chegam no detector elas promovem uma cascata de formação de elétrons, que vai ser detectada pelo computador, gerando um espectro de massa)  manipulação dos dados  espectro de massas
	Introdução da amostra
	Pode ser utilizado vários tipos de amostras;
	Soluções (amostras líquidas): pode ser utilizado um equipamento de duas fases acoplado, LC (Cromatografia Líquida) e CE (Eletroforese Capilar);
	Termoestáveis (amostras gasosas): GC (Cromatografia Gasosa);
	Compostos voláteis: MMS (Introdução via membrana);
	Amostras sólidas: Inserção direta.
	Fonte de ionização
	Ioniza e torna a amostra volátil;
	EI (“Electron Ionization”): é um bombardeamento de elétrons na amostra, é uma técnica mais bruta que leva a fragmentação da biomolécula, não serve para todas as amostras;
	CI (“Chemical Ionization”): a amostra é exposta a um gás químico, é um pouca mais branda mas ainda gera fragmentação;
	APCI (“Atmospheric Pressure Chemical Ionization”): é uma ionização por pressão atmosférica;
	ESI (“Electrospray Ionization”): é um pouco mais branda, é associada com um solvente e liberada por um spray, menor risco de fragmentar a amostra;
	MALDI (“Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization”): utiliza um ácido orgânico que absorve o lazer emitido e joga a energia para amostra;
	APPI (“Atmospheric Pressure Photo-Ionization”): utiliza pressão atmosférica e luz.
	Analisadores
	Separa as moléculas em função da massa/carga, existem alguns tipos de analisadores;
	Magnéticos-Eletrostáticos BE: é campo magnético e/ elétrico gerado;
	Quadrupolos Q: são barras que geram uma corrente continua e uma radiofrequência que separam as moléculas;
	“Íon-Traps 3D” e “Íon-Traps Lineares” Q-IT: forma uma armadilha dinâmica para as moléculas;
	Tempos de Vôo TOF: avalia o vôo da molécula ionizada em estado gasoso, é emitido um campo elétrico inicial para que jogue as moléculas para um tubo a vácuo onde elas voam por energia sintética e se separam pela massa/carga (moléculas menores passam mais rápidos e moléculas maiores demoram mais);
	Ressonância Ciclotônica de Íons FT-MS
	“Orbitraps”.
	Detectores
	O detector é um multiplicador de elétrons; 
	A molécula chega e dispara uma cascata de elétrons, esses elétrons são amploficados, e em cada amploficação são convertidos em dados através do espectro de massa.
Aplicação
	Determinação de estruturas químicas, principalmente compostos orgânicos pequenos e voláteis;
	Início da década de 80: com o desenvolvimento de equipamentos, como MALDI (matrix assisted lazer desorption/ionization) e ESI (electronspray ionization);
	Começou a ser mais aplicada na análise de moléculas de massa molecular elevada e polares como proteínas e peptídeos.
Características
	MALDI: Matrix Assisted Lazer Desorption Ionization: ionização por dessorção a laser assistida por matriz (é a fonte de ionização);
	Um ácido orgânico recebe o lazer gerado de modo pulsátil, absorve esse lazer e libera a energia do lazer para a amostra, a amostra associada ao ácido orgânico volatiliza e ioniza;
	Ionização suave: analisar biomoléculas intactas e polímeros sintéticos;
	Ampla gama de massas: analisar uma grande variedade de biomoléculas;
	Relativamente tolerante a tampões e sais;
	Rápida aquisição de dados;
	Fácil de usar e manter, sem necessidade de conexão de água ou gás;
	Alta sensibilidade, resolução de massa superior e precisão
Mald-Tof
	É constituído de uma fonte de ionização (Mald), um pulso elétrico que manda a amostra para um tubo (Tof) e um detector;
	O Mald é uma matriz que absorve o lazer, manda energia para amostra que volatiliza e ioniza;
	O Tof é o analisador, um tudo a vácuo que isola a amostra de todos os fatores externos, há separação da amostra de acordo com a massa/carga
	No detector há multiplicação de elétrons e a conversão dessa geração de elétrons para um espectro de massas.
Mald-Tof - seu papel
	A matriz é um ácido orgânico o qual fornece um próton para o processo de ionização da amostra e tem a capacidade de absorver a energia emitida por um laser e promover processo de dessorção;
	A matriz transfere a energia necessária para a ionização, da luz laser para as moléculas da amostra.
Mald-Tof – matriz
	O tipo de ácido orgânico que vai ser utilizado depende doblimiar de energia que precisa ser utilizado para a amostra;
	Peptídeos: 4-Hydroxy-α-cyanocinnamic acid (HCCA);
	Proteínas: 2,5-Dihydroxyacetophenone (DHAP), Sinapinic acid (AS) e 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)
	Glucanas: 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)
	Ácidos nucleicos: 3-Hydroxypicolinic acid (HPA) e 2,4,6-Trihydroxyacetophenone (THAP).
Mald-Tof
	Quantidade de energia necessária para ionizar um determinado composto da amostra (matrizes individuais mostram “limiar de energia” específico);
	Se ultrapassar o limiar pode gerar uma fragmentação e/ou uma análise inadequada;
	Estabilidade de um determinado composto da amostra (demasiado “quente” pode levar a uma fragmentação não desejada dos compostos da amostra).
	Itens necessários
	Amostra a analisar;
	Substância matricial;
	Laser;
	Na amostra pode ter uma colônia de microrganismo e o ácido orgânico
	Preparação MALDI / Análise MS:
	 Misturar a amostra e as soluções de matriz numa proporção adequada;
	 Colocar uma alíquota (em μL) desta mistura sobre a placa alvo;
	Deixe a mistura co-cristalizar;
	Insira a placa alvo na especificação de massa MALDI (Correndo sob alto vácuo);
	Disparar o laser na preparação MALDI para gerar íons (carregados individualmente);
	Recolher, analisar e detectar os íons resultantes.
	TOF-MS: Time of flight – tempo de vôo;
	Os componentes da amostra ionizados e dessorvidos são direcionados por um campo elétrico dentro de um tubo a vácuo, até que atinja o detector;
	Neste tubo a vácuo, os componentes da amostra são separados de acordo com suas m/z, chegando ao detector em diferentes tempos;
	Ionização dos átomos ou moléculas de uma amostra  separação destes átomos ou moléculas em função da sua relação massa/carga  identificação e quantificação.
Mald-Tof – vantagens e desvantagens
	Vantagens
	Baixa concentração do analito;
	Rapidez de análise;
	Alta exatidão;
	Facilidade no preparo da amostra;
	Baixo custo;
	Pode ser aplicada em larga escala;
	Custo de manutenção relativamente baixo;
	Dados gerados são de simples interpretação;
	Alta resolução;
	Análise mais rápida, precisa.
	Desvantagens
	Não compatível com LC/MS;
	Dificuldade de detecção de proteínas de baixo peso molecular;
	Deve ser usado com analisadores compatíveis com métodos pulsados (TOF ou FT-ICR);
	Erros de identificação por MALDI-TOF MS estão associados a um número insuficiente de cepas de referência disponíveis no banco de dados do espectro MALDI-TOF MS;
	Altamente sensível às misturas complexas de peptídeos;
	Dificuldade de análise de microrganismos com parede espessa (como no caso de alguns fungos filamentosos, micobactérias e até mesmo bactérias Gram-positivas);
	Análise é dependente de bancos de dados que são disponíveis somente comercialmente ➔ as entradas atuais são essencialmente de isolados clínicos.