Técnicas de Cultivo Celular

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Técnicas de Cultivo Celular BEATRIZ CÂMARA DE OLIVEIRA TURMA 115 ODONTO
APLICAÇÕES DO CULTIVO CELULAR
CULTIVO CELULAR
Crescimento in vitro de órgãos, tecidos e células
em condições controladas: temperatura definida
(utilizando-se uma incubadora) e meio contendo
nutrientes e fatores de crescimento
Manutenção da organização estrutural nos tecidos sujeitos a variações experimentais
no microambiente (ex: hormônios, drogas, Rx) 
Estudo da morfogênese, diferenciação e função de órgãos removidos cirurgicamente 
Comparação do crescimento e comportamento funcional de órgãos naturais e
produzidos por engenharia tecidual
CULTIVO DE ÓRGÃOS
Tecido conjuntivo: fibroblastos, osteoblastos, mioblastos, etc. 
Tecido epitelial: ceratinócitos, células epiteliais pulmonares, células epiteliais renais, etc 
Células sanguíneas: linfócitos, neutrófilos, etc 
Células tumorais 
Células-tronco
CULTIVO DE CÉLULAS
Diferentes tipos celulares crescem em cultivo: 
1881: Ringer desenvolveu uma solução salina com cloreto de sódio, potássio, cálcio e
magnésio para manter os batimentos cardíacos de um coração isolado fora do corpo 
1885: Roux manteve células de embriões de galinha vivas por vários dias, utilizando
uma solução salina aquecida. 
1907: Harrison cultivou porções de medula espinal de rã em um coágulo de linfa e
observou a manutenção da viabilidade das células nervosas in vitro por várias
semanas. Harrison é considerado por alguns o “pai do cultivo celular”. 
1913: Carrel demonstrou que células podem crescer por longos períodos em cultura,
desde que alimentadas regularmente e cultivas sob condições assépticas.
ALGUNS DADOS HISTÓRICOS
Com a remoção das células do ambiente in
vivo se perde o contato com outros tipos
celulares, hormônios, estruturas de suporte
e diversas outras moléculas. 
É praticamente impossível recriar o
ambiente in vivo. As condições artificiais
podem levar a célula a assumir um padrão
distinto de diferenciação. 
DESVANTAGENS CULTIVO CELULAR
-Genótipo: a característica genética da célula 
-Fenótipo: a aparência e comportamento da
célula como resultado do seu genótipo. 
OBS: mais frequentemente, os cientistas
avaliam alterações fenotípicas nos estudos
realizados com cultivo celular.
Uso de animais em experimentos é reduzido 
As células de uma linhagem são
homogêneas e têm necessidades de
crescimento idênticas 
Modelos in vitro permitem o controle do
ambiente extracelular 
Há a capacidade de monitorar vários
elementos e secreções sem interferência de
outras moléculas biológicas, como acontece
in vivo
VANTAGENS CULTIVO CELULAR
uso do meio de cultivo quimicamente
definido
uso de antibióticos para inibir o crescimento
de microorganismos
uso de tripsina para remover células
aderentes no subcultivo
PRINCIPAIS AVANÇOS NA TECNOLOGIA DO
CULTIVO CELULAR
CLASSIFICAÇÃO DO CULTIVO CELULAR
Obtidas diretamente do
tecido animal, podendo ser
de origem tumoral ou não 
Culturas de tecidos
normais: 
Culturas Primárias: 
-diplóides 
-dependentes de suporte 
-número limitados de divisões
Único tipo celular
expandido 
Linhagens de vida limitada: 
Linhagens contínuas: 
Linhagem Celular:
-diplóides 
-manutenção de características 
-crescimento constante 
-disponibilidade ilimitada 
-poucas características originais
colagenase
dispase
Não faz digestão enzimática > sem “estresse”
das enzimas 
Cultiva pequenas partes do tecido e espera o
crescimento celular nas margens 
Mais demorado para conseguir as células
COMO OBTER CÉLULAS DE UM FRAGMENTO
TECIDUAL?
Digestão Enzimática do Tecido:
Explante Tecidual:
potencial de diferenciação: comparável
rendimento celular: comparável ou
melhor
tempo de duplicação: comparável ou
melhor
taxa de proliferação: comparável ou
melhor
morfologia imunogenicidade: comparável 
atividade imunossupressora: comparável
expressão do marcador de superfície:
comparável ou melhor
Vantagens do Explante em Comparação
com a Digestão Enzimática:
Capela de fluxo laminar 
Incubadora: 37 °C, 5% de CO2 , 99% umidade 
Refrigerator, Freezer e Ultrafreezer (-80 ºC) 
Banho-maria (37 ºC) 
Microscópio invertido 
Centrífuga/microcentrífuga
EQUIPAMENTOS BÁSICOS
-meios líquidos mantidos a 4 °C, enzimas (ex: tripsina)
e componentes do meio (ex: soro) a -20 °C 
São descartáveis 
Poliestireno tratado 
Esterilizados por radiação gama 
Podem ser adicionados proteínas adesivas
(ex: poli-L-lisina) ou substratos específicos
RECIPIENTES PARA CULTIVO CELULAR
A escolha depende do tipo de célula 
Comumente usa-se DMEM, α-MEM, 199, RPMI,
HAM-F12, etc. (MEM: Minimum Essential
Medium) 
O meio deve ser suplementado com
antibióticos (ex: penicilina, estreptomicina, etc) 
Armazenado a 4 °C 
Data de validade 
Estoque: líquido x pó
MEIOS DE CULTIVO
Microorganismos crescem ~10-50 vezes mais
rápido do que células de mamíferos, as quais
levam ~8-16 horas para se dividirem. Os MO são
mais tolerantes a variações na temperatura, pH
and estado nutricional do que as células. 
Células são mais vulneráveis à contaminação
quando há falhas nas técnicas assépticas. Isto
pode levar ao desenvolvimento de MO
resistentes aos antibióticos.
INIMIGOS DO CULTIVO
Enzima utilizada para “soltar” as células da
superfície da placa ou garrafa. 
A tripsina cliva as ligações peptídicas (LYS ou
ARG) na fibronectina da matriz extracelular. 
EDTA como quelante para o Ca++ do meio, que
inibiria a tripsina. 
SUBCULTIVO: TRIPSINA EDTA
Atenção: o contato prolongado com a tripsina
diminui a viabilidade celular
Câmara de Neubauer
CONTAGEM CELULAR
CRIOPROTETORES 
CRIOPRESERVAÇÃO 
(CONSERVAÇÃO DAS CÉLULAS)
Ex: propilenoglicol, glicerol, etilenoglicol,
dimetilssulfóxido (DMSO)